于檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增突變的平衡引物 對(duì)，所述平衡引物對(duì)包括選自下列引物對(duì)中的多對(duì)引物： 如SEQ ID NO:31和32所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 33和34所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:35和36所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:37和38所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:39和40所示的引物對(duì)； 如SEQ ID N0:41和42所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:43和44所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:45和46所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:47和48所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:49和50所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:51和52所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 53和54所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:55和56所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:57和58所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:59和60所示的引物對(duì)； 如SEQ ID N0:61和62所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:63和64所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:65和66所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:67和68所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:69和70所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:71和72所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 73和74所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:75和76所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:77和78所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:79和80所示的引物對(duì)； 如SEQ ID N0:81和82所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:83和84所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:85和86所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:87和88所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:89和90所示的引物對(duì)； 如SEQ ID N0:91和92所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:93和94所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:95和96所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:97和98所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:99和100所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 101和102所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 103和104所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 105和106所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 107和108所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 109和110所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 111和112所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 113和114所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 115和116所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 117和118所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 119和120所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 121和122所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 123和124所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 125和126所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 127和128所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 129和130所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 131和132所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 133和134所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 135和136所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 137和138所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 139和140所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 141和142所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 143和144所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 145和146所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 147和148所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 149和150所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 151和152所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 153和154所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 155和156所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 157和158所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 159和160所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 161和162所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 163和164所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 165和166所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 167和168所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 169和170所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 171和172所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 173和174所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 175和176所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 177和178所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 179和180所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 181和182所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 183和184所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 185和186所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 187和188所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 189和190所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 191和192所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 193和194所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 195和196所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 197和198所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 199和200所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:201和202所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 203和204所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:205和206所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:207和208所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:209和210所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:211和212所示的引物對(duì)； 如SEQ ID N0:213和214所示的引物對(duì)； 如SEQ ID N0:215和216所示的引物對(duì)； 如SEQ ID N0:217和218所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:219和220所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:221和222所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO: 223和224所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:225和226所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:227和228所示的引物對(duì)； 如SEQ ID NO:229和230所示的引物對(duì)。
4. 權(quán)利要求1或2的引物組，由下列⑴任一組的檢測(cè)引物對(duì)組成： ⑴用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子18的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID N0:5和6所 示； 用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子19的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID N0:7和8所示；和 用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子21的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID NO: 13和14所示； (ii) 用于擴(kuò)增BRAF基因的外顯子15的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID N0:3和4所 示； 用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子20的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID N0:9和10所示； 用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子20的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID NO: 11和12所示； 用于擴(kuò)增KRAS基因的外顯子3的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID NO: 15和16所示； 用于擴(kuò)增KRAS基因的外顯子2的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID NO: 17和18所示； 用于擴(kuò)增PIK3CA基因的外顯子9的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID N0:19和20所示； 和 用于擴(kuò)增PIK3CA基因的外顯子20的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID N0:21和22所 示； (iii) 用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子18的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID N0:5和6所 示； 用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子19的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID N0:7和8所示； 用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子21的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID NO: 13和14所示； 和 用于擴(kuò)增HER2基因的外顯子20的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID N0:25和26所示。
5. 權(quán)利要求3的引物組，由下列⑴的檢測(cè)引物對(duì)和（ii)的平衡引物對(duì)組成： (i) 用于擴(kuò)增HER2基因的外顯子19的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID N0:23和24所 示； 用于擴(kuò)增HER2基因的外顯子20的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID N0:25和26所示； 用于擴(kuò)增HER2基因的外顯子21的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID N0:27和28所示； 和 用于擴(kuò)增HER2基因的外顯子21的區(qū)域的引物對(duì)，其序列如SEQ ID N0:29和30所示； (ii) SEQ ID N0:31-230 所示的引物對(duì)。
6. 用于檢測(cè)樣品中一個(gè)或多個(gè)癌癥驅(qū)動(dòng)基因突變的試劑盒，包含權(quán)利要求1-5任一項(xiàng) 的引物組。
7. 權(quán)利要求6的試劑盒，其還包含以下的一種或多種試劑： 用于從所述樣品提取基因組DNA的試劑； 利用所述引物對(duì)進(jìn)行多重PCR反應(yīng)的試劑； 用于處理擴(kuò)增產(chǎn)物以使得擴(kuò)增產(chǎn)物能用于高通量測(cè)序技術(shù)中的試劑；以及 用于對(duì)處理后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序的試劑。 其中，優(yōu)選所述高通量測(cè)序是Ion Torrent測(cè)序。
8. 體外同時(shí)擴(kuò)增樣品中一個(gè)或多個(gè)癌癥驅(qū)動(dòng)基因的一個(gè)或多個(gè)外顯子的多個(gè)區(qū)域的 方法，包括以下步驟： (1) 犾得樣品的基因組DNA ; (2) 利用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的引物組或權(quán)利要求6-7任一項(xiàng)的試劑盒對(duì)所述基因組 DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。
9. 體外非診斷目的檢測(cè)樣品中一個(gè)或多個(gè)癌癥驅(qū)動(dòng)基因突變的方法，包括以下步驟： (1) 犾得樣品的基因組DNA ; (2) 利用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的引物組或權(quán)利要求6-7任一項(xiàng)的試劑盒對(duì)所述基因組 DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增； (3) 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，優(yōu)選Ion Torrent測(cè)序；以及 (4) 分析測(cè)序結(jié)果，確定BRAF、EGFR、KRAS、PIK3CA和/或HER2基因中是否發(fā)生突變。
10. 權(quán)利要求8或9的方法，其中所述多重PCR的反應(yīng)條件為99°C預(yù)熱2min，每個(gè)循環(huán) 99°C變性15s，60°C退火4min，共23個(gè)循環(huán)，最后儲(chǔ)存于KTC備用。
【專利摘要】本發(fā)明基于多重PCR和高通量測(cè)序技術(shù)，提供了用于同時(shí)檢測(cè)樣品中一個(gè)或多個(gè)癌癥驅(qū)動(dòng)基因的兩個(gè)或更多個(gè)外顯子的多個(gè)區(qū)域突變的引物組；包含該引物組的試劑盒；使用所述引物組和/或試劑盒擴(kuò)增所述癌癥驅(qū)動(dòng)基因或檢測(cè)所述癌癥驅(qū)動(dòng)基因的外顯子突變的方法。本發(fā)明的突變檢測(cè)結(jié)果可用于指導(dǎo)癌癥的臨床用藥、輔助診斷或用于某些癌癥的預(yù)后判斷。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104630375
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510085088
【發(fā)明人】唐川寧, 劉志源, 樓峰, 陳思毅
【申請(qǐng)人】北京圣谷同創(chuàng)科技發(fā)展有限公司
【公開(kāi)日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年2月16日