相對應(yīng)的TAL單元即可串聯(lián)克隆，其中右側(cè)靶點(diǎn)序列需反向構(gòu) 建模塊。目前，TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性打斷目標(biāo)基因，因為FokI需形成2聚體 方能發(fā)揮活性，在實際操作中需在目標(biāo)基因中選擇兩處相鄰（間隔14-18堿基）的靶序列 (一般十幾個堿基）分別進(jìn)行TAL識別模塊構(gòu)建。四種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1，工作原理 不意圖見圖2。
[0036] 二、目標(biāo)序列的構(gòu)建
[0037] 本發(fā)明首先通過大量序列分析和篩選工作將豬IkB a基因的第一外顯子序列作 為初步選定的靶點(diǎn)，其序列如下所示：
[0038] 5，-ATGTTCCAGCCCGCAGAGCCCGGCCAGGAGTGGGCCATGGAGGGGCCCCGGGACGCGCTCAAGAAG GAGCGGCTACTGGATGACCGCCACGACAGCGGCCTGGACTCCATGAAGGACGAGGAGTACGAGCAGATGGTGAAGGA GCTGCGCGAGATCCGCCTCGAGCCGCAGGAGGCGCCCCGCGGCGCCGAGCCCTGGAAGCAGCAGCTCACCGAGGACG GAGACTC-3，
[0039] 通過再次的篩選設(shè)計得到用于基因敲除的多肽靶點(diǎn)，如下：
[0040] 5, -TGGATGACCGCCACGACA-3'
[0041] 5, -GAAGGACGAGGAGTACGA-3'
[0042] 三、重組質(zhì)粒TALEN-1L和重組質(zhì)粒TALEN-1R的構(gòu)建
[0043] 根據(jù)選定的靶點(diǎn)，用pTALE-A質(zhì)粒、pTALE-G質(zhì)粒、pTALE-C質(zhì)粒和pTALE-T質(zhì)粒構(gòu) 建重組質(zhì)粒TALE-1L，重組質(zhì)粒TALE-1L識別18個核苷酸（5, -TGGATGACCGCCACGACA-3'）， 重組質(zhì)粒TALE-1L與表達(dá)載體JDS70連接，構(gòu)建過程見圖3(A)。根據(jù)選定的靶點(diǎn)，用 pTALE-A質(zhì)粒、pTALE-G質(zhì)粒、pTALE-C質(zhì)粒和pTALE-T質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒TALE-1R，重組質(zhì) 粒TALE-1R識別18個核苷酸（5' -GAAGGACGAGGAGTACGA-3'），重組質(zhì)粒TALE-1R與表達(dá)載 體JDS71連接，構(gòu)建過程見圖3 (B)。
[0044] 重組質(zhì)粒TALEN-1L和重組質(zhì)粒TALEN-1R利用Kpnl和BamHI-HF進(jìn)行酶切鑒定，跑 膠鑒定結(jié)果顯示在2. lkb左右出現(xiàn)條帶，則可初步判定其為陽性。跑膠結(jié)果見圖4,圖4中， 重組質(zhì)粒TALE-1L和重組質(zhì)粒TALE-1R的條帶均出現(xiàn)在2. lkb左右，重組質(zhì)粒TALE-1L和重 組質(zhì)粒TALE-1R的條帶的預(yù)計條帶也為2. lkb左右，重組質(zhì)粒TALE-1L和重組質(zhì)粒TALE-1R 的檢測結(jié)果均可初步判定其為陽性。
[0045] 重組質(zhì)粒TALE-1L和重組質(zhì)粒TALE-1R統(tǒng)稱重組質(zhì)粒TALE。
[0046] 實施例2通過熒光素酶報告基因法驗證構(gòu)建的質(zhì)粒TALEN活性
[0047] 合成包含豬I k B a基因的第一外顯子的基因片段如下：5'-GACGTCACCGGTAAAGGC GCGCCAAATTAATTAATGGATGACCGCCACGACAGCGGCCTGGACTCCATGAAGGACGAGGAGTACGAGAGCTCAAAG TCGACAAACCTGCAGGAAAACTAGTCCTCACCGCTTGGTTCGAGCTGCTGMCCTTCCAAAGAAMTCATCTTTGTGG GCCACGACTGGGGGGCTTGTCTGGCCTTTCACTACTCCTACGAGCACCAAGACAAGATCAAGGCCATCGTCCATGCT GAGAGTGTCGTGGACGTGATCGAGTCCTGGGACGAGTGGCCTGACATCGAGGAGGATATCGCCCTGATCAAGAGCGA AGAGGGCGAGAAAATGGTGCTTGAGAATAACTTCTTCGTCGAGACCATGCTCCCAAGCAAGATCATGCGGAAACTGG AGCCTGAGGAGTTCGCTGCCTACCTGGAGCCATTCAAGGAGAAGGGCGAGGTTAGACGGCCTACCCTCTCCTGGCCT CGCGAGATCCCTCTCGTTAAGGGAGGCAAGCCCGACGTC-3，
[0048] 2)將合成片段與pSSA載體，均用Aatll進(jìn)行酶切，將酶切后的合成片段與酶切后 的載體骨架進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pSSA-lKBa (報告質(zhì)粒）。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì) 粒pSSA-I k B a進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pSSA載體的Aatll酶切位點(diǎn)之間插入了步驟1)所 示的DNA分子（I k B a片段），構(gòu)成重組質(zhì)粒PSSA-I k B a，由CMV啟動子控制的SSA報告 基因（Firefly Luciferase，中文名稱為螢火蟲熒光素酶）被終止密碼子和靶點(diǎn)片段分割 成左右兩個片段（自上游至下游依次命名為片段甲和片段乙，片段甲的下游和片段乙的上 游為同源臂）。將重組質(zhì)粒pSSA-I k B a導(dǎo)入細(xì)胞后，因為片段甲和片段乙之間具有終止密 碼子和靶點(diǎn)片段組成的間隔區(qū)，只能顯示很弱的Firefly Luciferase熒光信號。將重組質(zhì) 粒pSSA-lKBa導(dǎo)入細(xì)胞后，如果間隔區(qū)的DNA片段被敲除，片段甲和片段乙可以借助同源 臂發(fā)生同源重組并形成有活性的Firefly Luciferase，使得Firefly Luciferase突光信號 顯著增加，工作原理示如圖5所示。
[0049] 構(gòu)建的質(zhì)粒的TALEN活性檢測。分別進(jìn)行如下2組實驗處理（每個實驗處理進(jìn)行 三次重復(fù)實驗，每次重復(fù)實驗設(shè)置3個重復(fù)處理，結(jié)果取三個重復(fù)處理的平均值；轉(zhuǎn)染試劑 均為DNA Feet Transfection ReagentDNA轉(zhuǎn)染試劑，CWBI0、Cat No. CW0860,每個處理中轉(zhuǎn) 染試劑的加入量為6ul，并按照說明書進(jìn)行操作）：第1組，將0. 4ug Reni 11a luciferase 質(zhì)粒（參考對照質(zhì)粒）和2. Oug重組質(zhì)pSSA-I k B a共轉(zhuǎn)染1 X 106293T細(xì)胞；第2組：將 0? 4ug Renilla luciferase 質(zhì)粒（參考對照質(zhì)粒）、2. Oug 重組質(zhì)粒 pSSA-I k B a、4ug 重 組質(zhì)粒TALEN-1L和4ug重組質(zhì)粒TALEN-1R共轉(zhuǎn)染1 X 106293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時后取 各組的細(xì)胞進(jìn)行裂解并檢測熒光素酶的熒光信號（儀器為：Luminomete^DLReady，型號是 TD-20/20)，結(jié)果見下表：
[0050]表 1 :
【主權(quán)項】
1. 一對特異識別IkBa基因的多肽對，由多肽甲和多肽乙組成；所述多肽甲由18個 TAL核酸識別單元組成，每個TAL核酸識別單元中具有兩個雙連氨基酸；所述多肽乙由18 個TAL核酸識別單元組成，每個TAL核酸識別單元中具有兩個雙連氨基酸； 所述多肽甲中的18個雙連氨基酸依次如下：序列表的序列3自N末端第12-13位氨 基酸殘基、第46-47位氨基酸殘基、第80-81位氨基酸殘基、第114-115位氨基酸殘基、第 148-149位氨基酸殘基、第182-183位氨基酸殘基、第216-217位氨基酸殘基、第250-251 位氨基酸殘基、第284-285位氨基酸殘基、第318-319位氨基酸殘基、第352-353位氨基酸 殘基、第386-387位氨基酸殘基、第420-421位氨基酸殘基、第454-455位氨基酸殘基、第 488-489位氨基酸殘基、第522-523位氨基酸殘基、第556-557位氨基酸殘基和第590-591 位氣基酸殘基； 所述多肽乙中的18個雙連氨基酸依次如下：序列表的序列3自N末端第12-13位氨 基酸殘基、第46-47位氨基酸殘基、第80-81位氨基酸殘基、第114-115位氨基酸殘基、第 148-149位氨基酸殘基、第182-183位氨基酸殘基、第216-217位氨基酸殘基、第250-251 位氨基酸殘基、第284-285位氨基酸殘基、第318-319位氨基酸殘基、第352-353位氨基酸 殘基、第386-387位氨基酸殘基、第420-421位氨基酸殘基、第454-455位氨基酸殘基、第 488-489位氨基酸殘基、第522-523位氨基酸殘基、第556-557位氨基酸殘基和第590-591 位氨基酸殘基。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異識別IkB a基因的多肽對，其特征在于：所述多肽甲如 序列表的序列2所示；所述多肽乙如序列表的序列4所示。
3. 編碼權(quán)利要求2所述的多肽對的DNA分子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA分子，其特征在于，由編碼權(quán)利要求1中的所述多肽甲的 DNA分子甲和編碼權(quán)利要求1中的所述多肽乙的DNA分子乙組成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的DNA分子，其特征在于： 所述DNA分子甲中，編碼所述多肽甲的18個雙連氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的 序列2自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第340-345 位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第748-753位 核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第1156-1161 位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷酸、第 1564-1569位核苷酸、第1666-1671位核苷酸和第1768-1773位核苷酸； 所述DNA分子乙中，編碼所述多肽乙的18個雙連氨基酸的核苷酸依次如下：序列表的 序列4自5'末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第340-345 位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第748-753位 核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第1156-1161 位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷酸、第 1564-1569位核苷酸、第1666-1671位核苷酸和第1768-1773位核苷酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子甲如序列表的序列1所 示；所述DNA分子乙如序列表的序列3所示。
7. -對質(zhì)粒，由質(zhì)粒甲和質(zhì)粒乙組成；所述質(zhì)粒甲為具有權(quán)利要求3或4或5或6中 所述的DNA分子甲的質(zhì)粒；所述質(zhì)粒乙為具有權(quán)利要求3或4或5或6中所述的DNA分子 乙的質(zhì)粒。
8. 權(quán)利要求1所述的一對多肽在特異識別I K Ba基因中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求7所述的一對質(zhì)粒在特異切割I(lǐng)kB a基因中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求7所述的一對質(zhì)粒在構(gòu)建IkB a基因突變庫中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一對特異識別IκBα基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用。上述多肽對由多肽甲和多肽乙組成；所述多肽甲由18個TAL核酸識別單元組成，每個TAL核酸識別單元中具有兩個雙連氨基酸；所述多肽乙由18個TAL核酸識別單元組成，每個TAL核酸識別單元中具有兩個雙連氨基酸；所述多肽甲如序列表的序列2所示；所述多肽乙如序列表的序列4所示。本發(fā)明提供的多肽對可以特異識別IκBα基因，通過在豬上對IκBα基因進(jìn)行敲除或改造對研究豬的延緩性排斥反應(yīng)有著重要的意義。
【IPC分類】C12N15-63, C12N15-10, C40B40-08, C12N15-11, C07K14-00
【公開號】CN104628828
【申請?zhí)枴緾N201510046539
【發(fā)明人】李奎, 阮進(jìn)學(xué), 李和剛, 徐奎, 梁波, 楊述林, 牟玉蓮, 周榮, 劉楠, 吳添文, 李林
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年1月29日