一種透明質酸四糖和六糖的分離方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種透明質酸四糖和六糖的分離方法，尤其是一種分離水蛭透明質酸酶水解透明質酸得到的以葡萄糖醛酸為末端的透明質酸四糖和六糖的方法，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002]透明質酸(Hyaluronic acid，簡稱HA)，俗稱玻璃尿酸，是一種由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖為重復雙糖單位，通過β - (I — 4)和β - (I — 3)糖苷鍵交替連接而成的大分子酸性黏性多糖，1934年由Meyer等人從牛玻璃球眼中首次提取獲得，廣泛用于醫(yī)藥、化妝品、食品等領域。研宄表明，透明質酸能與細胞表面受體CD44作用，從而對癌細胞的耐藥性產生影響。由牛睪丸來源的透明質酸酶水解透明質酸產生的透明質酸寡糖可與透明質酸競爭細胞表面CD44受體，從而降低癌細胞的耐藥性。此外，研宄還發(fā)現(xiàn)透明質酸寡糖具有促進血管生成、傷口愈合等重要作用。
[0003]水蛭來源的透明質酸酶的酶解作用方式不同于牛睪丸來源的透明質酸酶，前者水解透明質酸β-α —3)糖苷鍵，生成以葡萄糖醛酸為末端的寡糖系列，而后者水解透明質酸β-α —4)糖苷鍵，生成以氨基葡萄糖為末端的寡糖系列。目前常用的分離由牛睪丸透明質酸酶制備的透明質酸寡糖的方法有HPLC、離子交換法、體積排阻法等，而由于HPLC和體積排阻法不能用于大量制備，適用于工業(yè)化制備寡糖的方法只有離子交換法，常用的離子交換劑有DEAE和DOWEX 1X2。但這些方法并不適用于分離水蛭來源的透明質酸酶水解透明質酸得到的產物。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種透明質酸四糖和六糖的分離方法，尤其是一種分離由水蛭透明質酸酶制備的以葡萄糖醛酸為末端的透明質酸四糖和六糖的方法。
[0005]所述方法主要包括以下內容:選用Q瓊脂糖凝膠FF (Q Sepharose Fast Flow，QFF)填充的離子交換柱，高徑比為3:1?6.25:1，平衡溶液(A液)選用pH 8?9、50mM以內的Tris-HCl緩沖溶液，平衡柱子時，平衡溶液流速為2?6ml/min ;洗脫溶液(B液)為相應pH的IM NaCl溶液，采用線性梯度洗脫策略，洗脫體積為5?20倍的柱體積，NaCl濃度梯度為0.000M-0.125M NaCl ;根據(jù)出峰的順序收集樣品，將洗脫收集到的樣品濃縮后分別采用Superdex Peptidel0/300GL脫鹽，即得透明質酸四糖和六糖。
[0006]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法主要包括以下步驟:(I)以2?6ml/min的速度用5個柱體積的平衡溶液平衡Q FF離子交換柱；(2)用lml/min流速上樣至樣品穿透點為5% ; (3)用平衡溶液清洗離子交換柱5個柱體積，流速2?6ml/min ； (4)采用線性梯度洗脫策略，洗脫體積為5?20倍的柱體積，NaCl濃度梯度為0.000M-0.125M NaCl，流速為2?6ml/min，收集所得到的產物峰；(5)濃縮產物，再通過Superdex Peptide 10/300GL凝膠柱進行脫鹽，即可得到四糖和六糖。
[0007]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述Q FF離子交換柱為HiPrep 16/10Q FF離子交換柱。
[0008]在本發(fā)明的一種實施方式中，平衡溶液選用pH 8、1mM Tris-HCl緩沖溶液。
[0009]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法主要包括以下步驟:(I)以5ml/min的速度用5個柱體積的平衡溶液平衡HiPrep 16/10Q FF離子交換柱；(2)用lml/min流速上樣至樣品穿透點為5% ; (3)用平衡溶液清洗離子交換柱5個柱體積，流速5ml/min ; (4)采用線性梯度洗脫策略，洗脫體積為5?20倍的柱體積，NaCl濃度梯度為0.000M-0.125M NaCl，流速為5ml/min，收集所得到的產物峰；(5)濃縮產物，再通過Superdex Peptide 10/300GL凝膠柱進行脫鹽，即可得到四糖和六糖。
[0010]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述樣品是水蛭透明質酸酶水解透明質酸的產物。
[0011]透明質酸寡糖的聚合度越高，所需的洗脫離子強度越高，而透明質酸二糖在低濃度、高PH下不能交換于離子交換劑上，因此本發(fā)明適用于從含透明質酸寡糖四糖和六糖的酶解液中分離出四糖和六糖。通過本發(fā)明方法，首次分離出由水蛭透明質酸酶制備的透明質酸寡糖，分離效率、純度高，具有較好的回收率(四糖回收率為93.85 %，六糖回收率為90.61 %)，檢測限低，可用于大量制備透明質酸寡糖。
【附圖說明】
[0012]圖1制備的透明質酸寡糖(保留時間8.636min為二糖，10.884min為四糖，
13.608min 為六糖)
[0013]圖2Q FF分離后的四糖(保留時間為10.804)
[0014]圖3Q FF分離后的六糖(保留時間為13.715min)
【具體實施方式】
[0015]Q FF離子交換劑來自浙江爭光實業(yè)股份有限公司，離子交換柱來自錦州市新科水處理設備廠。透明質酸酶是從水蛭中提取的或由基因工程菌重組表達水蛭透明質酸酶基因得到的。
[0016]寡糖混合液、四糖液和六糖液的液相色譜檢測方法:色譜柱:YMC_Pack PolyamineII (250mmX 4.6mm);流動相:10mM磷酸二氫錢:乙腈(90:10);流速0.5ml/min，檢測波長210nmo
[0017]實施例1以葡萄糖醛酸為末端的透明質酸寡糖的制備
[0018]于含有去離子水98ml的38°C酶反應器中，加入Ig透明質酸，38°C保溫15min后，加入酶活為80萬U/ml的水蛭透明質酸酶液2ml，反應進行32h后，沸水浴加熱1min。8000轉離心15min后棄沉淀取上清。如圖1所示，上清液為含有透明質酸二糖、四糖和六糖的混合液。保留時間為8.636的樣品為透明質酸二糖，保留時間為10.884的樣品為透明質酸四糖，保留時間為13.608的樣品為透明質酸六糖。
[0019]實施例2透明質酸四糖和六糖的分離及純度檢測
[0020]配制A液(平衡溶液):pH 8、1mM Tris-HCl緩沖液，B液(洗脫溶液):由A液配制的0.125M的NaCl緩沖溶液，通過以下條件進行透明質酸四糖和六糖的分離。
[0021](I)以5ml/min的速度用5個柱體積的A液平衡HiPr印16/10Q FF離子交換柱(高徑3:1)。
[0022](2)用lml/min流速上樣(實施例1制備的含有透明質酸四糖和六糖的混合液)至樣品穿透點為5%。
[0023](3)用A液洗去樣品，洗脫5個柱體積，流速5ml/min。
[0024](4)用A液和B液進行線性洗脫，使洗脫液中NaCl濃度為0.000M-0.125M，洗脫體積為15個柱體積，流速為5ml/min，依次收集所得到的峰，由于糖酸聚合度越低，交換能力越弱，二糖不能交換與色譜柱上，根據(jù)出峰的離子強度強弱可以判斷，先出峰的為四糖、緊接出峰的為六糖。
[0025](5)濃縮得到的峰，再通過Superdex Peptide 10/300GL凝膠柱或500?1000透析袋進行脫鹽后凍干，即可得到四糖和六糖。
[0026](6)將分離純化的四糖和六糖通過HPLC法檢測，如圖2和圖3可見四糖和六糖得到了很好的分離，六糖中含有微量的四糖。
[0027](7)取凍干后的四糖和六糖，用咔唑硫酸法測定透明質酸寡糖的純度，測定結果四糖純度為64.86 %，六糖純度為58.31 %。
[0028]實施例3透明質酸四糖和六糖回收率
[0029]取實例2中分離出的四糖和六糖各0.1OOOg,混合后溶于500 μ L，按照實施例2中操作，上樣量為500 μ L，分離得到脫鹽后的透明質酸寡糖，凍干后測定寡糖重量，其中四糖
0.9385g、六糖0.9061go四糖回收率為93.85%，六糖回收率為90.61%。
[0030]實施例4透明質酸分離下限
[0031]取實施例1中酶解液，取500 μ L，按照實施例2中操作，上樣量為500 μ L，最后制得四糖132.46mg、六糖89.60mg，分離效果如實施例2，四糖純度62.89%，六糖純度55.34%。因此，該分離方法可分離還原糖量(以葡萄糖醛酸計)0.027mg?離子交換劑5%穿透點的樣品。
[0032]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1.一種透明質酸四糖和六糖的分離方法，其特征在于，選用Q瓊脂糖凝膠FF填充的離子交換柱，高徑比為3:1?6.25:1，平衡溶液為pH 8?9、50mM以內的Tris-HCl緩沖溶液，平衡柱子時，平衡溶液流速為2?6ml/min ;洗脫溶液為相應pH的IM NaCl溶液，采用線性梯度洗脫策略，洗脫體積為5?20倍的柱體積，NaCl濃度梯度為0.000M-0.125M NaCl ;將洗脫收集到的樣品濃縮后分別采用Superdex Peptide 10/300GL脫鹽，即得透明質酸四糖和六糖。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步驟:(I)以2?6ml/min的速度用5個柱體積的平衡溶液平衡Q FF離子交換柱；(2)用lml/min流速上樣至樣品穿透點為5% ； (3)用平衡溶液清洗離子交換柱5個柱體積，流速2?6ml/min ； (4)采用線性梯度洗脫策略，洗脫體積為5?20倍的柱體積，NaCl濃度梯度為0.000M-0.125MNaCl，流速為2?6ml/min，收集所得到的產物峰；(5)濃縮產物，再通過Superdex Peptide10/300GL凝膠柱進行脫鹽，即可得到四糖和六糖。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述QFF填充的離子交換柱為HiPrepl6/10Q FF離子交換柱。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，平衡溶液選用pH8、1mM Tris-HCl緩沖溶液。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步驟:⑴以5ml/min的速度用5個柱體積的平衡溶液平衡HiPr印16/10Q FF離子交換柱；(2)用lml/min流速上樣至樣品穿透點為5%; (3)用平衡溶液清洗離子交換柱5個柱體積，流速5ml/min ;(4)采用線性梯度洗脫策略，洗脫體積為5?20倍的柱體積，NaCl濃度梯度為0.000M-0.125MNaCl，流速為5ml/min，收集所得到的產物峰；(5)濃縮產物，再通過Superdex Peptide10/300GL凝膠柱進行脫鹽，即可得到四糖和六糖。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，待分離樣品是水蛭透明質酸酶水解透明質酸的產物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種透明質酸四糖和六糖的分離方法，屬于生物工程技術領域。本發(fā)明采用Q Sepharose fast flow為離子交換劑，pH8～9Tris-HCl為平衡液，pH80.125M的NaCl線性梯度洗脫，可將透明質酸四糖和六糖進行分離，脫鹽后即得透明質酸四糖和六糖純品。
【IPC分類】C07H1-06, C07H7-033, C08B37-08
【公開號】CN104610467
【申請?zhí)枴緾N201510042090
【發(fā)明人】王淼, 呂夢嫻, 郝文幸
【申請人】江南大學
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年1月27日