專利名稱：透明質酸的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用微生物制備透明質酸的方法。
背景技術：
透明質酸除作為化妝品的保濕劑外，還在眼科、整形外科、皮膚科等領域中作為藥 品來使用。透明質酸能夠用來自動物組織例如雞的雞冠、牛眼的玻璃體等的提取物進行制 備，但由于混入作為夾雜物的硫酸軟骨素等或者因組織內(nèi)所含有的透明質酸酶等而易于被 低分子量化，因此有人提出了通過培養(yǎng)具有透明質酸生產(chǎn)能力的微生物，由培養(yǎng)液制備透 明質酸的方法(發(fā)酵法)(專利文獻1)。與提取法相比，由發(fā)酵法制備的透明質酸是通過一 定的原料、一定的方法進行制備的，因此，能夠保持一定的產(chǎn)品品質，因而在產(chǎn)業(yè)上的利用 價值較大。而且，以工業(yè)透明質酸的生產(chǎn)為目的，有人開發(fā)出了使用了用于發(fā)酵法的含有各 種培養(yǎng)基成分的培養(yǎng)基的發(fā)酵法(專利文獻2-4)。專利文獻2中記載了 使用對8種氨基 酸進行了增量的培養(yǎng)基的發(fā)酵法，其中，上述8種氨基酸是作為透明質酸生產(chǎn)中的有效成 分，是繁殖所必須的氨基酸。此外，專利文獻3中記載了 使用對精氨酸和/或谷氨酸進行 了增量的培養(yǎng)基的發(fā)酵法。此外，專利文獻4中記載了 使用對精氨酸進行了增量的培養(yǎng)基 的發(fā)酵法。專利文獻1 日本特公平4-12960號公報專利文獻2 日本特開平7-46992號公報專利文獻3 日本特開昭62-289198號公報專利文獻4 日本特開昭63-141594號公報

發(fā)明內(nèi)容
但是，就現(xiàn)有的適合培養(yǎng)法的大多數(shù)培養(yǎng)基而言，其成分數(shù)較多，培養(yǎng)基配制繁 雜，且從培養(yǎng)基分離和純化透明質酸也較復雜等，因而作為工業(yè)生產(chǎn)方法期望進一步改善。 此外，關于其他的現(xiàn)有技術方法，作為工業(yè)生產(chǎn)方法也期望進一步改善。本發(fā)明鑒于上述情況而完成，其目的在于提供以高收率簡單地制備透明質酸的方 法。此外，其目的還在于提供在短時間內(nèi)制備透明質酸的方法。本發(fā)明人為解決上述目的而進行了專心研究，結果發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的特定時期，將精 氨酸和谷氨酰胺組合并添加到培養(yǎng)液中，由此改善透明質酸的生產(chǎn)，從而完成了本發(fā)明。即，根據(jù)本發(fā)明，提供包括如下工序的透明質酸的制備方法培養(yǎng)具有透明質酸生 產(chǎn)能力的微生物；以及在該微生物的對數(shù)增殖期后期，在培養(yǎng)液中添加谷氨酰胺和精氨酸。 根據(jù)該制備方法，在培養(yǎng)的特定時期將精氨酸和谷氨酰胺組合并添加到培養(yǎng)液中，能夠在 短時間內(nèi)以高收率簡單地制備透明質酸。根據(jù)本發(fā)明的透明質酸的制備方法，通過在培養(yǎng)具有透明質酸生產(chǎn)能力的微生物 的特定時期將精氨酸和谷氨酰胺組合并添加到培養(yǎng)液中，能夠在短時間內(nèi)以高收率簡單地制備透明質酸。


圖1是在培養(yǎng)用于生產(chǎn)透明質酸的微生物時的、培養(yǎng)液中的氨基酸濃度的曲線 圖。圖2是將一并添加了精氨酸的情況和后添加精氨酸的情況進行比較的曲線圖，左 側的曲線圖表示菌體濃度的隨時間變化，右側的曲線圖表示粘度(透明質酸濃度的指標) 的隨時間變化。
具體實施例方式術語說明本說明書中的“對數(shù)增殖期后期”是指微生物充分增殖后的狀態(tài)，具體指對數(shù)增殖 期的后半期至靜止期(穩(wěn)定期)。另外，“對數(shù)增殖期”是指在微生物的培養(yǎng)過程中，微生物 每隔一定時間通過分裂進行增殖時細胞數(shù)的對數(shù)與時間呈線性關系的時期。對數(shù)增殖期的 后期可由本領域技術人員采用已知的、任意的指標或方法進行判斷。本發(fā)明并不簡單地限 于此，例如，也可以濁度或比增殖速度為指標進行判斷。本說明書中的“濁度”是通過培養(yǎng)液的渾濁情況(培養(yǎng)液中的菌體量)測定微生 物增殖的、最普通簡便且快速的測定方法。對培養(yǎng)液進行光照射并測定透射光由于散射及 吸收而被阻抑的情況。用于生產(chǎn)透明質酸的微生物是微粒子，因此，微生物的量與培養(yǎng)液的 濁度間存在正比關系。例如，濁度可進行如下測定。向培養(yǎng)液入射波長為660nm的單波長的光，通過分光光度計測定透射光。這里，將 入射光和透射光的強度分別設為Ic^ I，將透射層的厚度設為L，將吸光度設為τ，并將通過 下式求出的吸光度定義為培養(yǎng)液的濁度(OD)。[公式1]I = I0Exp (- τ L)另外，當培養(yǎng)前的培養(yǎng)基本身具有無法忽視的濁度時，可以從培養(yǎng)液的濁度減去 對照培養(yǎng)基的濁度。作為本說明書中的對數(shù)增殖期后期，采用培養(yǎng)液的濁度在660nm光波長條件下顯 示為0.5以上的時期。另外，作為上述對數(shù)增殖期，優(yōu)選濁度顯示為1.0以上的時期，更優(yōu) 選濁度顯示為2. 0以上的時期，進一步優(yōu)選濁度顯示為3. 0以上的時期。本說明書中的“比增殖速度”是指通過下式所定義的值。[公式2]
比增速度(Η")=菌體的世if時間(h)這里，菌體的世代時間是指生產(chǎn)透明質酸的微生物增殖為二倍所需要的時間。若 生產(chǎn)透明質酸的微生物充分增殖，則由營養(yǎng)耗竭、代謝物的蓄積導致增殖速度下降，比增殖 速度也降低。作為本說明書中的對數(shù)增殖期后期，采用比增殖速度顯示為0. ^T1以下的時期。另外，作為上述對數(shù)增殖期，優(yōu)選比增殖速度顯示為0. 41Γ1以下的時期，更優(yōu)選比增殖速度 顯示為0. ^r1以下的時期，進一步優(yōu)選比增殖速度顯示為0. ar1以下的時期，更進一步優(yōu)選 比增殖速度顯示為0. Ih-1以下的時期。另外，比增殖速度當然大于Oh—1。本說明書中的“鏈球菌屬細菌”包括能夠生產(chǎn)透明質酸的鏈球菌(Mi^ptococcus) 屬的任意的細菌或其突變株，例如，可以列舉但不限于馬鏈球菌(Sti^ptococcus equi)、 獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)、似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、 停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)、化胺性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)以 及它們的突變株等。關于本說明書中的“谷氨酰胺” “精氨酸” “透明質酸”等化學物質的定義，如果沒 有特別說明，在不損害發(fā)明目的的范圍內(nèi)，還包括可使用的任意的鹽(例如，可列舉但不限 于鈉鹽、鉀鹽等金屬鹽；鹽酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽等酸加合物等)、水合物、以及它們的混 合物。此外，關于本說明書中的各數(shù)值范圍，分別包括由“ ”所示的上限值和下限值。實施方式以下，對本發(fā)明的實施方式進行說明。本發(fā)明的某一實施方式為透明質酸的制備方法，其包括如下工序培養(yǎng)具有透明 質酸生產(chǎn)能力的微生物；以及在該微生物的對數(shù)增殖期后期，在培養(yǎng)液中添加谷氨酰胺和 精氨酸。根據(jù)該制備方法，通過在培養(yǎng)后期一并添加精氨酸和谷氨酰胺，能夠抑制高濃度精 氨酸的環(huán)境對微生物繁殖的阻礙作用，并能夠在短時間內(nèi)以高收率制備透明質酸。此外，在 本實施方式中，在培養(yǎng)開始后添加谷氨酰胺及精氨酸，由此，可使用普通的培養(yǎng)基而無需特 別準備制備工藝繁雜的培養(yǎng)基。而且，由于不添加不必要的營養(yǎng)成分，因此可減輕透明質酸 分離、純化工序的負擔，能夠保持穩(wěn)定的品質和生產(chǎn)性。作為用于上述實施方式的培養(yǎng)方法，可以采用通常使用的培養(yǎng)方法。即，可在培養(yǎng) 基中優(yōu)選使用例如含有葡萄糖、果糖、半乳糖及蔗糖等糖成分的碳源，磷酸二氫鉀、磷酸氫 二鉀、硝酸鎂、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉及磷酸銨等無機鹽類，多聚蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵 母膏、玉米漿及大豆水解液等有機營養(yǎng)源，并根據(jù)需要使用各種維生素類等。培養(yǎng)可以使用 例如有氧的培養(yǎng)方法等已知的方法來進行，所述有氧的培養(yǎng)方法例如通氣攪拌培養(yǎng)等。培 養(yǎng)溫度優(yōu)選為30°C 35°C，但并不限于此。培養(yǎng)液的pH隨微生物的繁殖而降低，因此，例 如，可通過添加氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨等PH調(diào)節(jié)劑將pH控制在7. 0 9. 0。谷氨酰胺和精氨酸可以同時添加，也可以分別添加，還可以在不損害本發(fā)明的目 的的范圍內(nèi)同時添加緩沖劑、鹽等其它成分，但考慮到之后的分離、純化工序等，優(yōu)選需要 純化的成分越少越好，例如除谷氨酰胺、精氨酸以外的營養(yǎng)成分或活性成分為0. 001%以 下，進一步優(yōu)選為0. 0005%以下或不含有。此外，本發(fā)明的另一實施方式為上述的制備方法，其中，上述對數(shù)增殖期后期是培 養(yǎng)液的濁度在660nm波長條件下顯示為0. 5以上的時期。在濁度達到0. 5以上的時期添加 谷氨酰胺和精氨酸，由此，能夠更加可靠地提高透明質酸的收率。而且，優(yōu)選在上述濁度顯 示為2. 0以上的時期添加谷氨酰胺和透明質酸。在顯示上述濁度的時期添加谷氨酰胺和精 氨酸，由此能夠以更高的收率得到透明質酸，其中，上述濁度是微生物充分增殖狀態(tài)下的濁 度。進一步優(yōu)選在上述濁度顯示為3. 0以上的時期添加谷氨酰胺和精氨酸，由此能夠可靠
5地提高收率、縮短時間。此外，關于濁度，可以直接使用培養(yǎng)液的濁度，但在培養(yǎng)前的培養(yǎng)基等對照培養(yǎng)基 的濁度大到無法忽視的情況下(例如，可以列舉但不限于0. 01或0. 05以上)，也可以將從 培養(yǎng)液的濁度減去對照培養(yǎng)基的濁度而得到的濁度作為指標。作為對照培養(yǎng)基，可以使用 培養(yǎng)前的培養(yǎng)基，也可以使用沒有接種微生物的培養(yǎng)液。另外，基于上述濁度的添加時期的定義是根據(jù)某一指標對時期范圍所進行的具體 例示，因而在上述條件下測定濁度的工序不一定是必須的。因此可知，理所當然，即使假設 在測定600nm波長條件下的濁度并進行判斷的情況下，上述實施方式仍包括660nm波長條 件下的濁度在上述實施方式的范圍內(nèi)的情況。此外，本發(fā)明的另一實施方式為上述的制備方法，其中，上述對數(shù)增殖期后期是比 增殖速度顯示為0. Sh-1以下的時期。通過在比增殖速度達到ο. Sh-1以下的時期添加谷氨 酰胺和精氨酸，能夠更加可靠地提高透明質酸的收率。而且，優(yōu)選在上述比增殖速度顯示為 Ojh-1以下的時期添加谷氨酰胺和精氨酸。在顯示上述比增殖速度的時期添加谷氨酰胺和 精氨酸，由此能夠以更高的收率得到透明質酸，其中，上述比增殖速度是微生物充分增殖狀 態(tài)下的比增殖速度。進一步優(yōu)選在上述濁度顯示為0. 31Γ1以下的時期添加谷氨酰胺和精氨 酸，由此能夠可靠地提高收率、縮短時間。另外，基于上述比增殖速度的添加時期的定義是根據(jù)某一指標對時期范圍所進行 的具體例示，在上述條件下測定比增殖速度的工序不一定是必須的。此外，本發(fā)明的另一實施方式為上述制備方法，其中，上述具有透明質酸生產(chǎn)能力 的微生物是鏈球菌屬細菌。通過使用具有透明質酸生產(chǎn)能力的、通常所使用的鏈球菌屬細 菌，能夠簡單且可靠地在工業(yè)上制備透明質酸。這里所使用的鏈球菌屬細菌包括從自然界 分離的鏈球菌屬細菌以及其突變株。而且，作為上述實施方式中的鏈球菌屬細菌，可以優(yōu)選使用馬鏈球菌、馬鏈球菌突 變株FM-100 (微工研條寄第9027號)或馬鏈球菌突變株FM-300 (微工研條寄第2319號)。 通過使用這些以高收率穩(wěn)定地生產(chǎn)透明質酸的菌株，能夠以更高的收率、穩(wěn)定的生產(chǎn)性制 備透明質酸。此外，上述實施方式中的谷氨酰胺的添加量在不損害本發(fā)明目的的范圍內(nèi)不受特 別限定，但如果過量添加則效果的改善減小，因此谷氨酰胺優(yōu)選為0.01-0.3%，更優(yōu)選為 0. 05%以上、0. 1 %以上、和/或0. 2%以下。通過使用該濃度范圍的谷氨酰胺，能夠更加可 靠地起到提高收量及穩(wěn)定化生產(chǎn)的效果。此外，通過使用上述上限值以下的谷氨酰胺，能夠 減輕之后的分離、純化工序的負擔。此外，上述實施方式中的精氨酸的添加量在不損害本發(fā)明目的的范圍內(nèi)不受特 別限定，但如果過量添加則效果的改善減小，因此精氨酸優(yōu)選為0.01-0.2%，更優(yōu)選為 0. 05%以上、0. 1 %以上、和/或0. 1 %以下。通過使用該濃度范圍的精氨酸，能夠更加可靠 地起到提高收量及穩(wěn)定化生產(chǎn)的效果。此外，通過使用上述上限值以下的精氨酸，能夠減輕 之后的分離、純化工序的負擔，并且還能夠進一步強力防止由精氨酸引起的繁殖阻礙作用。另外，通過上述實施方式說明的制備方法等并不對本發(fā)明進行限定，是為進行例 示而公開的內(nèi)容。本發(fā)明的技術范圍由權利要求書所記載的范圍決定，本領域技術人員可 在權利要求書所記載的發(fā)明的技術范圍內(nèi)進行各種設計上的變更。
例如，上述制備方法還可以包括其他的工序，或者在上述制備方法之后實施其他 的工序或方法。作為這樣的工序或方法，例如，可以列舉利用活性炭或過濾等的除菌工序、 中和工序、結晶化工序、利用色譜或離心分離等除去或純化內(nèi)毒素、蛋白質、核酸、金屬等雜 質等的工序等。
實施例以下，通過實施例對本發(fā)明進行進一步說明，本發(fā)明并不限于下述實施例。首先，本發(fā)明所涉及的預實驗的概要如下所示。這些預實驗例采用與后述的實施 例1類似的培養(yǎng)條件，并在相同的預實驗內(nèi)條件一致地進行研究。此外，在各實驗的曲線圖 等中，將透明質酸記為“HA”，將谷氨酰胺記為“Gln”，將精氨酸記為“Arg”，將培養(yǎng)開始時預 先在培養(yǎng)基中加入某種成分的情況記為“一并添加”，將培養(yǎng)開始后(特別是對數(shù)增殖期后 期)在培養(yǎng)液中添加某種成分的情況記為“后添加”。此外，在部分實驗例等中，以透明質酸 相關的粘度作為指標來對透明質酸的生產(chǎn)量進行評價。[預實驗1]對現(xiàn)有標準條件下的用于生產(chǎn)透明質酸的微生物的培養(yǎng)中各種氨基酸的濃度變 化進行研究。將結果的曲線圖示于圖1。各種氨基酸隨著培養(yǎng)時間的推移，根據(jù)種類的不同 而顯示出減少、固定、增加中的任一種變化情況，特別是觀察到谷氨酰胺和精氨酸的量大幅 減少，在標準的培養(yǎng)條件下，觀察到它們被耗盡。[預試驗2]基于預試驗1的結果，考慮添加谷氨酰胺和精氨酸的情況，并進行了進一步的研 究。精氨酸在該菌體內(nèi)的機制不明，有報道稱單一成分對透明質酸收量的提高沒有幫助，并 導致繁殖阻礙。因此，關于上述問題，考慮通過改良精氨酸的添加方法來進一步改善，并進 行了研究。其結果是，如圖2的曲線圖所示，培養(yǎng)時沒有一并添加精氨酸而是進行后添加，由 此，發(fā)現(xiàn)透明質酸的濃度(曲線圖中，透明質酸濃度通過粘度進行評價)大幅提高。該精氨 酸的實驗結果可總結于下表。[表 1]
添力口方法菌體增殖粘度菌體量培養(yǎng)時間一并添力口高慢低后添力口高無變化高[預實驗3]基于由以上的實驗結果所得到的認識，在標準條件下，進行了后添加谷氨酰胺和 精氨酸來培養(yǎng)用于生產(chǎn)透明質酸的微生物的實驗。將該實驗結果示于以下的表2。[表 2]通過Gln和Arg的組合大幅提高透明質酸(HA)收量
權利要求
1.一種透明質酸的制備方法，其包括如下工序培養(yǎng)具有透明質酸生產(chǎn)能力的微生 物；以及在該微生物的對數(shù)增殖期后期，在培養(yǎng)液中添加谷氨酰胺和精氨酸。
2.如權利要求1所述的制備方法，其中，所述對數(shù)增殖期后期是培養(yǎng)液的濁度在660nm 波長條件下顯示為0. 5以上的時期。
3.如權利要求1所述的制備方法，其中，所述對數(shù)增殖期后期是培養(yǎng)液的濁度在660nm 波長條件下顯示為2. 0以上的時期。
4.如權利要求1所述的制備方法，其中，所述對數(shù)增殖期后期是比增殖速度顯示為 0.證-1以下的時期。
5.如權利要求1 4中任一項所述的透明質酸的制備方法，其中，所述具有透明質酸生 產(chǎn)能力的微生物是鏈球菌屬細菌。
6.如權利要求5所述的透明質酸的制備方法，其中，所述鏈球菌屬細菌為馬鏈球菌、馬 鏈球菌突變株FM-100 (微工研條寄第9027號)或馬鏈球菌突變株FM-300 (微工研條寄第 2319 號)。
7.如權利要求1 6中任一項所述的透明質酸的制備方法，其中，所述谷氨酰胺的濃度 為 0. 01 0. 3%o
8.如權利要求1 7中任一項所述的透明質酸的制備方法，其中，所述精氨酸的濃度為 0. 01 0. 2%。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供以高收率簡單地制備透明質酸的方法。此外，其目的還在于提供在短時間內(nèi)制備透明質酸的方法。根據(jù)本發(fā)明，提供透明質酸的制備方法，其包括如下工序培養(yǎng)具有透明質酸生產(chǎn)能力的微生物；以及在該微生物的對數(shù)增殖期后期，在培養(yǎng)液中添加谷氨酰胺和精氨酸。
文檔編號C08B37/00GK102124120SQ20088013042
公開日2011年7月13日 申請日期2008年7月25日 優(yōu)先權日2008年7月25日
發(fā)明者架間晃明, 橋本正道, 池見昌久, 藤井健治 申請人:電氣化學工業(yè)株式會社