一種通過酶催化反應(yīng)合成水飛薊賓的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種通過酶催化反應(yīng)合成水飛薊賓的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 水飛薊素（Silymarin)是從菊科植物水飛薊（Silybum marianum Linn. Gaertn) 中提取出的一種黃酮類化合物，具有多種臨床功效，已被多國藥典收錄。水飛薊賓（Silybin 或Silibinin)是水飛薊素的4種異構(gòu)體中含量最高，活性最好的1種，由一分子黃杉素 (Taxifolin)和一分子松柏醇（Coniferyl alcohol)通過氧化偶合而成。
[0003] 目前，人們獲取水飛薊賓的主要手段是從水飛薊種子中提取。然而，該提取工藝復(fù) 雜，成本較高；水飛薊的生長收到季節(jié)和環(huán)境的影響，且占用耕地；提取過程中使用有機(jī)溶 劑等，產(chǎn)品的安全性受到威脅。近年來，有人通過金屬離子（Ag 2O等）催化的方法，以松柏 醇和黃杉素為底物合成了水飛薊賓的4種同分異構(gòu)體。然而，該合成過程依然是在有機(jī)溶 劑中進(jìn)行的，且反應(yīng)時(shí)間較長（96h)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的問題是提供一種通過酶催化反應(yīng)合成水飛薊賓的方法，以過氧化 物酶作為催化劑，以黃杉素、松柏醇作為底物，只需要簡單地控制反應(yīng)體系的pH、溫度等條 件，即可實(shí)現(xiàn)水飛薊賓的合成，是一種安全高效的方法。
[0005] 所述的過氧化物酶為一類含有血紅素的酶類，以過氧化氫為電子受體來催化底物 氧化，能夠氧化多種有機(jī)和無機(jī)化合物。
[0006] 所述的底物為松柏醇和黃杉素，二者的氧化偶合需要過氧化氫作為電子受體。
[0007] 反應(yīng)體系的pH為適合酶催化反應(yīng)的pH，通過添加 pH緩沖對(duì)控制。
[0008] 反應(yīng)體系的溫度為適合酶催化反應(yīng)的溫度。
[0009] 反應(yīng)介質(zhì)為水溶液。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，反應(yīng)介質(zhì)是磷酸鹽緩沖液，以ΚΗ2Ρ04/Κ 2ΗΡ04緩沖對(duì) 控制pH。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，反應(yīng)產(chǎn)物為水飛薊賓的4種同分異構(gòu)體（水飛薊賓 A、異水飛薊賓A、水飛薊賓B和異水飛薊賓B)。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，松柏醇、黃杉素、H2O2的摩爾比為2:1:1。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以pH7. 0的磷酸緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，松柏醇濃度為 0. 09mM/mL，松柏醇、黃杉素、H2O2的摩爾比為2:1: 1，酶的用量為5U/mL，在25°C條件下反應(yīng)。 該反應(yīng)在25°C條件下進(jìn)行5min，水飛薊賓的最大產(chǎn)量達(dá)到18. 52mg/L，相對(duì)于黃杉素和H2O2 的轉(zhuǎn)化率均為85. 31%。
[0014] 本發(fā)明的一種實(shí)施方式，是以磷酸鹽緩沖液作為反應(yīng)介質(zhì)，向反應(yīng)體系中添加足 量過氧化氫，反應(yīng)底物為松柏醇和黃杉素。水飛薊賓的最大產(chǎn)量達(dá)到18. 52mg/L，為理論最 大產(chǎn)量（21. 71mg/L)的 85. 31 %。
[0015] 本發(fā)明的有益之處：本發(fā)明創(chuàng)建了一種使用酶催化合成水飛薊賓的方法。在傳統(tǒng) 的金屬離子催化水飛薊賓合成反應(yīng)中，1分子黃杉素和2分子松柏醇在含有4分子Ag 2O的 乙酸乙酯中反應(yīng)96小時(shí)，可以得到4種水飛薊賓的同分異構(gòu)體，其轉(zhuǎn)化率為52%，反應(yīng)在 75°C條件下進(jìn)行。本發(fā)明所述反應(yīng)在水相介質(zhì)中進(jìn)行，避免了有機(jī)溶劑的使用，既簡化了產(chǎn) 物分離純化的成本，同時(shí)提高了安全性。該酶促反應(yīng)迅速，當(dāng)反應(yīng)體系中存在足量過氧化氫 時(shí)，在5min之內(nèi)即可生成18. 52mg/L水飛薊賓（4種水飛薊賓同分異構(gòu)體的總和，下同），達(dá) 到理論最大產(chǎn)量的85. 31%。該反應(yīng)條件要求簡單，只需要對(duì)反應(yīng)溫度和pH進(jìn)行簡單控制 即可，且反應(yīng)溫度接近常溫，pH為中性。
【附圖說明】
[0016] 圖1陰離子模式下水飛薊賓的質(zhì)譜圖。其中，481. 1140m/z為在陰離子模式下，水 飛薊賓脫氫的同位素峰之一。
[0017] 圖2預(yù)測(cè)和實(shí)測(cè)的水飛薊賓同位素峰。其中，A為C25H220 1Q[M-H]_:預(yù)測(cè)481. 1140m/ z ;B 為實(shí)測(cè) 481. 1140m/z。
[0018] 圖3過氧化氫存在條件下，過氧化物酶催化松柏醇和黃杉素合成水飛薊賓反應(yīng)體 系的色譜圖。其中，8、9、10、11分別為水飛薊賓的4種同分異構(gòu)體。
[0019] 圖4過氧化氫不足條件下水飛薊賓的催化合成。其中，折線圖表示水飛薊賓的產(chǎn) 量；柱狀圖表示水飛薊賓相對(duì)于黃杉素的轉(zhuǎn)化率。
[0020] 圖5足量過氧化氫條件下水飛薊賓的催化合成。其中，折線圖表示水飛薊賓的產(chǎn) 量；柱狀圖表示水飛薊賓相對(duì)于黃杉素的轉(zhuǎn)化率。
[0021] 圖6過氧化氫存在條件下，過氧化物酶催化松柏醇和黃杉素合成水飛薊賓可能的 反應(yīng)機(jī)理。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 材料與方法
[0023] 松柏醇、黃杉素和水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)，辣根過氧 化物酶（horseradish peroxidase, HRP)和30%的雙氧水購自生工生物工程（上海）有限 公司。松柏醇、黃杉素和水飛薊賓溶于甲醇（Sigma-Aldrich，HPLC grade)，配制成lg/L的 標(biāo)準(zhǔn)品。
[0024] 0· IM 磷酸鉀緩沖液（PP Buffer, ρΗ7· 0):將 0· 53g KH2POjP I. 06g K2HPO4 在超純 水中溶解，檢查pH為7. 0,以超純水定容至100mL。將緩沖液于冰上保存，使用前于25°C平 衡。
[0025] 準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的松柏醇和黃杉素，分別以PP Buffer (pH7. 0)溶解并定容至 I. 2mM和 0· 6mM ;以PP Buffer(pH7. 0)將 30%雙氧水定容至 122. 3mM。以PP Buffer(pH7. 0) 將辣根過氧化物酶溶解為30000U/mL。松柏醇、黃杉素和雙氧水溶液于4°C避光保存，過氧 化物酶溶液于_20°C避光保存，使用前在冰上溶解。反應(yīng)在黑暗條件下、25°C金屬浴中進(jìn)行， 反應(yīng)結(jié)束后立即加入一定體積的甲醇終止酶反應(yīng)，并置于冰上、避光，直到進(jìn)樣分析。
[0026] 產(chǎn)物水飛薊賓的鑒定使用SHIMADZU UPLC-MS-IT-T0F進(jìn)行：
[0027] (1)樣品經(jīng)0. 22 ym水系濾膜過濾后，以自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)UPLC-MS-IT-T0F進(jìn)行分析， 進(jìn)樣體積10 μ L。
[0028] (2)流動(dòng)相A :0.1 % (v/v)甲酸，流動(dòng)相B :100%甲醇；洗脫梯度（以流動(dòng)相B 的百分比表示）：〇min 30%、30.00min 55%、35.00min 55%、40min 30%;總流速 0.2mL/ min ;紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長288nm ;柱溫箱溫度40°C ;質(zhì)譜設(shè)置為陰離子模式，采集范圍 100_700m/z，離子富集時(shí)間10. 00msec，重復(fù)次數(shù)3,檢測(cè)器電壓：相對(duì)于調(diào)諧電壓。
[0029] (3)分別準(zhǔn)確配制2. 5、5. 0、10、20、40、80、100mg/L的水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品的 分析方法與樣品的分析方法相同。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)提取離子流（m/z = 482. 1140)的峰面積作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以陰離子模式下，樣品提取粒子流（m/z = 482. 1140)的峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中水飛薊賓的濃度。
[0030] 實(shí)施例1過氧化物酶催化水飛薊賓合成的驗(yàn)證
[0031] 為了驗(yàn)證過氧化物酶催化松柏醇和黃杉素合成水飛薊賓的能力，以松柏醇和黃杉 素作為底物，在H 2O2存在的條件下，由辣根過氧化物酶（HRP)催化水飛薊賓的合成。分別驗(yàn) 證了省卻底物、H 2O2或酶時(shí)，水飛薊賓的產(chǎn)生情況，如表1。
[0032] 水飛薊賓的合成反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)式如圖6所示，理論上，每合成1分子水飛薊賓需 要1分子的H 2O2參與反應(yīng)，松柏醇與黃杉素的摩爾比為2:1時(shí)，為水飛薊賓合成的最優(yōu)底物 比例。鑒于水飛薊賓同時(shí)又會(huì)被反應(yīng)體系中的H 2O2所降解，因此，我們首先在過氧化氫不足 (摩爾數(shù)約為黃杉素的45. 3% )、且松柏醇：黃杉素的摩爾比為2:1的條件下進(jìn)行反應(yīng)，反 應(yīng)體系如表1所示。在此情況下，反應(yīng)體系中的H2O 2為限制性的底物。但是在計(jì)算底物的 轉(zhuǎn)化率時(shí)，依然以黃杉素作為參考。
[0033] 準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的松柏醇和黃杉素，分別以PP Buffer (pH7. 0)溶解并定容至 I. 2mM和 0· 6mM ;以PP Buffer(pH7. 0)將 30%雙氧水定容至 122. 3mM。以PP Buffer(pH7. 0) 將辣根過氧化物酶溶解為30000U/mL。松柏醇、黃杉素和雙氧水溶液于4°C保存，過氧化物 酶溶液于_20°C保存，使用前在冰上溶解。反應(yīng)在25°C避光條件下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為45min。 反應(yīng)結(jié)束后立即加入98 μ L甲醇以終止酶反應(yīng)，并置于冰上、避光，直到進(jìn)樣分析。所有反 應(yīng)均進(jìn)行3次，取平均值。
[0034] 表1過氧化物酶催化水飛薊賓合成的驗(yàn)證
[0035]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種通過酶催化反應(yīng)合成水飛薊賓的方法，其特征在于，以過氧化物酶作為催化劑， 以黃杉素、松柏醇作為底物，以過氧化氫為電子受體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述過氧化物酶為一類含有血紅素的酶 類，以過氧化氫為電子受體來催化底物氧化，能夠氧化多種有機(jī)和無機(jī)化合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，反應(yīng)體系的pH為適合酶催化反應(yīng)的pH。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，反應(yīng)體系的pH通過添加 pH緩沖對(duì)控制。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，反應(yīng)體系的溫度為適合酶催化反應(yīng)的溫 度。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，反應(yīng)介質(zhì)為水溶液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的方法，其特征在于，反應(yīng)介質(zhì)是磷酸鹽緩沖液，以KH2PO4/ K2HPO4緩沖對(duì)控制pH。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，松柏醇、黃杉素、H2O2的摩爾比為2:1:1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的方法，其特征在于，以pH7. 0的磷酸緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)， 松柏醇濃度為0. 09mM/mL，松柏醇、黃杉素、H2O2的摩爾比為2:1: 1，酶的用量為5U/mL，在 25°C條件下反應(yīng)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種通過酶催化反應(yīng)合成水飛薊賓的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。發(fā)明在過氧化氫存在的條件下，以過氧化物酶催化松柏醇和黃杉素合成了水飛薊賓的4種同分異構(gòu)體。該反應(yīng)在水相中進(jìn)行，避免了有機(jī)溶劑的使用；反應(yīng)的效率較高，在5min內(nèi)即可生成18.52mg/L水飛薊賓，轉(zhuǎn)化率為85.31％。該方法是一種安全且高效的合成水飛薊賓合成方法。
【IPC分類】C12P17-16
【公開號(hào)】CN104561177
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510042186
【發(fā)明人】周景文, 陳堅(jiān), 呂永坤, 堵國成
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月27日