突變的核酸和表達(dá)載體以及酵母菌株及其制備方法與用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種突變的核酸與表達(dá)載體和制備高抗逆性酵母菌株的方法以及酵 母菌株及其制備方法與用途，具體地，涉及一種突變的核酸、插入有該核酸的表達(dá)載體、利 用該表達(dá)載體制備高抗逆性酵母菌株的方法、高抗逆性酵母菌株、制備高抗逆性酵母菌株 的方法以及高抗逆性酵母菌株在生產(chǎn)乙醇中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于傳統(tǒng)化石能源用量急增，能源緊缺已成為世界性問題，能源多元化發(fā)展和加 快可再生能源開發(fā)已成為世界各國(guó)的研發(fā)重點(diǎn)，其中，燃料乙醇的生產(chǎn)和應(yīng)用在經(jīng)濟(jì)發(fā)展 和戰(zhàn)略安全上顯示出重大意義。以燃料乙醇等替代能源為代表的能源供應(yīng)多元化戰(zhàn)略已成 為我國(guó)能源政策的重要方向。木質(zhì)纖維素是十分豐富而廉價(jià)的生物質(zhì)原料，可以被降解為 可發(fā)酵性糖，用于燃料乙醇的生產(chǎn)。大力發(fā)展生物質(zhì)燃料乙醇作為可再生能源，有助于緩解 石油資源短缺，改善大氣環(huán)境等問題，在穩(wěn)定糧食生產(chǎn)、促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與消費(fèi)的良性循環(huán)和 可持續(xù)發(fā)展等方面具有積極作用。
[0003] 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)作為單細(xì)胞真核生物，具有易培養(yǎng)、生長(zhǎng) 周期短的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于異源基因的表達(dá)。雖然普通釀酒酵母能夠高效利用葡萄糖產(chǎn) 乙醇，但對(duì)發(fā)酵液中的抑制物和高濃乙醇耐受性（Almeida J R M et al.，2007)較差，特別 是對(duì)纖維素水解液中的抑制成分敏感，使釀酒酵母無法成為木質(zhì)纖維素乙醇生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)菌 株；其次，纖維素乙醇生產(chǎn)中，纖維素原料預(yù)處理過程產(chǎn)生和殘留的降解物會(huì)對(duì)后續(xù)菌株發(fā) 酵造成不同程度的抑制，其中，乙酸、糠醛、酚類和SO廣等抑制因子對(duì)酵母有較強(qiáng)毒害作用， 會(huì)顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)及其發(fā)酵性能。
[0004] 目前，在纖維素乙醇生產(chǎn)菌種一釀酒酵母的研究領(lǐng)域，大多集中于將各種實(shí)驗(yàn) 室缺陷型菌種為研究對(duì)象進(jìn)行改造，而缺乏能夠應(yīng)用于生產(chǎn)的野生型酵母模型，能夠耐受 多重抑制物、具有高抗逆性的釀酒酵母具有更強(qiáng)的實(shí)用性，顯然，研究獲得具有上述特性的 酵母模型極為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠使酵母菌株穩(wěn)定發(fā)酵產(chǎn)乙 醇、耐受多重抑制物而具有高抗逆性的突變的核酸、插入有該核酸的表達(dá)載體和利用該表 達(dá)載體制備高抗逆性酵母菌株的方法、高抗逆性酵母菌株、制備高抗逆性酵母菌株的方法 以及高抗逆性酵母菌株在生產(chǎn)乙醇中的用途。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種突變的核酸，其中，該突變的核 酸的序列如SEQ ID NO: 1所示，或者，該突變的核酸的序列由5'端連接有Kozak序列的SEQ ID NO: 1 組成。
[0007] 第二方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其中，該表達(dá)載體插入有上述本發(fā)明的突 變的核酸。
[0008] 第三方面，本發(fā)明提供了一種制備高抗逆性酵母菌株的方法，其中，該方法包括： 使用上述本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞。
[0009] 第四方面，本發(fā)明提供了 一種酵母菌株，該酵母菌株為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的菌株，所述酵母菌株的保藏號(hào)為CGMCC No. 8203。
[0010] 第五方面，本發(fā)明提供了第四方面的酵母菌株在生產(chǎn)乙醇中的用途。
[0011] 第六方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)乙醇的方法，該方法包括：用第四方面的酵母菌 株對(duì)乙醇發(fā)酵原液進(jìn)行乙醇發(fā)酵。
[0012] 通過上述技術(shù)方案，利用本發(fā)明突變的核酸構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母后，能夠獲 得具有高抗逆性和多重脅迫耐受性的酵母菌株，該酵母菌株的遺傳性能穩(wěn)定，在乙醇生產(chǎn) 中的糖利用率和乙醇產(chǎn)量均較高，可應(yīng)用于目前的燃料乙醇生產(chǎn)工藝和木質(zhì)纖維素乙醇新 工藝中，實(shí)用性較強(qiáng)。
[0013] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。
[0014] 生物保藏
[0015] 本發(fā)明的酵母菌株-釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)于2013年9月 24日被保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（縮寫為CGMCC，地址：北京 市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101)，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 8203。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0017] 在本發(fā)明中，在未作相反說明的情況下，使用的術(shù)語(yǔ)"抗逆性"是指微生物在偏離 其最佳生長(zhǎng)條件下的環(huán)境中的生長(zhǎng)和發(fā)酵能力，比如較高或較低的溫度，較高或較低的pH， 較高或較低的滲透壓，較高的反饋抑制，有毒物質(zhì)的存在等環(huán)境。
[0018] 本發(fā)明提供了一種突變的核酸，該突變的核酸的序列如SEQ ID NO: 1所示，或者， 該突變的核酸的序列由5'端連接有Kozak序列的SEQ ID NO: 1組成。
[0019] atgtccggaaaagcctctacagagggtagcgttactacggagtttctctctgatatcattggtaagaca gtgaacgtcaaacttgcctcgggtttactctacagcggaagattggaatccattgatggttttatgaatgttgcact atcgagtgccactgaacactacgagagtaataacaataagcttctaaataagttcaatagtgatgtctttttgaggg gcacgcaggtcatgtatatcagtgaacaaaaaatatag(SEQ ID NO:I)
[0020] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述突變的核酸的序列由5'端連接有Kozak序列的 SEQ ID NO: 1 組成。
[0021] 其中，Kozak序列是指用來增強(qiáng)真核基因翻譯效率，避免核糖體出現(xiàn)漏洞掃描 (leaky scan)的序列。各種常規(guī)的Kozak序列都可以用于本發(fā)明。
[0022] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述突變的核酸的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0023] gccaccatgtccggaaaagcctctacagagggtagcgttactacggagtttctctctgatatcattggt aagacagtgaacgtcaaacttgcctcgggtttactctacagcggaagattggaatccattgatggttttatgaatgt tgcactatcgagtgccactgaacactacgagagtaataacaataagcttctaaataagttcaatagtgatgtctttt tgaggggcacgcaggtcatgtatatcagtgaacaaaaaatatag(SEQ ID NO :2)
[0024] 本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體插入有序列如上所述的突變的核酸。 其中，所述表達(dá)載體可以為插入有本發(fā)明的突變的核酸并能夠使突變的核酸表達(dá)的任何表 達(dá)載體，例如，質(zhì)粒或噬菌體。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明，所述表達(dá)載體中的啟動(dòng)子可以為組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為 了進(jìn)一步增強(qiáng)表達(dá)效率，優(yōu)選地，所述表達(dá)載體中的啟動(dòng)子為Padhl啟動(dòng)子、Ppgk啟動(dòng)子或 Pfbp啟動(dòng)子。更優(yōu)選地，所述表達(dá)載體中的啟動(dòng)子為Padhl啟動(dòng)子。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明，對(duì)所述表達(dá)載體中的終止子沒有特別的限定，且本領(lǐng)域技術(shù)人員能 夠很容易地選擇適當(dāng)?shù)慕K止子來構(gòu)建能夠表達(dá)本發(fā)明突變的核酸的表達(dá)載體。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述表達(dá)載體為在質(zhì)粒PAUR123的BamHI酶切 位點(diǎn)和XhoI酶切位點(diǎn)之間插入序列如上所述的突變的核酸而得到的表達(dá)載體。將本發(fā)明 優(yōu)選實(shí)施方式中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母細(xì)胞中時(shí)能夠獲得更高的表達(dá)效率，從而能夠 更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0028] 此外，本發(fā)明還提供了一種制備高抗逆性酵母菌株的方法，該方法包括：使用本發(fā) 明的上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞。
[0029] 本發(fā)明中，可以采用本領(lǐng)域常用的各種轉(zhuǎn)化手段來使用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞， 例如，電穿孔法或化學(xué)法。優(yōu)選地，采用電穿孔法來轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。電穿孔法的具體操作為 本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，在此不再贅述。
[0030] 本發(fā)明中，對(duì)使用的酵母細(xì)胞沒有特別的要求，可以為野生型的各種酵母細(xì)胞，也 可以為缺陷型酵母細(xì)胞。優(yōu)選地，使用野生型酵母細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明，為了獲得轉(zhuǎn)入有本發(fā)明的表達(dá)載體的酵母菌株的純培養(yǎng)物，制備高 抗逆性酵母菌株的方法優(yōu)選還包括：將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞在脅迫培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以去 除抗逆性低的酵母細(xì)胞。
[0032] 其中，所述脅迫培養(yǎng)基指能夠篩選轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的表達(dá)載體的酵母細(xì)胞的培養(yǎng) 基，一般指添加了脅迫因子的培養(yǎng)基，所述脅迫因子可以為乙酸、Na 2S04、NaCl、KC1、NH4Ac、 K