雄烯二酮耐底物突變株及其誘變選育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用硫酸二乙酯和紫外線(xiàn)復(fù)合誘變新金分枝桿菌，并結(jié)合梯度平板法 初篩技術(shù)和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩技術(shù)，選育出耐底物且能有效降解植物留醇側(cè)鏈獲取雄烯二酮的 新金分枝桿菌WS3dcoAacteritt? ，屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 雄烯二酮（AD)作為合成留體類(lèi)激素藥物的重要原料和關(guān)鍵中間體，是當(dāng)前國(guó)家急 需解決的激素藥物的重要原料，對(duì)機(jī)體起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，被譽(yù)為"生命的鑰匙"。幾 乎所有留體激素類(lèi)藥物都是以雄烯二酮為起始原料進(jìn)行生產(chǎn)的，如：性激素、蛋白質(zhì)同化激 素、孕激素、皮質(zhì)激素及地塞米松、可的松等，具有重要的商業(yè)價(jià)值。
[0003] 分枝桿菌、節(jié)桿菌及棒桿菌等很多微生物都能以植物留醇作為碳源產(chǎn)生雄烯二酮 等代謝中間體。通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)雄烯二酮可以充分利用長(zhǎng)期以來(lái)被用作廢物的植物 甾醇，擺脫了原材料來(lái)源因"黃姜"和"穿地龍"供應(yīng)受季節(jié)、地域等自然因素對(duì)生產(chǎn)的制約， 同時(shí)對(duì)保護(hù)自然資源和生態(tài)環(huán)境起到了很好的作用。但微生物對(duì)植物留醇的轉(zhuǎn)化過(guò)程仍然 存在很多限制因素：留體化合物疏水性強(qiáng)，在水中的溶解度低；菌株轉(zhuǎn)化能力普遍較低，高 濃度底物投加量對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的抑制等。因此提高菌株的轉(zhuǎn)化能力，改善菌種對(duì)底物的耐受 性進(jìn)而提高投料濃度等都是留體生物轉(zhuǎn)化中要解決的關(guān)鍵問(wèn)題 為了提高微生物對(duì)植物留醇的轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)物產(chǎn)量，紫外、DES等物理和化學(xué)等誘變 及高濃度底物馴化培養(yǎng)法常被用來(lái)選育優(yōu)良菌株。吳寶華等用紫外線(xiàn)照射和NTG復(fù)合誘 變的方法處理節(jié)桿菌，經(jīng)篩選獲得一株株ADD分解酶缺陷型菌株，能有效積累ADD，該菌對(duì) 豆甾醇的降解率達(dá)到95%。楊英等分別采用紫外線(xiàn)照射、6°Co、紫外線(xiàn)與6°Co復(fù)合誘變處 理出發(fā)菌株價(jià)co知cteriw?sp.BD696,篩選得到一高轉(zhuǎn)化率突變株，其AD產(chǎn)量較出發(fā)菌 株提高39. 2%，且沒(méi)有結(jié)構(gòu)類(lèi)似物ADD產(chǎn)生。黃麗君等以一株降解植物留醇產(chǎn)生雄烯二酮 的分枝桿菌為研宄對(duì)象，先后利用亞硝基胍（NTG)和N+注入技術(shù)對(duì)其進(jìn)行誘變處理，最終 選育出一株高產(chǎn)突變株5/7.N-2,其雄稀二酮生產(chǎn)能力較出發(fā)菌株提高了 37. 8%。Vidal等在含有14g/L13-谷留醇的培養(yǎng)基中反復(fù)培養(yǎng)分枝桿菌 sp.MB-3683和B-11045 (這兩株菌均能以谷留醇作唯一碳源)， 連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)7次后，兩株菌對(duì)谷甾醇的轉(zhuǎn)化率分別提高了 44%和21%。MalaviyaA等將 5/7.在谷留醇濃度不斷提高的液體培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)來(lái)提高分枝桿菌對(duì)谷 甾醇的耐受性，結(jié)果顯示在谷留醇濃度為20g/L的轉(zhuǎn)化體系中，馴化培養(yǎng)的 s/7菌株的整體轉(zhuǎn)化率達(dá)到23. 8%，高于原始菌株的17. 31%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種雄烯二酮耐底物突變株及其誘變選育方法， 該方法能夠提高菌種對(duì)底物植物留醇的耐受性，增加整個(gè)轉(zhuǎn)化體系中的底物投料濃度，為 微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)雄烯二酮提供優(yōu)良菌種一新金分枝桿菌WS3。
[0005] 本發(fā)明所述的菌株新金分枝桿菌WS3,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào) 為CCTCC NO. M 2014322,保藏日期為2014年7月4日，拉丁文學(xué)名為#尺〇如cteriws 腫WS3。搖瓶發(fā)酵其雄稀二酮生成率達(dá)40. 9%，是野生菌株的1. 59倍，保藏地址是中 國(guó)武漢大學(xué)。
[0006] 所述的新金分枝桿菌有以下微生物學(xué)特征： 1.形態(tài)學(xué)上特征為： a.細(xì)胞形態(tài)呈細(xì)長(zhǎng)略彎曲的桿狀，有時(shí)有分枝或出現(xiàn)絲狀體，具有膨大或棒狀末端；b.大小為6?10ym;c.菌落光滑、飽滿(mǎn)、中間隆起、邊緣不整齊、不透明，菌落呈橙黃色。
[0007] 2.該菌株的生理生化特征為： a.本菌株可以利用合成培養(yǎng)基生長(zhǎng)；b.培養(yǎng)時(shí)間：4~7天；c.對(duì)氧氣的需求：好氣；d.生長(zhǎng)pH范圍：6. 0?8. 5;e.生長(zhǎng)最適宜溫度：28?32°C;f.轉(zhuǎn)化的主要產(chǎn)物為雄烯 二酮。
[0008] 本發(fā)明還提供新金分枝桿菌WS3的選育方法，即利用硫酸二乙酯和紫外線(xiàn)誘變方 法進(jìn)行復(fù)合誘變、結(jié)合梯度平板法初篩以及搖瓶發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩和驗(yàn)證、選育出一株產(chǎn)雄烯 二酮耐底物且遺傳穩(wěn)定的突變菌株。
[0009] 本發(fā)明所述選育方法包括如下步驟： ① 菌懸液的制備： 取斜面上培養(yǎng)4~7天的新金分枝桿菌出發(fā)菌株，用pH7. 0的無(wú)菌磷酸緩沖液配制菌懸 液，經(jīng)1〇~15倍系列稀釋達(dá)到濃度100~1000cfu/mL備用； ② 硫酸二乙酯和紫外線(xiàn)復(fù)合誘變； ③ 初篩：通過(guò)梯度平板法對(duì)耐底物突變株進(jìn)行初篩； ④ 復(fù)篩：挑取生長(zhǎng)較好的菌落在梯度板上連續(xù)傳代幾次轉(zhuǎn)接斜面，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù) 篩； ⑤ 驗(yàn)證高產(chǎn)菌株： 將復(fù)篩后得到的耐底物菌株傳代培養(yǎng)5次，每次都用與復(fù)篩一樣的方法對(duì)菌株雄烯二 酮生產(chǎn)穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證； ⑥ 尚廣菌株的保減： 將篩選出的一株雄烯二酮耐底物突變菌株采用甘油管法和冷凍真空干燥法進(jìn)行保藏。
[0010] 本發(fā)明所述方法的具體步驟為： I取培養(yǎng)4~6天的新鮮斜面一只，用20mL0.ImoL/LpH7. 0的磷酸鹽緩沖液將斜面菌 種洗下，倒入裝有數(shù)粒玻璃珠的150mL已滅菌三角瓶中，充分振蕩20min后，用塞有脫脂棉 的無(wú)菌漏斗過(guò)濾，制得菌懸液，將菌懸液進(jìn)行稀釋?zhuān)瑵舛瓤刂圃趌〇〇-l〇〇〇cfu/mL; I用DES溶液誘變處理I中培養(yǎng)的新金分枝桿菌出發(fā)菌株10~40分鐘后，加入 0. 5mL25%硫代硫酸納終止劑，5~30分鐘后將培養(yǎng)液置于無(wú)菌培養(yǎng)皿進(jìn)行紫外照射誘變； f取0.lmL經(jīng)=步驟處理的培養(yǎng)液稀釋至一定濃度，取0.lmL分別涂布到基本培養(yǎng) 基平板及添加留醇濃度為29^4%的梯度培養(yǎng)基平板上，黑暗培養(yǎng)6~24小時(shí)，然后置于恒溫 培養(yǎng)箱中30 ~32°C避光培養(yǎng)4 - 7天； €;將步驟+f中培養(yǎng)出的菌落挑出，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)5~7天，控制相同的培養(yǎng)條 件，收集發(fā)酵液； I用高效液相色譜法分析經(jīng)+1步驟培養(yǎng)的發(fā)酵液中的雄烯二酮含量，并挑出雄烯二 酮含量高的菌株進(jìn)行復(fù)篩； 曹將初篩中挑選出來(lái)的菌株，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)5~7天，控制相同的培養(yǎng)條件， 收集發(fā)酵液，計(jì)算雄烯二酮生成率，挑選出雄烯二酮高產(chǎn)菌株； +2將復(fù)篩后得到的高產(chǎn)菌株擴(kuò)大培養(yǎng)5~7次，每次采用f+的方法對(duì)菌株的穩(wěn)定性進(jìn) 行驗(yàn)證，篩選得到高產(chǎn)、穩(wěn)定的突變菌株。
[0011] 本發(fā)明DES和紫外線(xiàn)復(fù)合誘變處理的出發(fā)菌株培養(yǎng)物處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
[0012] 本發(fā)明所述梯度平板中底物植物留醇的濃度為2%~4% ;化學(xué)誘變劑DES的誘變濃 度為1%。
[0013] 本發(fā)明紫外照射誘變采用15W或30W紫外燈，提前預(yù)熱20~30分鐘后，將菌液置于 距離紫外燈20~30cm處進(jìn)行紫外照射30~240秒。
[0014]本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為改良后的合成培養(yǎng)基（％):玉米漿2~5,NaN03 0.3~0.6，葡萄糖0.1~0.5，（順4)2冊(cè)04 0 . 06，豆油16，植物甾醇2，泡敵0.01，口116.0-8.5。
[0015] 本發(fā)明所述誘變后菌株WS3的搖瓶培養(yǎng)條件為溫度28?32° C、搖床轉(zhuǎn)速200? 300轉(zhuǎn)/分鐘。
[0016] 本發(fā)明利用新金分枝桿菌對(duì)化學(xué)和物理誘變劑比較敏感，生命力比較頑強(qiáng)，有較 強(qiáng)的植物留醇轉(zhuǎn)化潛力，提出了利用DES和紫外線(xiàn)復(fù)合誘變手段，結(jié)合梯度平板法初篩技 術(shù)和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩技術(shù)，選育出植物耐受性高且遺傳穩(wěn)定的新金分枝桿菌WS3,通過(guò)這種方 法可以有效的提高新金分枝桿菌降解植物留醇的能力，為利用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)雄烯二酮 提供了優(yōu)良菌種。突變菌株新金分枝桿菌WS3可用于雄烯二酮的生產(chǎn)。
[0017]
【附圖說(shuō)明】： 圖1為本發(fā)明方法流程圖； 圖2所示為出發(fā)菌株JXNU02的AD濃度與AD生成率圖； 圖3所示為突變株新金分枝桿菌WS3的AD濃度與AD生成率圖；
【具體實(shí)施方式】： 以下結(jié)合實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0018] 實(shí)施例1 : 新金分枝桿菌的硫酸二乙酯和紫外線(xiàn)復(fù)合誘變： I分別配制〇?lm〇L/L的K2HP04溶液（甲液）和0?lm〇L/L的KH2P04溶液（乙液），取 甲液61. 5mL，乙液38. 5mL混合，得到pH7.0的磷酸鹽緩沖液100mL。
[0019] f用10mL0.ImoL/LpH7. 0的磷酸緩沖液將培養(yǎng)6天的新金分枝桿菌JXNU02斜 面菌苔洗下，倒入裝有無(wú)菌玻璃珠的三角瓶中，充分振蕩l〇min，用塞有脫脂棉的無(wú)菌漏斗 過(guò)濾，得到菌懸液，經(jīng)10倍系列稀釋達(dá)到濃度為l〇〇-l〇〇〇cfu/mL備用。
[0020]f分別吸取2mL于5個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)，并加入18mLImoL/LPH7.0磷酸緩沖液。取上 述四個(gè)錐形瓶，各加硫酸二乙酯0. 2mL，最終配成3%的誘變?nèi)芤骸?br>[0021] J.誘變混合液放在振蕩儀中分別振蕩處理l〇min，20min，30min，40min，使菌與 誘