專利名稱:一種鯉皰疹病毒2型lamp檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
一種鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明屬于魚類病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)試劑盒，還涉及一種利用鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鯉皰疹病毒2型的方法。
背景技術(shù)：
[0002]在我國的鯽魚主養(yǎng)區(qū)，2009年零星發(fā)生鯽魚病毒性出血病，發(fā)病情況出現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，死亡率高，目前尚未有有效的控制措施，初步研究表明其病原為鯉皰疹病毒II型 (Cyprinid herpesvirus II，CyHV-2),初步命名該病為鯽造血器官壞死癥(Crucian Carp Hematopoietic Necrosis)。2011年在匈牙利養(yǎng)殖的銀鯽也發(fā)現(xiàn)了 CyHV-2感染的病例。[0003]CyHV-2在幾種魚類細(xì)胞系中的增殖均不能超過4代，需要盡快建立快速、敏感、特異、適宜現(xiàn)場(chǎng)診斷的方法，為疾病的診斷與防控提供技術(shù)手段，也為鯽魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)保障。[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技術(shù)是 Notomi等于2000年報(bào)道的一種新型等溫核酸擴(kuò)增方法(國際專利公開號(hào)W000/28082)，針對(duì)靶基因的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)4條LAMP引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA 聚合酶)，在恒溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地?cái)U(kuò)增靶序列，適合于現(xiàn)場(chǎng)和實(shí)驗(yàn)條件較簡單的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快捷檢測(cè)。引入一對(duì)環(huán)狀引物的改進(jìn)方法，進(jìn)一步縮短了反應(yīng)時(shí)間。
發(fā)明內(nèi)容
[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是在于提供了一種鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)試劑盒，根據(jù) GenBank公布的CyHV-2毒株的解旋酶基因編碼區(qū)序列(KC245087)，應(yīng)用PrimerExplorer V4 (http://primerexplorer. jp/elamp4. 0. 0/index, html)在線軟件設(shè)計(jì)特異性引物，利用LAMP技術(shù)擴(kuò)增靶基因的特定區(qū)域，從分子水平對(duì)鯉皰疹病毒2型進(jìn)行快速檢測(cè)，具有簡便、快速、高特異性和靈敏性的特點(diǎn)。[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種利用鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鯉皰疹病毒2型的方法，本方法僅需一個(gè)水浴鍋或金屬浴即可在2小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)確檢測(cè)出樣品中的CyHV-2，能檢測(cè)CyHV-2感染的病魚組織，能檢測(cè)CyHV-2感染的細(xì)胞(例如Ko1-Fin 細(xì)胞)，非常適用于CyHV-2的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案[0008]一種鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)試劑盒，包括以下成分[0009]該試劑盒包括以下成分10XThermoPolReaction Buffer ；Bst DNA 聚合酶 (NEB) ；dNTPs ;外引物 F3 和 B3、內(nèi)引物 FIP 和 BIP、Betaine (Sigma), MgCl2,1000XSYBR Green I (Invitrogen)0[0010]F3 :5， -TTGGATCTGAACGCTTCGG-3，；[0011]B3 :5 ’ -CGTTGGTCTGTATGGGAGC-3，；[0012]FIP :5’ -GCGATGTAAGCCC TGTGAGACTTTTTACGAGACGTGGTTCCTAGC-3’ ；[0013]BIP :5’ -AACGCACGAGTGCGAGTCTCTTTTGCTGTGGATCGTCCATCC-3’。[0014]一種利用鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鯉皰疹病毒2型的方法，其步驟是[0015]1、病毒DNA的獲取[0016]采用DNAzoiH式劑或Viral DNA Kit試劑盒等提取樣本總DNA模板，DNA在95°C 5 分鐘后迅速置于冰浴中的預(yù)處理可以增加檢測(cè)的靈敏度。[0017]2、LAMP 擴(kuò)增[0018]采用25 μ I反應(yīng)體系，包括內(nèi)引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和Β3 各 O.1 μ M，dNTPslmM, BetaineO. 5M, MgCl22-10mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1， 10XThermoPol Reaction Buffer2. 5 μ I,去離子水補(bǔ)足余量。選擇55_65°C的溫度范圍和 30-120分鐘的時(shí)間范圍進(jìn)行LAMP反應(yīng)之后，80°C滅活2分鐘。[0019]3、檢測(cè)結(jié)果判定，可用下述三種方法之一進(jìn)行結(jié)果的判定[0020]I)發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，從dNTPs析出的焦磷酸根離子和反應(yīng)液中的鎂離子形成白色焦磷酸鎂沉淀，通過肉眼判斷檢測(cè)管出現(xiàn)明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性。[0021]2)每 25 μ I 體系的反應(yīng)管加 1000X SYBR Green I (Invitrogen) 1-2 μ I, l-5min 觀察結(jié)果，反應(yīng)液變綠為陽性，保持橙色為陰性。[0022]3)取擴(kuò)增產(chǎn)物，用2% (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示LAMP特征性梯狀條帶，則結(jié)果為陽性；如無任何條帶，則結(jié)果為陰性。[0023]一種利用鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鯉皰疹病毒2型的方法(最佳條件)，其步驟是[0024]1、病毒DNA的獲取[0025]采用DNAml 試劑或Viral DNA Kit試劑盒等提取樣本總DNA，模板DNA在95°C 5 分鐘后迅速置于冰浴中的預(yù)處理可以增加檢測(cè)的靈敏度。[0026]2、LAMP 擴(kuò)增[0027]采用25 μ I反應(yīng)體系，包括內(nèi)引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和Β3 各 O. ΙμΜ，dNTPslmM, BetaineO. 5M, MgCl28mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1， 10 X ThermoPolReaction Buffer2. 5 μ I，去離子水補(bǔ)足余量。反應(yīng)管于64°C溫育60分鐘進(jìn)行LAMP反應(yīng)之后，80°C滅活2分鐘。[0028]3、檢測(cè)結(jié)果判定，可用下述三種方法之一進(jìn)行結(jié)果的判定[0029]I)發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，從dNTPs析出的焦磷酸根離子和反應(yīng)液中的鎂離子形成白色焦磷酸鎂沉淀，通過肉眼判斷檢測(cè)管出現(xiàn)明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性。[0030]2)每 25 μ I 體系的反應(yīng)管加 1000XSYBR Green I (Invitrogen) 1-2 μ l，l_5min 觀察結(jié)果，反應(yīng)液變綠為陽性，保持橙色為陰性。3)取擴(kuò)增產(chǎn)物，用2% (w/v,以下相同)的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示LAMP特征性梯狀條帶，則結(jié)果為陽性；如無任何條帶，則結(jié)果為陰性。[0032]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)[0033]1、特異性好，能有效檢測(cè)出鯉皰疹病毒2型；[0034]2、快速高效，檢測(cè)時(shí)間約I小時(shí)，非常適用于鯉皰疹病毒2型的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；[0035]3、不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測(cè)成本低；[0036]4、鑒定簡單，通過從dNTPs析出的焦磷酸根離子和反應(yīng)液中的鎂離子形成白色焦磷酸鎂沉淀，經(jīng)肉眼就可判斷結(jié)果，通過加入1000XSYBR Green I,可提高結(jié)果的靈敏度。


[0037]圖1為一種鯉皰疹病毒2型LAMP試劑盒檢測(cè)結(jié)果的特異性的示意圖。[0038]從左至右的泳道依次為空白對(duì)照(水)、鰻皰疹病毒、GSIV、KHV、鯉皰疹病毒2型、 DL2,OOOMarker0[0039]圖2為一種鯉皰疹病毒2型LAMP試劑盒檢測(cè)結(jié)果的靈敏度的示意圖。[0040]從左至右的泳道依次為IOOfg CyHV-2、Ipg CyHV-2UOpg CyHV-2UOOpg CyHV-2, lngCyHV-2,DL2000DNA Marker。
具體實(shí)施方式
[0041]下列實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)該當(dāng)做對(duì)本發(fā)明的限制。若無特別說明，本發(fā)明所用試劑均為上海生工生物工程公司生產(chǎn)。[0042]實(shí)施例1 :[0043]一種鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)試劑盒，包括以下成分[0044]該試劑盒它包括以下成分10XThermoPol Reaction Buffer ；Bst DNA聚合酶 (NEB) ；dNTPs ;外引物 F3 和 B3、內(nèi)引物 FIP 和 BIP、Betaine (Sigma), MgCl2,1000XSYBR GreenI (Invitrogen)0[0045]F3 :5， -TTGGATCTGAACGCTTCGG-3，；[0046]B3 :5’ -CGTTGGTCTGTATGGGAGC-3’ ；[0047]FIP :5’ -GCGATGTAAGCCCTGTGAGACTTTTTACGAGACGTGGTTCCTAGC-3’ ；[0048]BIP :5’ -AACGCACGAGTGCGAGTCTCTTTTGCTGTGGATCGTCCATCC-3’。[0049]實(shí)施例2 [0050]鯉皰疹病毒2型LAMP 檢測(cè)試劑盒不同濃度的Mg2+的優(yōu)化[0051]一、取待檢樣品提取病毒DNA:[0052]培養(yǎng)錦鯉鰭條細(xì)胞系(Ko1-Fin)至匯合單層，吸出培養(yǎng)液，以感染復(fù)數(shù)為O.1 的劑量，接種ImL經(jīng)4000r/min離心5min除去細(xì)胞碎片的鯉皰疹病毒2型組織毒材料 (Doszpoly, A. , M. Benko, Gy. Csaba, A. Dan, M. Lang, B. Harrach. 2011.1ntroduction of the family Alloherpesviridae: the first molecular detection of herpesviruses of cyprinid fish in Hungary. Magyar Allatorvosok Lapjal33 (3) : 174—181.),添力口 10 μ L 的Polybrene (終濃度10 μ g/ml),置于26°C培養(yǎng)箱中吸附lh，使病毒吸附細(xì)胞，吸附過程中每20min輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶一次，使病毒液與細(xì)胞單層充分均勻接觸，吸附Ih后，吸棄病毒液，加入5mL2%胎牛血清(V/V)的培養(yǎng)液，置26°C培養(yǎng)，直至細(xì)胞出現(xiàn)明顯的致細(xì)胞病變效應(yīng)，收集細(xì)胞病變材料，于_80°C至室溫(20-25°C )反復(fù)凍融3次，5000r/min離心30min，取上清250 μ 1，用Viral DNA Kit試劑盒按照說明書提取DNA，最后溶于50 μ I滅菌水，_20°C 保存?zhèn)溆?。[0053]二、LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系[0054]采用25 μ I反應(yīng)體系，包括內(nèi)引物FIP和BIP各O. 8μΜ，外引物F3和Β3各O. ΙμΜ, dNTPslmM, BetaineO. 5M, MgCl2, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ I, IOXThermoPol Reaction Buffer2. 5 μ I,去離子水補(bǔ)足余量。[0055]其中Mg2+的濃度分別為2、4、6、8和10mM。[0056]三、LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)條件[0057]反應(yīng)管于64°C溫育60分鐘后，80°C滅活2分鐘。[0058]四、檢測(cè)結(jié)果判定[0059]取8 μ I擴(kuò)增產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示Mg2+的濃度為8mM時(shí)結(jié)果最好。[0060]實(shí)施例3 [0061 ] 鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)方法反應(yīng)溫度的優(yōu)化[0062]一、取待檢樣品提取病毒DNA:[0063]待鯉皰疹病毒2型感染的Ko1-Fin細(xì)胞出現(xiàn)90%病變后收獲(制備方法同實(shí)施例 2)，于-80°C至室溫反復(fù)凍融3次，5000r/min離心30min，取上清250μ 1，用Viral DNA Kit 試劑盒按照說明書提取DNA，最后溶于50 μ I滅菌水，_20°C保存?zhèn)溆?。[0064]二、LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系[0065]采用25 μ I反應(yīng)體系，包括內(nèi)引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和Β3 各 O. ΙμΜ，dNTPslmM, BetaineO. 5M, MgCl28mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1， 10 X ThermoPolReaction Buffer2. 5 μ I，去離子水補(bǔ)足余量。[0066]三、LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)條件[0067]反應(yīng)管分別置于60、61、62、63、64、65°C溫育60分鐘后，80°C滅活2分鐘。[0068]四、檢測(cè)結(jié)果判定[0069]取8 μ I擴(kuò)增產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示64°C時(shí)結(jié)果最好。[0070]實(shí)施例4 [0071 ] 鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)方法的特異性[0072]一、取待檢樣品提取病毒DNA:[0073]GSIV(中國典 型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC NO: V201134)感染的EPC細(xì)胞、鰻皰疹病毒 (F Rijsewijk, S Pritz-Verschuren, S Kerkhoff, A Botter, M ffillemsen, T Nieuwstadt, O Haenen.2005. Development of a polymerase chain reaction for the detection of Anguillid herpesvirus DNA in eels based on the herpesvirus DNA polymerase gene. Journal of Virological Methodsl24:87權(quán)利要求
1.一種鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括以下成分該試劑盒包括以下成分10 X ThermoPol Reaction緩沖液;ifei DNA聚合酶；dNTPs ; 外引物卩3和83、內(nèi)引物？1卩和81卩、86七&11^，]/%(12，1000/3￥81 Green I;F3 :5’_ TTGGATCTGAACGCTTCGG2.利用權(quán)利要求
1所述的一種鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鯉皰疹病毒2型的方法，其步驟是1)、病毒DNA的獲取采用DNAzol 試劑或Viral DNA Kit試劑盒等提取樣本總DNA ；2)、LAMP擴(kuò)增采用25μ I反應(yīng)體系內(nèi)引物FIP和BIP各O. 8 μ Μ，外引物F3和Β3各O.1 μ Μ， dNTPsImM, BetaineO. 5M, MgCl2 2-10mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ I, IOXThermoPol Reaction Buffer 2. 5 μ 1，選擇 55_65°C和 30-120 分鐘進(jìn)行 LAMP 反應(yīng)之后，80°C滅活 2 分鐘；3)、檢測(cè)結(jié)果判定，采用下述三種方式之一A、發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，從dNTPs析出的焦磷酸根離子和反應(yīng)液中的鎂離子形成白色焦磷酸鎂沉淀，通過肉眼判斷檢測(cè)管出現(xiàn)明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性；B、每25μ I體系的反應(yīng)管加1000X SYBR Green I 1-2 μ 1,1-5 min觀察結(jié)果，反應(yīng)液變綠為陽性，保持橙色為陰性；C、取擴(kuò)增產(chǎn)物，用2%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示LAMP特征性梯狀條帶，則結(jié)果為陽性；如無任何條帶，則結(jié)果為陰性。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的一種鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鯉皰疹病毒2型的方法，其特征在于=MgCl2的濃度為8mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的一種鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鯉皰疹病毒2型的方法，其特征在于反應(yīng)溫度為64°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的一種鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鯉皰疹病毒2型的方法，其特征在于模板DNA在95°C 5分鐘后置于冰浴中的預(yù)處理。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，一種鯉皰疹病毒2型LAMP檢測(cè)試劑盒，包括以下成分10×ThermoPolReaction緩沖液；BstDNA聚合酶；dNTPs；外引物F3和B3、內(nèi)引物FIP和BIP、Betaine，MgCl2，1000×SYBRGreenI。本發(fā)明具有簡便、快速、高特異性和靈敏性的特點(diǎn)，僅需一個(gè)水浴鍋或金屬浴即可在2小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)確檢測(cè)出樣品中的CyHV-2，能檢測(cè)CyHV-2感染的病魚組織，能檢測(cè)CyHV-2感染的細(xì)胞，非常適用于CyHV-2的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN103045764SQ201310019403
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月18日
發(fā)明者曾令兵, 范玉頂, 張輝, 周勇, 徐進(jìn) 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan