專利名稱:生產(chǎn)促胰島素分泌肽glp－1(7－36)的基因工程菌以及生產(chǎn)glp－1(7－36)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)促胰島素分泌肽GLP-1(7-36)(Glucagon LikePeptide，胰高血糖素類多肽)的基因工程菌和利用該基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)GLP-1(7-36)的方法。GLP-1(7-36)是可能作為II型糖尿病治療藥物的一種活性多肽。
背景技術(shù)：
GLP-1是人體分泌的一種腸道激素，由胰高血糖素原(Proglucagon)分子經(jīng)腸道蛋白水解酶作用而產(chǎn)生，因而稱為胰高血糖素類多肽。當(dāng)血糖濃度高于6mmol/L時，GLP-1能顯著促進(jìn)胰島素分泌；而一旦血糖濃度恢復(fù)至正常值則不再繼續(xù)作用，這一點(diǎn)對II型糖尿病的治療十分有用(中國專利公開號CN 1129224A)。
人體內(nèi)的GLP-1有二種形式，一種為GLP-1(7-36)NH2，是由30個氨基酸殘基組成的多肽，其C端是酰胺化了的；另一種為GLP-1(7-37)，是由31個氨基酸殘基組成的多肽。GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)有相同的促胰島素分泌作用，例如實(shí)驗(yàn)證明，在1×10-10～1×10-11mol/L濃度下，GLP-1對離體胰島細(xì)胞作用時，促進(jìn)了胰島素的分泌，故又稱它們?yōu)榇僖葝u素分泌肽。
中國專利公開CN 1129224A說明書第32頁報(bào)道，與上述二種促胰島素分泌肽一樣，GLP-1(7-36)也具有促胰島素分泌作用。
已經(jīng)有報(bào)道通過基因工程方法來生產(chǎn)GLP-1(7-36)NH2，但還沒有研究者嘗試用基因工程技術(shù)生產(chǎn)GLP-1(7-36)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是構(gòu)建用于生產(chǎn)GLP-1(7-36)的一系列基因工程菌株，以及利用這些菌株生產(chǎn)GLP-1(7-36)的方法。應(yīng)用本發(fā)明提供的基因工程菌以及相應(yīng)的方法，能夠大規(guī)模低成本地生產(chǎn)GLP-1(7-36)。
GLP-1(7-36)的氨基酸序列如下His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg式中英文縮寫表示His組氨酸，Ala丙氨酸，Glu谷氨酸，Gly甘氨酸，Thr蘇氨酸，Phe苯丙氨酸，Ser絲氨酸，Asp天冬氨酸，Val纈氨酸，Tyr酪氨酸，Leu亮氨酸，Gln谷氨酰胺，Lys賴氨酸，Trp色氨酸，Ile異亮氨酸，Arg精氨酸本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明提供的生產(chǎn)促胰島素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，該菌屬大腸桿菌(Escherichia coli)，保藏在北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2001年7月11日，保藏號為CGMCC No.0599。該基因工程菌攜帶的質(zhì)粒中包含有表達(dá)GLP-1(7-36)的基因，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
本發(fā)明提供的生產(chǎn)促胰島素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，其攜帶的質(zhì)粒中包含有n個表達(dá)GLP-1(7-36)的基因，其中，n為從1到32的整數(shù)。
本發(fā)明提供的生產(chǎn)促胰島素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，優(yōu)選例為其攜帶的質(zhì)粒中包含有16個表達(dá)GLP-1(7-36)的基因。
本發(fā)明提供的生產(chǎn)促胰島素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，其宿主細(xì)胞大腸桿菌為JM103，JM109或DH5α。
本發(fā)明提供的生產(chǎn)促胰島素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，攜帶的質(zhì)粒的啟動子為Lac，PL，Tac，PT7或Trp。
本發(fā)明的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括將n個表達(dá)GLP-1(7-36)的基因克隆于質(zhì)粒中，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞大腸桿菌中，其中，n為從1到32的整數(shù)。
本發(fā)明的基因工程菌的構(gòu)建方法中，所述的宿主細(xì)胞大腸桿菌為JM103，JM109或DH5α。
本發(fā)明的基因工程菌的構(gòu)建方法中，所述的質(zhì)粒的啟動子為Lac，PL，Tac，PT7或Trp。
本發(fā)明的生產(chǎn)GLP-1(7-36)的方法，包括構(gòu)建權(quán)利要求
1或2或3或4或5定義的基因工程菌，然后在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)生和積累含有GLP-1(7-36)的包涵體，通過細(xì)胞破碎和包涵體的分離純化得到融合蛋白，再經(jīng)過融合蛋白裂解以及GLP-1(7-36)的純化得到產(chǎn)品。
本發(fā)明采用如下方法構(gòu)建基因工程菌株將1個表達(dá)GLP-1(7-36)的基因，或者將2到32個表達(dá)GLP-1(7-36)的基因串聯(lián)成聚合體后，克隆于大腸桿菌質(zhì)粒中，啟動子可使用Lac，PLTac，PT7或者Trp等，GLP-1(7-36)是作為該基因工程菌所表達(dá)的融合蛋白的一個主要組成部分通過后加工來得到的。
基因工程菌的構(gòu)建對本發(fā)明至關(guān)重要。根據(jù)遺傳密碼的簡并性，大多數(shù)氨基酸可以具有幾組不同的密碼子。本發(fā)明的各種實(shí)施方案包括使用各種不同的密碼子來構(gòu)成表達(dá)GLP-1(7-36)的基因。
用本發(fā)明提供的基因工程菌，結(jié)合微生物發(fā)酵和下游分離純化技術(shù)，可以大規(guī)模地生產(chǎn)促胰島素分泌肽GLP-1(7-36)，生產(chǎn)成本大大低于化學(xué)合成法生產(chǎn)GLP-1(7-36)，與現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)GLP-1(7-36)NH2或GLP-1(7-37)相比也要低得多。GLP-1(7-36)有可能成為II型糖尿病治療藥物，通過實(shí)施本發(fā)明，可以為II型糖尿病患者大量提供價格低廉的活性多肽GLP-1(7-36)。



現(xiàn)結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步說明。
圖1為本發(fā)明生產(chǎn)GLP-1(7-36)的工藝流程圖。
圖2為實(shí)施例所得產(chǎn)品GLP-1(7-36)的HPLC圖譜。
圖3為實(shí)施例所得產(chǎn)品GLP-1(7-36)的毛細(xì)管電泳圖譜。
圖4為實(shí)施例所得產(chǎn)品GLP-1(7-36)的氨基酸組成分析結(jié)果。
圖5為實(shí)施例所得產(chǎn)品GLP-1(7-36)氨基酸序列分析結(jié)果。
圖6為實(shí)施例所得產(chǎn)品GLP-1(7-36)質(zhì)譜分析結(jié)果。
圖7為實(shí)施例所得產(chǎn)品GLP-1(7-36)的生物活性試驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)條件NOD小鼠體重20克，腹腔注射200微升40％葡萄糖，每個數(shù)據(jù)點(diǎn)樣本數(shù)目均為6。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1構(gòu)建含有1個GLP-1(7-36)基因的菌株，并利用該菌株生產(chǎn)GLP-1(7-36)按GLP-1(7-36)的氨基酸序列，合成如下4個基因片段(1)AAT TCC AGA TCT CGT CAC GCG GAA GGT ACC TTCACC AGC GAT GTG AGC AGC TAT CTG(2)ACC TTC CAG ATA GCT GCT CAC ATC GCT GGT GAAGGT ACC TTC CGC GTG ACG AGA TCT GG(3)GAA GGT CAG GCG GCG AAA GAA TTT ATC GCG TGGCTG GTG AAA GGT CGT GGA TCC TAG A(4)AG CTT CTA GGA TCC ACG ACC TTT CAC CAG CCA CGCGAT AAA TTC TTTCGC CGC CTG
然后將4個基因片段連接成一個表達(dá)GLP-1(7-36)的基因，基因片段的連接步驟為將上述四個基因片段含量各為A260nm＝5，分別溶于50微升重蒸水中，No.1和No.2各取1微升置于1.5毫升離心管中，No.3和No.4各取1微升放于另一個離心管中。兩管中各加1微升polynucleotide kinase buffer 1×10(聚核苷酸激酶緩沖液)，1微升的1mM ATP-鈉鹽以及1微升polynucleotide kinase(聚核苷酸激酶)，37℃保溫1小時，水浴加熱至90℃，維持5分鐘，然后使之徐徐冷卻至室溫，將兩個試管中的內(nèi)容物混合后加1mM ATP-鈉鹽1微升，T4-DNA ligase buffer 1×10(T4-DNA連接酶緩沖液)，1微升，T4-DNA ligase(T4-DNA連接酶緩沖液)1微升，混合物于16℃放置過夜，1％瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠顯色證明連接完成。
取大腸桿菌質(zhì)粒，啟動子為Lac，經(jīng)過EcoR I和Hind III雙酶解后，加苯酚-氯仿抽提，取水層，再用氯仿洗滌水層2次，加異丙醇60％沉淀，室溫1小時，離心，將沉淀中的有機(jī)溶劑蒸發(fā)除去后，將上述的連接完成的基因與經(jīng)過雙酶切的質(zhì)粒溶液混合，加1mMATP-鈉鹽1微升T4DNA ligase buffer 1×10 1微升T4ligase，加T4DNA-ligase 1微升，18℃過夜。
大腸桿菌受體菌JM103(或JM109，DH5α)于50毫升LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)至A600nm達(dá)0.6時，離心，收集菌體，懸浮于冰冷的10毫升CaCl2溶液中(CaCl2，60mM，甘油15％，10mM PIPES
哌嗪-N，N’-雙[2-乙烷磺酸]
，pH 7.0，經(jīng)過滅菌)，再用3000rpm離心，懸浮于2毫升冰冷的上述CaCl2溶液中，冰浴中保存?zhèn)溆谩?br> 取受體細(xì)胞50微升，將克隆的質(zhì)粒取5微升，混合后42℃維持2分鐘，冷卻，加LB培養(yǎng)液100微升，37℃，保溫1小時，分別涂瓊脂糖板(含50微克/毫升氨芐青霉素Ap)，37℃培養(yǎng)過夜，挑取菌落。進(jìn)一步培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，用EcoR I/Hind III雙酶切后，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢查克隆的基因。DNA序列分析單個GLP-1(7-36)基因的DNA序列分析與設(shè)計(jì)符合His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp ValCAC GCG GAA GGT ACC TTC ACC AGC GAT GTGGTG CGC CTT CCA TGG AAG TGG TCG CTA CACSer Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala LysAGC AGC TAT CTG GAA GGT CAG GCG GCG AAATCG TCG ATA GAC CTT CCA GTC CGC CGC TTTGlu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly ArgGAA TTT ATC GCG TGG CTG GTG AAA GGT CGTCTT AAA TAG CGC ACC GAC CAC TTT CCA GCA用構(gòu)建好的基因工程菌株，經(jīng)過發(fā)酵、菌體收集、細(xì)胞破碎、包涵體分離純化、融合蛋白裂解以及GLP-1(7-36)純化等步驟，即可得到純度達(dá)99％的產(chǎn)品。圖2和圖3分別為所得GLP-1(7-36)的HPLC和毛細(xì)管電泳圖譜。
所得產(chǎn)品經(jīng)氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、質(zhì)譜分析等測試，證實(shí)應(yīng)用本發(fā)明提供的基因工程菌，經(jīng)發(fā)酵及下游加工后所得多肽為GLP-1(7-36)。
圖4為氨基酸組成分析結(jié)果，所得多肽的氨基酸組成與GLP-1(7-36)完全相同。
圖5為所得多肽的氨基酸序列分析結(jié)果，其N末端15個氨基酸的組成和排列與GLP-1(7-36)完全相同。
圖6為質(zhì)譜分析結(jié)果，測定所得多肽分子量為3297.12，在誤差范圍內(nèi)與GLP-1(7-36)的分子量3298.68相符合。
考察所得GLP-1(7-36)的生物活性，發(fā)現(xiàn)其與GLP-1(7-37)及GLP-1(7-36)NH2相同，均有促進(jìn)胰島素分泌和降低血糖濃度的作用。圖7為NOD小鼠耐糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對體重20克的NOD小鼠分別給葡萄糖，葡萄糖+10微克GLP-1(7-36)、葡萄糖+10微克GLP-1(7-36)NH2、葡萄糖+10微克GLP-1(7-37)，發(fā)現(xiàn)只給葡萄糖的小鼠血糖濃度出現(xiàn)很高的峰值，而給藥的小鼠血糖濃度均基本保持穩(wěn)定，不出現(xiàn)血糖高峰。這是由于GLP-1促進(jìn)了胰島素分泌，從而有效地控制了血糖濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)具有相同的促胰島素分泌作用。實(shí)施例2構(gòu)建含有16個GLP-1(7-36)基因的菌株，并利用該菌株生產(chǎn)GLP-1(7-36)將實(shí)施例1所得質(zhì)粒溶液取5微升，置于0.5毫升塑料試管中加Bgl II內(nèi)切酶buffer1×10 1微升，Bgl II和Hind III 1微升，37℃，保溫1小時，然后取樣走1％瓊脂糖凝膠電泳分離GLP-1(7-36)基因片段，回收后備用。
另取實(shí)施例1所得質(zhì)粒溶液1微升，加BamH I buffer 1×10 1微升，然后加BamH I和Hind III各1微升，37℃保溫1小時，苯酚-氯仿處理，離心分取水層，用氯仿洗滌2次，離心分取水層，加60％異丙醇溶液沉淀，離心，蒸發(fā)，除去沉淀中的有機(jī)溶劑，加10微升水溶解，與Bgl II和Hind III雙酶解的GLP-1基因片段混合，加T4DNA-ligase buffer 1×10 1微升，1mM ATP鈉鹽1微升及T4DNA-ligase2微升，18℃保溫過夜，完成連接。
轉(zhuǎn)化JM103，受體菌與上述相同方法制備。涂板在50μg/ml Ap條件下，37℃培養(yǎng)過夜，挑選菌落進(jìn)行培養(yǎng)。抽取質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I/HindIII雙酶切后，1％瓊脂糖凝膠電泳檢查篩選含有由兩個GLP-1(7-36)基因組成的二聚體的質(zhì)粒。
如上重復(fù)進(jìn)行GLP-1(7-36)基因串聯(lián)，得到質(zhì)粒中含有由16個GLP-1(7-36)基因組成的串聯(lián)基因。按實(shí)施例1的方法將這一質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌受體菌JM103，即構(gòu)建完成了有16個GLP-1(7-36)串聯(lián)基因的基因工程菌。
用構(gòu)建好的基因工程菌株進(jìn)行發(fā)酵，再將菌體收集，經(jīng)細(xì)胞破碎、包涵體分離純化、融合蛋白裂解和GLP-1(7-36)的純化等步驟，即得到純度達(dá)99％的產(chǎn)品。
所得產(chǎn)品經(jīng)氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、質(zhì)譜分析等測試，證實(shí)本實(shí)施例所得多肽為GLP-1(7-36)。
按照與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行活性測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)施例所得GLP-1(7-36)產(chǎn)品生物活性同實(shí)施例1。實(shí)施例3構(gòu)建含有32個GLP-1(7-36)基因的菌株，并利用該菌株生產(chǎn)GLP-1(7-36)實(shí)施例2中得到的質(zhì)粒中包含有16個GLP-1(7-36)基因的串聯(lián)基因，依前面所述方法，將2個這樣的基因串聯(lián)起來，即可得到包含32個GLP-1串聯(lián)基因的質(zhì)粒。再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到JM103受體菌，即得到n＝32的基因工程菌。
用構(gòu)建好的基因工程菌株進(jìn)行發(fā)酵，再將菌體收集，經(jīng)細(xì)胞破碎、包涵體分離純化、融合蛋白裂解和GLP-1(7-36)的純化等步驟，即得到純度達(dá)99％的產(chǎn)品。
所得產(chǎn)品經(jīng)氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、質(zhì)譜分析等測試，證實(shí)本實(shí)施例所得多肽為GLP-1(7-36)。
按照與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行活性測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)施例所得GLP-1(7-36)產(chǎn)品生物活性同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)促胰島素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，其特征在于該基因工程菌攜帶的質(zhì)粒中包含有表達(dá)GLP-1(7-36)的基因，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的基因工程菌，其特征在于所述質(zhì)粒中包含有n個表達(dá)GLP-1(7-36)的基因，其中，n為從1到32的整數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的基因工程菌，其特征在于所述質(zhì)粒中包含有16個表達(dá)GLP-1(7-36)的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1或2或3所述的基因工程菌，其特征在于所述的大腸桿菌是JM103，JM109或DH5α。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1或2或3所述的基因工程菌，其特征在于所述質(zhì)粒的啟動子為Lac，PL，Tac，PT7或Trp。
6.一種生產(chǎn)促胰島素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括將n個表達(dá)GLP-1(7-36)的基因克隆于質(zhì)粒中，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞大腸桿菌中，其中，n為從1到32的整數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述的宿主細(xì)胞大腸桿菌是JM103，JM109或DH5α。
8.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述的質(zhì)粒的啟動子為Lac，PL，Tac，PT7或Trp。
9.一種生產(chǎn)促胰島素分泌肽GLP-1(7-36)的方法，包括構(gòu)建權(quán)利要求
1或2或3或4或5定義的基因工程菌，然后在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)生和積累含有GLP-1(7-36)的包涵體，通過細(xì)胞破碎和包涵體的分離純化得到融合蛋白，再經(jīng)過融合蛋白裂解以及GLP-1(7-36)的純化得到產(chǎn)品。
專利摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)促胰島素分泌肽GLP－1(7－36)的基因工程菌以及利用該基因工程菌生產(chǎn)GLP－1(7－36)的方法?；蚬こ叹乃拗骷?xì)胞為大腸桿菌,攜帶的質(zhì)粒中包含有n=1到32個表達(dá)GLP－1(7－36)的基因,其構(gòu)建方法包括將n個(n=1到32)表達(dá)GLP－1(7－36)的基因克隆于大腸桿菌質(zhì)粒中,并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。然后在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)構(gòu)建好的基因工程菌,以產(chǎn)生和積累含有GLP－1(7－36)的包涵體,并通過后續(xù)的融合蛋白裂解以及分離純化工藝得到GLP－1(7－36)。使用本發(fā)明提供的基因工程菌及相應(yīng)工藝生產(chǎn)促胰島素分泌肽GLP－1(7－36),生產(chǎn)成本大大低于現(xiàn)有技術(shù)化學(xué)合成法。鑒于GLP－1(7－36)具有促胰島素分泌作用,是一種可能用于治療II型糖尿病的活性多肽,本發(fā)明使得大規(guī)模低成本地生產(chǎn)這種多肽成為可能。
文檔編號C12N15/70GKCN1363654SQ01126278
公開日2002年8月14日 申請日期2001年7月19日
發(fā)明者孫玉昆, 伍登熙, 巫愛珍, 朱志勇, 余剛, 周加祥, 趙少陵 申請人:上海華誼生物技術(shù)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan