本發(fā)明涉及生化檢測(cè)，特別涉及雌二醇偶聯(lián)結(jié)構(gòu)、合成方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、雌二醇(estradiol，e2)是一種甾體雌激素，男性由睪丸分泌，未孕女性由卵巢分泌。女性血清雌二醇測(cè)定對(duì)評(píng)價(jià)各種月經(jīng)異常是很有用的指標(biāo)：如女孩青春期提前或延遲、原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng)、卵巢早衰等。同時(shí)，血清雌二醇也可用于衡量卵巢卵泡的成熟度。懷孕的女性，血清雌二醇水平明顯升高，遠(yuǎn)高于上述的排卵前峰值水平，而且高水平的雌二醇濃度持續(xù)整個(gè)孕期。男性雌二醇水平的升高常與女性化綜合征、乳房女性化等疾病有關(guān)。在不孕癥患者中，血清雌二醇的監(jiān)測(cè)對(duì)于監(jiān)控誘導(dǎo)排卵及隨后的治療是非常有意義的。在體外受精(ivf)過(guò)程中，對(duì)卵巢進(jìn)行過(guò)刺激時(shí)，通常每天對(duì)絨毛膜促性腺激素的使用和卵母細(xì)胞的收集進(jìn)行調(diào)整，也需要檢測(cè)血清雌二醇濃度。因此，檢測(cè)人體生物樣本中的雌二醇的含量具有重要的臨床意義。

2、目前，檢測(cè)雌二醇常用的方法主要有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法和化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。放射免疫分析法合成工藝復(fù)雜，有效期短，存在放射性污染；酶聯(lián)免疫分析法需進(jìn)行手工操作，誤差較大；化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)發(fā)展迅速，靈敏度、特異性以及自動(dòng)化程度高。

3、在免疫化學(xué)發(fā)光試劑的開(kāi)發(fā)中，小分子抗原的檢測(cè)往往采用競(jìng)爭(zhēng)法來(lái)實(shí)現(xiàn)。譬如臨床上對(duì)雌二醇的測(cè)定一般使用競(jìng)爭(zhēng)法進(jìn)行，舊檢測(cè)試劑盒的反應(yīng)原理大致如圖1所示。其檢測(cè)試劑盒包括：

4、試劑包：1套，包含試劑1，試劑2和磁微粒。50測(cè)試/盒裝量分別6ml，6ml，1.5ml；100測(cè)試/盒裝量分別為11ml，11ml，2.5ml。

5、試劑1：內(nèi)含生物素化的雌二醇(estradiol-6-bsa-biotin)，三羥甲基氨基甲烷緩沖液，防腐劑(proclin300)；

6、試劑2：內(nèi)含吖啶酯標(biāo)記的抗雌二醇抗體，2-(n-嗎啉)乙磺酸緩沖液，防腐劑(proclin300)；

7、磁微粒：內(nèi)含鏈霉親和素包被的磁微粒，防腐劑(proclin300)；

8、校準(zhǔn)品1、校準(zhǔn)品2：各1瓶，1ml/瓶。內(nèi)含孕酮抗原，防腐劑(proclin300)。

9、反應(yīng)原理：首先試劑2與樣本結(jié)合，試劑2中吖啶酯標(biāo)記的抗雌二醇抗體與樣本中的雌二醇結(jié)合形成免疫復(fù)合物；其次加入試劑1，試劑1中固定濃度的生物素化的雌二醇與樣本中雌二醇競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合形成免疫復(fù)合物；然后加入鏈霉親和素包被的磁微粒捕獲生物素化的雌二醇和生物素化的雌二醇與內(nèi)含吖啶酯標(biāo)記的抗雌二醇抗體形成的免疫復(fù)合物；磁吸清洗去除上清；最后獲得固相結(jié)合的鏈霉親和素-生物素化的雌二醇-吖啶酯標(biāo)記的抗雌二醇抗體免疫復(fù)合物和固相結(jié)合的鏈霉親和素-生物素化的雌二醇。樣本中的雌二醇濃度越高，固相結(jié)合的鏈霉親和素-生物素化的雌二醇-吖啶酯標(biāo)記的抗雌二醇抗體免疫復(fù)合物越少。加入預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液，測(cè)定化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光值，其發(fā)光強(qiáng)度與樣本中的雌二醇濃度成負(fù)相關(guān)。

10、但現(xiàn)有雌二醇檢測(cè)試劑盒的試劑1中生物素化的雌二醇組分，對(duì)雌二醇的修飾主要借助牛血清白蛋白(bsa)作為載體蛋白進(jìn)行橋接。然而，在estradiol-6-bsa?antigen的制備過(guò)程中已占用牛血清白蛋白表面的伯氨基，nhs-biotin也需要占用牛血清白蛋白表面的伯氨基，與estradiol-6-bsa?antigen結(jié)合制得到estradiol-6-bsa-biotin，即在同一個(gè)蛋白上偶聯(lián)生物素和雌二醇，偶聯(lián)數(shù)量和偶聯(lián)位點(diǎn)都不可控，兩者之間的偶聯(lián)比例也不可控，因此生物素化的雌二醇生產(chǎn)批件差異較難控制，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性不好；另外,estradiol-6-bsa-biotin與樣本中游離雌二醇在結(jié)構(gòu)上有較大的差異，導(dǎo)致試劑1中雌二醇和樣本雌二醇兩者與抗體的結(jié)合存在較大差異，競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系難以構(gòu)建并穩(wěn)定。

11、本發(fā)明提出了雌二醇偶聯(lián)結(jié)構(gòu)、合成方法及其應(yīng)用，將其應(yīng)用于雌二醇磁微粒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，從而降低試劑盒成本，改進(jìn)試劑盒的檢測(cè)性能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的是提供一種雌二醇偶聯(lián)結(jié)構(gòu)、合成方法及其應(yīng)用，該雌二醇偶聯(lián)結(jié)構(gòu)包括式(i-1)，將其應(yīng)用于雌二醇磁微粒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，降低試劑盒成本，改進(jìn)試劑盒的檢測(cè)性能。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案是：雌二醇偶聯(lián)結(jié)構(gòu)，包括式(i-1)結(jié)構(gòu)，

3、

4、其中，r1選自-ch2-、-peg-中的一種；

5、r2選自中的一種；

6、n為自然數(shù)；

7、優(yōu)選的，所述r2為式(i-2)，所述r1為-ch2-時(shí)，所述n為0-100中的任意一個(gè)；

8、所述r2為式(i-2)，所述r1為-peg-時(shí)，所述n為0-1000中的任意一個(gè)。

9、優(yōu)選的，所述r2為式(i-2)，所述r1為-ch2-時(shí)，所述n為0-20中的任意一個(gè)；

10、所述r2為式(i-2)，所述r1為-peg-時(shí)，所述n為0-500中的任意一個(gè)。

11、優(yōu)選的，所述r2為式(i-3)，所述r1為-ch2-時(shí)，所述n為0-100中的任意一個(gè)；

12、所述r2為式(i-3)，所述r1為-peg-時(shí)，所述n為0-1000中的任意一個(gè)。

13、優(yōu)選的，所述r2為式(i-3)，所述r1為-ch2-時(shí)，所述n為0-40中的任意一個(gè)。

14、所述r2為式(i-3)，所述r1為-peg-時(shí)，所述n為0-500中的任意一個(gè)。

15、優(yōu)選的，所述式(i-1)結(jié)構(gòu)是以β-雌二醇-6-一6-(o-羧甲基肟)、吖啶酸丙磺酸鹽或生物素為起始原料、式(i-4)化合物為連接子合成的；

16、

17、本發(fā)明還提供了雌二醇偶聯(lián)結(jié)構(gòu)的合成方法，其合成步驟如下：

18、1)稱(chēng)取吖啶酸丙磺酸鹽或生物素和β-雌二醇-6-一6-(o-羧甲基肟)，并用緩沖液溶解；在酸性條件下，邊攪拌邊緩慢加入式(i-4)化合物，進(jìn)行酰肼?；磻?yīng)，形成n-酰肼酸中間體；n-酰肼酸中間體經(jīng)過(guò)水解作用，形成酰肼鍵，生成式(i-1)結(jié)構(gòu)粗產(chǎn)品；

19、2)將式(i-1)結(jié)構(gòu)粗產(chǎn)品用乙醇溶解，用薄層層析硅膠板進(jìn)行分離，得到式(i-1)結(jié)構(gòu)。

20、優(yōu)選的，所述β-雌二醇-6-一6-(o-羧甲基肟)、式(i-2)化合物和吖啶酸丙磺酸鹽或生物素的摩爾比例為1：(1～1.2)：1。

21、優(yōu)選的，所述酸性環(huán)境ph值為4～6，所選用的酸性溶液為醋酸、甲酸、三氟乙酸中的一種。

22、優(yōu)選的，所選用的酸性溶液為醋酸。

23、本發(fā)明還提供了該雌二醇偶聯(lián)結(jié)構(gòu)在雌二醇磁微粒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒。

24、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

25、(1)本發(fā)明提供的雌二醇偶聯(lián)結(jié)構(gòu)、合成方法及其應(yīng)用，該雌二醇偶聯(lián)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性更好，與樣本中游離的雌二醇在結(jié)構(gòu)上的差異性更小，兩者與抗體結(jié)合的差異性小，可構(gòu)建穩(wěn)定的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系；并且合成該雌二醇偶聯(lián)結(jié)構(gòu)所選用的原料成本更低，合成方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)率也更高。

26、(2)本發(fā)明提供的雌二醇偶聯(lián)結(jié)構(gòu)，采用式(i-4)化合物為連接子，β-雌二醇-6-一6-(o-羧甲基肟)、吖啶酸丙磺酸鹽或生物素為原料合成得到，具有反應(yīng)速率快，產(chǎn)率高等特點(diǎn)，且連接子兩端的酰肼基團(tuán)分別與β-雌二醇-6-一6-(o-羧甲基肟)、吖啶酸丙磺酸鹽或生物素上的羧酸基團(tuán)結(jié)合，偶聯(lián)數(shù)量和偶聯(lián)位點(diǎn)均可控，兩者之間的偶聯(lián)比例也是可控的，可重復(fù)性高，生產(chǎn)批件差異性小，能夠大批量生產(chǎn)；將其配制得到的雌二醇檢測(cè)試劑盒，其檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性高。

27、(3)本發(fā)明提供的雌二醇偶聯(lián)結(jié)構(gòu)，選用式(i-4)化合物作為連接子，式(i-4)化合物結(jié)構(gòu)的兩端為酰肼基團(tuán)，其兩端的酰肼基團(tuán)既具有親水性，又有疏水性，在酸性環(huán)境下，與β-雌二醇-6-一6-(o-羧甲基肟)、吖啶酸丙磺酸鹽或生物素上的羧酸基團(tuán)結(jié)合的效率與普通氨基和羧基結(jié)合的效率相比更高，且形成的酰肼鍵比酰胺鍵更穩(wěn)定，合成得到的雌二醇偶聯(lián)結(jié)構(gòu)也更穩(wěn)定。