專(zhuān)利名稱(chēng)：蛋白標(biāo)簽的聯(lián)合應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種新型的蛋白標(biāo)簽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
淀粉結(jié)合域(Starchbindin g domain, SBD)淀粉是植物的主要能源的儲(chǔ)存形式，同時(shí)也是人類(lèi)食物最重要的能源來(lái)源。從化學(xué)結(jié)構(gòu)看，淀粉可以分為直鏈淀粉和支鏈淀粉兩大類(lèi)。直鏈淀粉是由幾百個(gè)D-葡萄糖基以a-(l，4)糖苷鍵連接的葡聚糖，分子量較小，在50000左右；支鏈淀粉則由幾千個(gè)葡萄糖以α-(1，4)糖苷鍵連接為主鏈，并有α-(1，6)糖苷鍵連接作為分支點(diǎn)而形成的葡聚糖，分子量比直鏈淀粉大得多，在60000左右[I]。在天然淀粉中直鏈的占20% 26%，它是可溶性的，其余的則為支鏈淀粉。自然界存在很多催化淀粉降解的淀粉酶，在這些酶中大多具有淀粉結(jié)合區(qū)域(starch binding domain, SBD),如淀粉葡萄糖苷酶(glucoamylase,GA)、a-淀粉酶、β -淀粉酶、麥芽糖四糖水解酶、麥芽五糖水解酶、環(huán)化糊精葡萄糖轉(zhuǎn)移酶等。例如來(lái)源于米根霉菌(Rhizopus oryzae)的淀粉葡萄糖苷酶(RoGA)。GA是一種外切葡萄糖水解酶，能夠從淀粉的非還原水解釋放出β -D-葡萄糖，制糖工業(yè)上RoGA廣泛用于水解淀粉為葡萄糖漿。RoGA由C-端催化結(jié)構(gòu)域和N-端淀粉結(jié)合域(SBD)兩部分組成，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域通過(guò)O-型糖基化接頭連接。碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)(Carbohydrate-ActiveenZYmes Database, CAZY, http://www. cazy. org/)按照序列的同源性把 RoGA 的 SBD 歸類(lèi)到 CBMs (carbohydrate-binding modules)家族 21(RoGA CBM21)。從一級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)看，RoGA SBD含有106個(gè)氨基酸殘基，但是從二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)看，RoGASBD與其他SBD家族蛋白一樣具有保守的β折疊片段，并且組成類(lèi)似免疫球蛋白狀結(jié)構(gòu)，如圖13Α,從圖中可以明顯看到,RoGA SBD有兩個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)(ligand-binding sites),位點(diǎn)I由Tyr32，Phe58，Tyr67氨基酸殘基組成，位點(diǎn)2則包含Trp47，Tyr83，Tyr94氨基酸。正是由這六個(gè)帶有芳香族側(cè)鏈的氨基酸和糖環(huán)的疏水作用決定了 SBD結(jié)合底物的親和力和特異性[Chou, W. I.，et al. The family 21 carbohydrate binding module ofglucoamylase from Rhizopus oryzae consists of two sites playing distinct rolesin ligand binding. Biochem. J. (2006) 396，469-477]。RoGA SBD 整個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)含有 8 個(gè)反向平行的 β 折疊片段，分別是 β I (V9-Y16)，β 2 (F21-V27)，β 3 (V34-D42)，β 4 (I53-G60)，β 5 (Υ67-Α74), β 6(I79-V88), β 7 (Τ92-Ν95)和 β 8 (Y102-V104)，如圖 13Β。目前有很多純化蛋白標(biāo)簽如polyhistidine (Poly-His)，maltose-bindingprotein (MBP) glutathione S-transferase (GST),但是由于親和介質(zhì)造價(jià)昂貴，這些標(biāo)簽難以在工業(yè)化水平大規(guī)模使用。而淀粉分布廣，來(lái)源豐富，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，無(wú)毒，容易回收，具有被廣泛應(yīng)用的前景，作為一種很好親和分離的載體[L. J. Chen, C. Ford, Z. Nikolov.A dsorption to starch of a beta—galactosidase Fusion protein containing thestarch-binding regionof Aspergillus glucoamylase, Gene99 (1991) 121-126]。融合蛋白標(biāo)簽(fusion tag)技術(shù)
融合標(biāo)簽(fusion tag)技術(shù)是一種基于報(bào)告基因(reporter gene)的重組DNA技術(shù)，其主要的過(guò)程是在目的蛋白編碼基因的3’端或5’端融合某種特定的蛋白標(biāo)簽的編碼基因，通過(guò)合適的宿主來(lái)表達(dá)重組蛋白質(zhì)[Nilsson, J. , et al. , Affinity fusionstrategies for detection, purification, and immobilization of recombinantproteins. Protein Expr Purif, 1997. 11 (I) p. 1-16]。融合標(biāo)簽技術(shù)的發(fā)展最初是為了簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)的純化，即通過(guò)重組蛋白質(zhì)所含融合標(biāo)簽同固相介質(zhì)中配體的特異相互作用，實(shí)現(xiàn)重組蛋白質(zhì)的親和純化?，F(xiàn)有的融合標(biāo)簽系統(tǒng)如6-His，SUMO, Avi, FLAG, HA, GST, Halo,MBP, SNAP, c-Myc 等[Stevens, R. C. , Design of high-throughput methods of proteinproduction for structural biology. Structure, 2000. 8 (9) :p. R177-85]。根據(jù)其融合標(biāo)簽的特性表達(dá)重組蛋白質(zhì)，可以對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行分子標(biāo)記，便于目的蛋白的檢測(cè)和定向固定，方便對(duì)其進(jìn)行定位和追蹤，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和整體動(dòng)物體內(nèi)蛋白反應(yīng)過(guò)程的可視化；還可以與包被在固相基質(zhì)上的特異配基共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的固相化，方便后續(xù)的反應(yīng)以及重組蛋白質(zhì)的獲得和純化。另外隨著各種不同特性融合標(biāo)簽的不斷出現(xiàn)，融合標(biāo)簽串 聯(lián)的使用也日益增多?？傊?，融合蛋白標(biāo)簽技術(shù)已經(jīng)成為一種必不可少的研究工具，極大地促進(jìn)了生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。多數(shù)情況下，由于多肽標(biāo)簽相對(duì)較小，對(duì)融合蛋白結(jié)構(gòu)和活性影響很小，不需要從融合蛋白中切除，因而多肽融合標(biāo)簽較蛋白質(zhì)標(biāo)簽更為常用。融合標(biāo)簽的存在有時(shí)候會(huì)影響待研究蛋白的重要特性或功能。通常人們會(huì)在標(biāo)簽蛋白和目的蛋白之間引入一些特異性酶切位點(diǎn)，再通過(guò)相應(yīng)的蛋白酶切除標(biāo)簽蛋白，獲取目的蛋白。在融合標(biāo)簽切除過(guò)程中，許多蛋白質(zhì)要保持生物活性以及結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性都需要特定的N端氨基酸殘基。在細(xì)胞內(nèi)所有新合成的蛋白質(zhì)在其N(xiāo)端都是甲硫氨酸，然后經(jīng)過(guò)翻譯后加工修飾才形成其它不同的氨基酸。因此在融合標(biāo)簽切除過(guò)程中如何避免產(chǎn)生非天然N端氨基酸或產(chǎn)生特異的N端氨基酸，是很多蛋白酶使用過(guò)程中所要解決的重要困難[Marblestone, J. G. , et al.Comparison of SUMO fusion technology with traditionalgene fusion systems enhanced expression and solubility with SUMO. Protein Sci,2006. 15(1) p. 182-9]。蛋白酶雖然能將融合蛋白標(biāo)簽切除，但少量未除去的蛋白酶會(huì)對(duì)已純化的蛋白產(chǎn)生污染，從而影響蛋白的純度，還需要進(jìn)一步純化以去除切除反應(yīng)體系中殘留的蛋白酶。類(lèi)泛素小修飾蛋白(small ubiquitin-like modifier, SUM0)標(biāo)簽有多種普通融合蛋白標(biāo)簽不具備的優(yōu)點(diǎn)，首先SUMO作為分子伴侶幫助融合蛋白的正確折疊，從而增加融合蛋白的可溶性，穩(wěn)定性以及表達(dá)量。SUMO具有的高度保守類(lèi)似泛素的桶狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，即β折疊(sheet)-i3折疊-α螺旋-β折疊-β折疊-β折疊的高度折疊壓縮穩(wěn)定的球形結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域能夠提供目的蛋白正確折疊的核心，促進(jìn)目的蛋白的快速正確折疊。SUMO折疊后的球形結(jié)構(gòu)外部具有高度的親水性，內(nèi)部具有高度的疏水性，對(duì)原來(lái)溶解性不好的重組蛋白質(zhì)可以發(fā)揮類(lèi)似于去垢劑的作用[Mossessova, E. and C. D. Lima,Ulp1-SUM0 crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactionsand a regulatory element essential for cell growth in yeast. Mol Cell,2000. 5(5)p. 865-76]。SUMO標(biāo)簽融合蛋白可以通過(guò)特異的SUMO蛋白酶，如酵母去SUMO修飾的酶Ulpl高效地切除[Li, S. J. and M. Hochstrasser, A new protease required for cell-cycleprogression in yeast. Nature,1999. 398(6724) :p.246-51]。與泛素信號(hào)通路相似，所有的Ubls通過(guò)多個(gè)酶的級(jí)聯(lián)作用實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白特異位點(diǎn)的共價(jià)修飾，其中包括了 Ubl激活酶(El)，Ubl轉(zhuǎn)移酶(E2)和具有特異性的Ubl連接酶(E3)。在SUMO修飾的過(guò)程中，SUMO首先被El激活，然后通過(guò)SUMO轉(zhuǎn)移酶E2將SUMO結(jié)合到底物上，再通過(guò)E3結(jié)合到特定底物上，然而這也是個(gè)可逆的過(guò)程SUMO也可以被去SUMO化的酶SENPs從底物上解離下來(lái)。SUMO的激活酶El，包括了 SAEl和SAE2兩個(gè)亞基的異源二聚體[Hay, R. T. , SUMO :a history of modification. Mol Cell, 2005. 18(1) p. 1-12]。在SUMO的起始激活過(guò)程中，SAE1/SAE2通過(guò)在SUMO C端連接上 AMP實(shí)現(xiàn)腺苷化，通過(guò)AMP的水解使之與SAE2形成硫脂鍵，在SUMO的轉(zhuǎn)移反應(yīng)中，SUMO又被轉(zhuǎn)移到SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9 (E2)，Ubc9直接將SUMO的C端羧基與目的蛋白的賴(lài)氨酸ε氨基形成異肽鍵[Kerscher，0.，R. Felberbaum, and M. Hochstrasser, Modification of proteins by ubiquitin andubiquitin-like proteins. Annu Rev Cell Dev Biol, 2006. 22 :p.159-80]。與大部分的Ubls反應(yīng)過(guò)程相似，SUMO化過(guò)程經(jīng)過(guò)一系列中間體過(guò)程，通過(guò)切割生成C端的甘氨酸殘基，與目的蛋白的賴(lài)氨酸側(cè)鏈相連。這個(gè)過(guò)程通過(guò)SUMO特異性的蛋白酶催化完成，其中這些酶還可以將SUMO從已經(jīng)修飾的目的蛋白上除去。最早在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)SUMO特異的蛋白酶Ulpl和Ulp2，在細(xì)胞核孔和核質(zhì)中都有分布，并與細(xì)胞周期相關(guān)[Kim, K. I. , S. H. Baek, and C. H. Chung, Versatile protein tag, SUMO its enzymologyand biological function. J Cell Physiol,2002. 191(3) :p. 257-68]。生物信息學(xué)方法在人類(lèi)基因組中搜索到Ulpl蛋白酶的8個(gè)類(lèi)似物SENP1-8，它們?cè)贑端都有保守的催化結(jié)構(gòu)域，但SENP8是NEDD8特異性的蛋白酶。目前認(rèn)為SENP1-3是SUMO特異性的，SENPI-8和SUMO之間存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。目前的研究表明，SUMO化與蛋白分子的重定位[Kurepa, J. , et al. , The smallubiquitin-like modifier(SUMO)protein modification system in Arabidopsis.Accumulation of SUMOl and-2 conjugates is increased by stress. J Biol Chem,2003.278 (9) p. 6862-72 ；Lin,D. ,et al. ,Identification of a substrate recognitionsite on Ubc9. J Biol Chem, 2002. 277(24) :p. 21740-8]，與細(xì)胞周期以及目的蛋白穩(wěn)定性的維持，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，個(gè)體發(fā)育的調(diào)節(jié)等都有十分密切的聯(lián)系，對(duì)于目的蛋白的泛素化和磷酸化還存在競(jìng)爭(zhēng)性的拮抗抑制作用[Zhang, H.，et al.，SUMOmodification is requiredfor in vive Hex gene regulation by the Caenorhabditis elegans Polycomb groupprotein S0P-2. Nat Genet, 2004. 36(5) p. 507-11]。雖然目前對(duì)于 SUMO 的基本修飾機(jī)理有了一定的了解，然而對(duì)于其具體的目的蛋白選擇過(guò)程的特異性及修飾后的相關(guān)調(diào)控及功能，個(gè)體發(fā)育上SUMO化的重要性等仍有待進(jìn)一步研究。酶固相化技術(shù)酶作為一種特殊的生物催化劑，具有較高的選擇性和催化效率、反應(yīng)條件溫和、催化活性可以調(diào)節(jié)控制等優(yōu)點(diǎn)。但自由酶對(duì)所處環(huán)境十分敏感，在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫、高離子濃度和部分有機(jī)溶劑中均不夠穩(wěn)定，容易導(dǎo)致酶蛋白的變性，從而降低甚至喪失其催化活性。同時(shí)，自由酶反應(yīng)后不易與底物和產(chǎn)物分離，既影響反應(yīng)產(chǎn)物純度又難以重復(fù)使用，這很大程度限制了酶促反應(yīng)的廣泛應(yīng)用。固定化酶技術(shù)(Immobilized enzyme technology)克服了自由酶的上述不足，提高了酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，而且酶可以回收及重復(fù)使用。
酶的固定化方法可大致分為吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法等4種。固定化酶的性能主要取決于固定化方法和所使用的載體材料。其中，載體材料的性能直接影響其固定化酶的催化活性。酶的固定化對(duì)載體材料有很高的要求。設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)性能更優(yōu)的載體材料已成為固定化酶研究的重點(diǎn)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型的蛋白標(biāo)簽及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供淀粉酶的淀粉結(jié)合域(SBD)的用途，用于作為目的蛋白固相化的標(biāo)簽。在另一優(yōu)選例中，所述的淀粉酶的淀粉結(jié)合域是分離的。在本發(fā)明的另一方面，提供一種目的蛋白固相化的方法，所述方法包括(a)將目的蛋白與淀粉酶的淀粉結(jié)合域融合表達(dá)，獲得包含(較佳地從N端至C端)淀粉酶的淀粉結(jié)合域-目的蛋白的融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物；(b)將所述的表達(dá)產(chǎn)物與淀粉基質(zhì)(如淀粉樹(shù)脂，淀粉珠)相接觸(如流經(jīng)淀粉基質(zhì)柱)，從而淀粉酶的淀粉結(jié)合域-目的蛋白的融合蛋白被吸附到淀粉基質(zhì)表面，所述目的蛋白被固相化。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化步驟(a)中，將目的蛋白與淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白以及類(lèi)泛素小修飾·蛋白(SUMO)相融合表達(dá)，獲得包含(較佳地從N端至C端)淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-類(lèi)泛素小修飾蛋白-目的蛋白融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物；步驟(b)中，將所述的表達(dá)產(chǎn)物與淀粉基質(zhì)相接觸，從而淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-類(lèi)泛素小修飾蛋白-目的蛋白融合蛋白被吸附到淀粉基質(zhì)表面；之后，利用類(lèi)泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶從被吸附的淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-類(lèi)泛素小修飾蛋白-目的蛋白融合蛋白上切除目的蛋白，從而獲得純化的目的蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的類(lèi)泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶選自酵母泛素樣特異性蛋白酶I(Ulpl)或其活性片段。在另一優(yōu)選例中，所述的目的蛋白是能酶切蛋白(所述的蛋白上有酶切作用位點(diǎn))的酶步驟(a)中，將酶與淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白(片段)相融合表達(dá)，獲得包含(較佳地從N端至C端)淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶的表達(dá)產(chǎn)物；步驟(b)中，將所述的表達(dá)產(chǎn)物與淀粉基質(zhì)相接觸，從而淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶被吸附到淀粉基質(zhì)表面，獲得淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶復(fù)合物；之后，將待酶切的蛋白與淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶復(fù)合物接觸，從而待酶切的蛋白被酶切。在另一優(yōu)選例中，所述待酶切的蛋白是融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的酶是類(lèi)泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶；和所述的待酶切的蛋白是(較佳地從N端至C端)類(lèi)泛素小修飾蛋白-靶蛋白(外源蛋白)的融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的類(lèi)泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶選自酵母泛素樣特異性蛋白酶I(Ulpl)或其活性片段，去類(lèi)泛素化蛋白酶蛋白(SENP，如選自SENPl SENP8中任一蛋白)。在另一優(yōu)選例中，步驟(b)之后，還包括(C)加入潛在地可與目的蛋白相互作用的其它蛋白，觀察目的蛋白與其它蛋白的相互作用情況。在另一優(yōu)選例中，所述的目的蛋白是去類(lèi)泛素化蛋白酶(SENP)蛋白(如選自SENPl SENP8中任一蛋白，或其活性片段，如C端蛋白)，所述的其它蛋白是含有類(lèi)泛素小修飾蛋白序列的蛋白(如融合蛋白)，從而觀察去類(lèi)泛素化蛋白酶對(duì)于類(lèi)泛素小修飾蛋白序列的識(shí)別或切割特性。在另一優(yōu)選例中，所述的目的蛋白是對(duì)于蛋白的類(lèi)泛素小修飾蛋白化有用的酶(如SAEI，SAEII和/或Ubc9)，步驟(b)之后，還包括
加入底物蛋白；觀察在與所述對(duì)于蛋白的類(lèi)泛素小修飾蛋白化有用的酶接觸后，所述的底物蛋白的類(lèi)泛素小修飾蛋白化情況。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括篩選出發(fā)生類(lèi)泛素小修飾蛋白化的底物蛋白。在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有以下可操作性相連的元件(較佳地，從5’端至3’端)淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白編碼基因-類(lèi)泛素小修飾蛋白編碼基因-多克隆位點(diǎn)；所述的多克隆位點(diǎn)用于插入目的蛋白編碼基因。在本發(fā)明的另一方面，提供前述的表達(dá)載體的用途，用于表達(dá)、固相化及純化目的蛋白。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于表達(dá)、固相化及純化目的蛋白的試劑盒，其中包括用于將目的蛋白與類(lèi)泛素小修飾蛋白和淀粉結(jié)合域蛋白相融合表達(dá)，形成淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-類(lèi)泛素小修飾蛋白-目的蛋白融合蛋白的試劑；以及用于將目的蛋白與淀粉結(jié)合域蛋白-類(lèi)泛素小修飾蛋白相分離的試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中包括前述的表達(dá)載體；和/或類(lèi)泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶；和/或淀粉基質(zhì)；和/或宿主細(xì)胞；和/或蛋白重組表達(dá)試劑(如制備感受態(tài)細(xì)胞的試劑，轉(zhuǎn)化試劑，宿主細(xì)胞培養(yǎng)基，表達(dá)誘導(dǎo)劑，限制性?xún)?nèi)切酶，DNase或電泳試劑)；和/或蛋白純化試劑(如洗滌液，洗脫液或溶菌酶)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種融合蛋白，其包括淀粉酶的淀粉結(jié)合域，以及與之相連的選自下組的蛋白類(lèi)泛素小修飾蛋白，酵母泛素樣特異性蛋白酶1，去類(lèi)泛素化蛋白酶蛋白(如選自SENPl SENP8中任一蛋白)，對(duì)于蛋白的類(lèi)泛素小修飾蛋白化有用的酶(如SAEI，SAEII和/或Ubc9)，或它們的或其活性片段。在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有以下可操作性相連的元件淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白編碼基因，以及與之操作性相連的選自下組的蛋白的編碼基因類(lèi)泛素小修飾蛋白，酵母泛素樣特異性蛋白酶1，去類(lèi)泛素化蛋白酶蛋白(如選自SENPl SENP8中任一蛋白)，對(duì)于蛋白的類(lèi)泛素小修飾蛋白化有用的酶(如SAEI，SAEII和/或Ubc9)，或它們的活性片段。在本發(fā)明的另一方面，提供一種淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶，其包括淀粉基質(zhì)，以及吸附于淀粉基質(zhì)的淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶融合蛋白(較佳地淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白位于融合蛋白的N端)。在本發(fā)明的另一方面，提供 所述的淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶的用途，用于酶切蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的酶是類(lèi)泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶；和所述的待酶切的蛋白是(較佳地從N端至C端)類(lèi)泛素小修飾蛋白-靶蛋白(外源蛋白)的融合蛋白。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于酶切蛋白的試劑盒，其包括所述的淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶復(fù)合物；或者其包括淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶融合蛋白，以及淀粉基質(zhì)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。


圖I、淀粉結(jié)合域(SBD)編碼序列的人工合成的引物設(shè)計(jì)示意圖(318bp)。圖中，1-8 分別對(duì)應(yīng)于 Primerl_Primer8。F、R 分別對(duì)應(yīng)于 PrimerF、PrimerR0圖2、重疊PCR獲得的目標(biāo)基因SBD。M DNA Marker ;1 :引物1-4 PCR產(chǎn)物SBDl-4(166bp) ;2 :引物 5-8PCR產(chǎn)物 SBD5-8 (171bp) ;3:引物 1-8 PCR產(chǎn)物 SBD1-8 (316bp)；4 :帶有酶切位點(diǎn) Ndel/Nhel 的 SBD(342bp)。圖 3、EGFP 的純化。M :蛋白質(zhì) marker ；1 =Ulplc 從 SBD-SUMO-EGFP 切下來(lái)的 EGFP ；2 :留在淀粉珠上的SBD-SUMO ；3結(jié)合在淀粉珠上的SBD-SUMO-EGFP。圖4、JNK2的純化。M :蛋白marker I :結(jié)合在淀粉珠上的SBD-SUMO-JNK22 SBD-SUMO-JNK2 經(jīng) Ulpl 酶切結(jié)果。圖5、左圖為固相化Ulplc對(duì)SUM0-EGFP的催化反應(yīng)的SDS-PAGE。M :蛋白marker ；I :陰性對(duì)照，不加入游離Ulplc酶的200ngSUM0-EGFP底物。2 :陽(yáng)性對(duì)照，200ngSUM0_EGFP底物中加入2U的Ulplc 30°C反應(yīng)lh。3 :固定化的Ulplc活性檢測(cè)，200ngSUM0_EGFP底物中加入2U的SBD-Ulplc 30°C反應(yīng)lh。右圖為對(duì)左圖各泳道相應(yīng)的催化反應(yīng)的說(shuō)明。圖6、SBD-Ubc9 (SBDUbc9)，SBD-SAE1 (SBDSAE1)和(SBDSAE2)的固相化。M :蛋白質(zhì)Marker ；E :大腸桿菌細(xì)胞裂解的粗提物；F :穿出液；B :結(jié)合在淀粉珠。圖7、固相化SAEI，SAEII，Ubc9 的 SUMO化反應(yīng)的 Western Blot 檢測(cè)。以 Anti-flag作為抗體。Lane I :蛋白 Marker。Lane 2 :陰性對(duì)照，不加三個(gè)游離酶 SBDSAEI、SBDSAE2、SBDUbc9。Lane 3 :陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)加入三個(gè)游離酶SBDSAEI、SBDSAE2、SBDUbc9。Lane 4 :同時(shí)固相化 SAE1、SAE2、Ubc9 三個(gè)。Lane 5 =SBDSAEI 游離，SBDSAE2、SBDUbc9 固相化。
Lane 6 SBDSAE2 游離，SBDSAE1、SBDUbc9 固相化。Lane 7 SBDUbc9 游離，SBDSAEU SBDSAE2 固相化。Lane 8 :SBDSAEI、SBDSAE2 游離，SBDUbc9 固相化。Lane 9 SBDSAEK SBDUbc9 游離，SBDSAE2 固相化。LanelO :SBDSAE2、SBDUbc9 游離，SBDSAE1 固相化。圖8、Ulplc內(nèi)切酶活性。圖9、SENPlc內(nèi)切酶活性。圖10、SENP2c內(nèi)切酶活性。
圖11、SENP7c內(nèi)切酶活性。圖12、SENP8內(nèi)切酶活性。圖13A、來(lái)源不同的SBD氨基酸序列比對(duì)示意圖。圖13B、RoGA SBD拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)示意圖。左圖是RoGA SBD的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖，不同顏色標(biāo)有數(shù)字的箭頭條帶是不同的β折疊片段；右圖是RoGA SBD的三維晶體結(jié)構(gòu)示意圖，圖中標(biāo)記的氨基酸Υ32，W47，Υ67，Υ58，Υ83，Υ93，Υ94，這些芳香族氨基酸位于SBD和底物的結(jié)合位點(diǎn)。圖14、SBD和SUMO標(biāo)簽的聯(lián)用示意圖。圖15、固相化Ulpl催化反應(yīng)體系示意圖。圖16、SBD固相化SENPs反應(yīng)體系。圖17、三個(gè)酶同時(shí)固相化酶催化反應(yīng)體系示意圖。圖18、基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移的快速篩選SENPs酶活性及其激動(dòng)劑或抑制劑的方法。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛的研究，開(kāi)發(fā)了一種全新的蛋白標(biāo)簽——淀粉結(jié)合域(StarchBinding Domain, SBD)，目的蛋白在與該SBD融合后，由于SBD能夠很好地與淀粉基質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，可良好地應(yīng)用于目的蛋白的固定化或目的蛋白的純化，還可應(yīng)用于觀察目的蛋白與其它蛋白的相互作用。經(jīng)驗(yàn)證，所述的SBD是一種廉價(jià)而可靠的標(biāo)簽蛋白。術(shù)語(yǔ)如本文所用，所述的“標(biāo)簽”是指蛋白標(biāo)簽，其通常與其它蛋白融合表達(dá)，用于分離、鑒定或純化蛋白。如本文所用，所述的“淀粉酶的淀粉結(jié)合域(SBD) ”是指來(lái)源于淀粉酶的一段蛋白片段，其是在淀粉酶中發(fā)揮與淀粉相互結(jié)合作用的結(jié)構(gòu)。SBD作為一種蛋白標(biāo)簽，不管是處于融合蛋白的C端還是N端，都不影響其作為標(biāo)簽的作用。如本文所用，所述的“固相化”或“固定化”可互換使用，是指目的蛋白固定于特定的固相基質(zhì)或固相載體上的過(guò)程。如本文所用，所述的淀粉基質(zhì)是指原始淀粉(直鏈淀粉或支鏈淀粉)或商品化的淀粉樹(shù)脂或淀粉珠(淀粉beads,或簡(jiǎn)稱(chēng)beads)。所述的淀粉基質(zhì)可良好地吸附和固定所述的淀粉酶的淀粉結(jié)合域，該吸附是非共價(jià)的特異性吸附。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“含有”、“包括”或“具有”包括了“包含”、“主要由......構(gòu)成”、“基本上由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”。淀粉結(jié)合域SBD是來(lái)源于淀粉酶的一段蛋白片段，其是在淀粉酶中發(fā)揮與淀粉相互結(jié)合作用的結(jié)構(gòu)。自然界存在很多催化淀粉降解的淀粉酶，在這些酶中大多具有SBD，如淀粉葡萄糖苷酶(GlucoAmyIase,GA)、α -淀粉酶、β -淀粉酶、麥芽糖四糖水解酶、麥芽五糖水解酶、環(huán)化糊精葡萄糖轉(zhuǎn)移酶等。例如，本發(fā)明實(shí)施例中的SBD來(lái)源于米根霉菌(Rhizopus oryzae)的淀粉葡萄糖苷酶(RoGA)，其具有NCBI protein entry :ABB77799所示的氨基酸序列(其中SBD結(jié)構(gòu)域位于第26 (A)-131 (T)位)。SBD的經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)(如1-20個(gè)，較佳地1-10個(gè)，更佳地1_5個(gè)，如2個(gè)，3個(gè))
氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的變異形式也包括在本發(fā)明中。其變異形式包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實(shí)施，并且確保不改 變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認(rèn)識(shí)到，一般來(lái)說(shuō)，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個(gè)氨基酸基本上不會(huì)改變生物活性。所述的SBD標(biāo)簽可應(yīng)用于與目的蛋白融合，從而分離或固定該目的蛋白。SBD作為一個(gè)純化標(biāo)簽，能夠很好地和淀粉基質(zhì)進(jìn)行結(jié)合。SBD標(biāo)簽與目的蛋白的融合蛋白能夠和淀粉基質(zhì)有效的結(jié)合，而且這種結(jié)合是特異性的。SBD標(biāo)簽與淀粉基質(zhì)的結(jié)合可以被麥芽糖(如濃度為Ι-lOOmM，較佳地2-50mM，更佳地5_20mM)洗脫。SBD有自身的優(yōu)勢(shì)如強(qiáng)大的結(jié)合能力和較好的結(jié)合容量，簡(jiǎn)便的洗脫過(guò)程，廉價(jià)而又易得的結(jié)合基質(zhì)等。SBD標(biāo)簽和SUMO標(biāo)簽共同應(yīng)用于目的蛋白的表達(dá)純化本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，揭示了通過(guò)SBD和SUMO 二者的聯(lián)合應(yīng)用來(lái)進(jìn)一步的優(yōu)化重組蛋白分離和純化的過(guò)程的方法。SBD和SUMO作為不同的蛋白融合標(biāo)簽，各有其自身的特點(diǎn)，SBD和SUMO的聯(lián)用，一方面利用SBD與淀粉基質(zhì)強(qiáng)大的親和結(jié)合能力，簡(jiǎn)單的一步化洗脫去除非目的蛋白，另一方面利用SUMO在重組蛋白表達(dá)過(guò)程中的促溶效果，其在C末端切除并在目的蛋白的N-末端不殘留氨基酸殘基的特點(diǎn)，簡(jiǎn)單快速地獲得不帶任何多余氨基酸殘基的目的蛋白。SBD和SUMO 二者的聯(lián)合應(yīng)用的原理如圖14，N端的SBD標(biāo)簽作為固相化標(biāo)簽可以和淀粉基質(zhì)特異性結(jié)合，融合的SUMO標(biāo)簽可以提高目的蛋白的表達(dá)量和可溶性。利用SUMO蛋白酶(Ulpl或Uplc)對(duì)SUMO的特異性切割，可以在固相化之后將目的蛋白切下獲得不含N端殘基的天然蛋白，而SBD和SUMO標(biāo)簽仍將留在淀粉基質(zhì)上。SUMO能夠在蛋白表達(dá)中形成一個(gè)很好的折疊核心，有利于重組融合蛋白的構(gòu)象形成。同時(shí)SUMO能夠被SUMO蛋白酶特異性的識(shí)別并切割，這樣的切割過(guò)程能夠獲得N端不含有任何多余氨基酸殘基的目標(biāo)蛋白。本發(fā)明的實(shí)例證明，SUMO蛋白酶Uplc的確能從固相化的SBD-SUMO融合蛋白上將目標(biāo)蛋白切下，從而快速完成蛋白純化過(guò)程。SUMO的經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)(如1-20個(gè)，較佳地1_10個(gè)，更佳地I_5個(gè)，如2個(gè)，3個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的變異形式也包括在本發(fā)明中。其變異形式包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實(shí)施，并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認(rèn)識(shí)到，一般來(lái)說(shuō)，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個(gè)氨基酸基本上不會(huì)改變生物活性。SUMO的各種同源物也可被應(yīng)用于本發(fā)明的方法中。SBD標(biāo)簽應(yīng)用于固相化基于SBD標(biāo)簽可良好地與目的蛋白融合表達(dá)，以及其與淀粉基質(zhì)具有強(qiáng)大的親和結(jié)合能力且易于被洗脫，其可良好地用于對(duì)各種目的蛋白進(jìn)行固相化。所述的目的蛋白沒(méi)有特別的限制，如各種酶、功能蛋白。所述的目的蛋白也包括一些蛋白片段或活性結(jié)構(gòu)域。SBD也可應(yīng)用于觀察蛋白之間的相互作用，把一種或多種蛋白固定于淀粉基質(zhì)上，加入另一種或多種蛋白，觀察這些蛋白之間的相互作用。例如將酶固定于淀粉基質(zhì)上，加入反應(yīng)底物，來(lái)觀察酶催化作用。反應(yīng)的底物也可以有多種的選擇，相信該系統(tǒng)能夠被廣泛應(yīng)用于酶催化反應(yīng)，高通量篩選，蛋白純化等一系列領(lǐng)域中。 所述的SBD可應(yīng)用于酶的固相化。本發(fā)明已經(jīng)證明，在SBD固相化酶催化反應(yīng)體系中，固相化酶并進(jìn)行固相化酶催化反應(yīng)時(shí)，可取得比較滿(mǎn)意的催化效果。重組表達(dá)且固相化的酶相比于天然構(gòu)象純化后的酶來(lái)說(shuō)，仍然具有較好的反應(yīng)活性和反應(yīng)效率。固定化酶有個(gè)優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)簡(jiǎn)單離心就可以終止反應(yīng)，也利于可后續(xù)反應(yīng)或者檢測(cè)過(guò)程。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，利用SBD作為一個(gè)固相化標(biāo)簽，與SUMO蛋白酶(如Ulpl或Ulplc)融合表達(dá)，將SUMO蛋白酶特異性地固相化到淀粉基質(zhì)上。固相化SUMO蛋白酶可對(duì)帶SUMO標(biāo)簽的融合蛋白進(jìn)行酶催化切割反應(yīng)，從而獲得N-末端與天然構(gòu)象一樣的目的蛋白。一種原理示意圖如圖15所示，首先重組表達(dá)的SBD-Ulpl的融合蛋白，可以通過(guò)與淀粉樹(shù)脂混合獲得所需的固相化Ulpl酶，在固相化的Ulpl介質(zhì)體系中加入感興趣的含有SUMO融合標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白，在低溫條件下(4°C 37°C)進(jìn)行酶催化切割反應(yīng)，從而獲得有天然N端的目標(biāo)蛋白。在此過(guò)程中，由于SBD與淀粉的高度親和結(jié)合能力，固相化的Ulpl的獲得變的十分簡(jiǎn)單，不需要通過(guò)繁瑣的制備純化過(guò)程。在對(duì)SUMO融合重組蛋白進(jìn)行切割反應(yīng)的過(guò)程中，由于Ulpl的固相化，Ulpl不會(huì)或極少進(jìn)入到反應(yīng)的流動(dòng)液相中，從而可以避免酶對(duì)后面可能進(jìn)行的反應(yīng)和檢測(cè)的影響。另一方面，酶催化反應(yīng)后，Ulpl溫和反應(yīng)條件能保持Ulpl活性和目標(biāo)蛋白的構(gòu)象，因而固相化的酶體系經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的洗滌步驟可以多次反復(fù)的使用，減少重復(fù)純化目標(biāo)蛋白的流程，降低了成本提高了效率。這些優(yōu)點(diǎn)為該系統(tǒng)的商業(yè)化應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。通過(guò)淀粉珠一步親和固定Ulpl酶，并且切割SUMO的酶催化反應(yīng)，可以觀察到與游離狀態(tài)下的Ulpl類(lèi)似的活性。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，利用SBD作為一個(gè)固相化標(biāo)簽，在酵母中，僅有一種，稱(chēng)為SUMO ;而在哺乳動(dòng)物中，有四種分別為SUM01，SUM02, SUM03, SUM04,同時(shí)有6種去SUMO化修飾的酶，分別是SENP1，SENP2，SENP3, SENP5, SENP6, SENP7。這種酶具有內(nèi)切酶和異肽酶兩種活性。目前系統(tǒng)性分析SENPs識(shí)別SUMO的特異性的研究少有報(bào)道。利用SBD固相化的特性，本發(fā)明人固相化了 SENPs的C-端催化結(jié)構(gòu)域，并在體外進(jìn)行了酶切反應(yīng)，系統(tǒng)性地分析SENPs對(duì)SUMO識(shí)別的特點(diǎn)。如圖16，融合表達(dá)的SBD-SENPs與淀粉樹(shù)脂混合，固定在淀粉樹(shù)脂上，再與ECFP-SUMOs-EYFP反應(yīng)，很容易檢測(cè)到SENPs酶切活性和特異性。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，利用SBD作為一個(gè)固相化標(biāo)簽，應(yīng)用于固相化酶體外檢測(cè)SUMO化反應(yīng)體系。除了生物信息學(xué)對(duì)氨基酸序列的分析預(yù)測(cè)SUMO化底物外，急需一種高通量的篩選能夠被SUMO化的蛋白的方法。在體外，SUMO化的反應(yīng)需要一些酶的協(xié)同參與，SPEl (SAEI/SAEII)和E2 (Ubc9)。本發(fā)明人將多個(gè)酶同時(shí)進(jìn)行固相化并進(jìn)行相關(guān)催化反應(yīng)，如圖17。SUMO化反應(yīng)需要SAEI，SAEII, Ubc9三個(gè)酶的協(xié)同作用，將三個(gè)酶同時(shí)固相化，在固相化體系中加入底物蛋白和SUM0，從而能在流出液中檢測(cè)到被SUMO化的底物蛋白。該方法可應(yīng)用于篩選出被SUMO化的蛋白。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(I)首次揭示了一種全新的蛋白標(biāo)簽SBD，目的蛋白在與該SBD融合后，由于SBD能夠很好地與淀粉基質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，可良好地應(yīng)用于目的蛋白的固定化或目的蛋白的純化， 還可應(yīng)用于觀察目的蛋白與其它蛋白的相互作用。(2)與其他一些親和載體如最常見(jiàn)的Ni-NTA樹(shù)脂，Protein A樹(shù)脂等相比較，原始淀粉或相關(guān)商品化淀粉樹(shù)脂是一種非常廉價(jià)的基質(zhì)。這些特點(diǎn)使得SBD可以作為一種較經(jīng)濟(jì)和實(shí)用的新型蛋白質(zhì)標(biāo)簽。(3) SBD固相化酶催化反應(yīng)對(duì)于工業(yè)化酶的應(yīng)用有較好的商業(yè)前景。尤其是對(duì)目標(biāo)蛋白純度要求不是很高的重組蛋白(80%純度)的工業(yè)用酶，可以大量地節(jié)約成本。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)驗(yàn)材料與方法菌種、細(xì)胞系和載體菌株E.coli DH5 a，E. coli BL21 (DE3)。細(xì)胞株HEK293T(ATCC)。質(zhì)粒和DNA pET28a (自帶 His 標(biāo)簽，Novagen), pEGFP-Cl (Clontech)。主要試劑酶類(lèi)各種限制性?xún)?nèi)切酶(NEB)，Pfu DNA聚合酶(上海生工)，T4 DNA連接酶(Invitrogen)。試劑盒類(lèi)質(zhì)粒抽提QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN),膠回收試劑盒 QIAEX
IIGel Extraction Kit(QIAGEN)0化學(xué)試劑蛋白胨，酵母提取物(OXOID);常用無(wú)機(jī)鹽無(wú)特別注明均來(lái)自上海國(guó)藥集團(tuán)，有機(jī)鹽無(wú)特別注明均購(gòu)自Sigma。分子量Marker:IOObp DNA Marker (Bio-Rad) ； Ikb DNA Marker (Bio-Rad);蛋白質(zhì)分子量Marker (上海生化細(xì)胞所)；預(yù)染蛋白質(zhì)分子量Marker(Bio-Rad)。培養(yǎng)基和溶液
LB培養(yǎng)基
蛋白胨IOg
酵母抽提物5g
NaClIOg
加 dH20 至IOOOml
pH7.0滅菌(121。〇，20min)。氨節(jié)青霉素鈉Amp (100mg/ml)滅菌dH205mlAmp 粉末0. 5g工作濃度100yg/ml。LBA 培養(yǎng)基在LB培養(yǎng)基中，加Amp，終濃度為100 μ g/ml。LB瓊脂平板培養(yǎng)基在LB培養(yǎng)基中加入I. 2%瓊脂粉，高壓滅菌15分鐘，冷卻至60 °C左右，加入Amp (終濃度為 100 μ g/ml)。TE緩沖液Tris · Cl (pH8. O)10mmol /I,EDTA (pH8.0)lmmol/L。DNA電泳試劑50 X TAE 冰乙酸57. ImlO. 5mol/L EDTA (ρΗ8· O) IOOml加dH20 至1000ml。6 X加樣緩沖液溴芬藍(lán)0.25%二甲苯青0.25%甘油30%。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑30%膠貯備液
丙烯酰胺30g
N，N’-亞甲基丙烯酰胺0.8g加 dH20 至IOOOml
過(guò)濾(0·45μηι)4°C 保存。積層膠緩沖液(Tris· C1/SDS)Tris · Cl (ρΗ6· 8) O. 5mol/L
SDSO. 4% (w/v)。于4°C可保存I個(gè)月。分離膠緩沖液(Tris· C1/SDS)
Tris Cl(pH8.8)1.5 mol/L
SDS0.4%(w/v)
于4°C可保存I個(gè)月
過(guò)硫酸銨10%(w/v)N, N, N，N，-四甲基乙二胺(TEMED)。2X樣品緩沖液4X Tris · Cl/SDS, pH6. 8 (O. lmol/L)25ml
甘油[20%(w/v)]20ml
SDS[4%(w/v)]4g
DTT3.Ig
溴芬藍(lán)
10 mg加dH20至IOOml并混勻，等量分裝成Iml于_20°C貯存。電泳緩沖液(5 X貯存液)
Tris base15.Ig
甘氨酸72g
SDS5g
加 dH20 至IOOOml脫色液甲醇冰乙酸水=4. 5 I 4. 5(體積比)染色液在脫色液中加入O. 25%考馬斯亮藍(lán)R250并用Whatman I號(hào)濾紙過(guò)濾染液。感受態(tài)細(xì)菌所需試劑液體SOB培養(yǎng)基
蛋白胨20g/L
酵母抽提物5 g/L
NaCl0.6 g/L
KCl0.5 g/L滅菌。用前加 入IM MgCl2 至終濃度 IOmM
IM MgSO4 至終濃度 10mM。Buffer I
RbCl (IOOmM)12 g/L
MnCl2-4H20 (5OmM) 9.9 g/L CaCl2-2H20 (I OmM) 1.5 g/L Glycerol (15%)150 g/L
KAc (3OmM)2.94 g/L10% HAc調(diào)節(jié)pH至5. 8，過(guò)濾除菌，4°C保存。Buffer 2
0.5M MOPS(pH 6.8) (IOmM) 20 ml/L RbCl (IOmM)1.2 g/L
CaCl2-2H20 (75mM)11 g/L
Glycerol (15%)150 g/L過(guò)濾除菌，4°C保存。固相化所需試劑Buffer
Tris-HCl (pH7.4)20mM
NaCl200mM
EDTAImM
β巰基乙醇10mM。鎳柱純化試劑裂解緩沖液(pH 8. O)
NaH2PO45 OmM
NaCl3 OOmM Imidazole IOmM Pmercaptoethanol IOmM glycerol 10%。洗滌緩沖液(pH 8. O)NaH2PO45 OmM
NaCl3 OOmM Imidazole 20mM Pmercaptoethanol IOmM glycerol 10%。
洗脫緩沖液(pH 8.0)
NaH2PO45 OmM
NaCl3 OOmM
Imidazole250mM
PmercaptoethanolIOmM
glycerol10%。SUMO化所需試劑SUMO化反應(yīng)緩沖液SI DTT2mMATP5mMTris-HCl (pH7. 4)20mM。水解SUMO 反應(yīng) buffer
Tris-HCl, pH 8.050 mM
Igepal (NP-40)0.2%
NaCl150 mM
DTTImMWestern Blot 所需試劑5X Western Blot 電轉(zhuǎn)移緩沖液 5L Tris 145. 2g, Gly 73. 2g。IOX TTBSTris200mMNaClI. 5NTween200.5%。SBD (Starch binding domain)目標(biāo)序列的獲得I、分步重疊 PCR 法擴(kuò)增目的片段 Starch binding domain (SBD)如圖I設(shè)計(jì)淀粉結(jié)合域(SBD)編碼序列的人工合成引物。引物PrimerKSEQ ID NO 2) :5’ATGGCGAGCA TTCCGAGCAGCGCGAGCGTGC AGCTGGATAGCTATAACTAT GATGGCA 3’Primer2(SEQ ID NO :3) :5’AATGTTTTTC ACATAAATTT TGCCGCTAAAGGTGCTGCCATCATAGTTAT AGCTATCCA 3’primer3(SEQ ID NO :4) :5’ CGGCAAAATT TATGTGAAAAACATTGCGTA TAGCAAAAAAGTGACCGTGG TGTATGCGG 3’Primer4(SEQ ID NO :5) :5’ CCGCAATAAT GTTGCCGTTG TTGTTCCAGTTATCGCTGCCATCCGCATAC ACCACGGTC 3’Primer5(SEQ ID NO :6) :5’AACGGCAACA TTATTGCGGCGAGCTTTAGC GGCCCGATTAGCGGCAGCAA CTATGAATA 3’Primer6(SEQ ID NO :7) :5’ATTCTTTAAT GCCTTTCACG CTCGCGCTAAAGGTCCAATATTCATAGTTG CTGCCGCTA 3’
Primer7(SEQ ID NO :8) :5’AGCGTGAAAG GCATTAAAGAATTTTATATT AAATATGAAGTGAGCGGCAA AACCTATTA 3’Primer8(SEQ ID NO :9) :5’GGTGCTCACC TGATAGTTCG CGCTGTTGTTGTTATCATAATAGGTTTTGC CGCTCACT 3’Primer F(SEQ ID NO :10) :5’ GGAATTCCATATGGCGAGCATTCCGAGCAG 3，，下劃線(xiàn)為NdeI識(shí)別位點(diǎn)Primer R :5’ GCCTAGCTAGCGGTGCTCACCTGATAGTTCG 3’ (SEQID NO :11)，下劃線(xiàn)為NheI識(shí)別位點(diǎn)a. PCR反應(yīng)體系I) SBD (1-4)片段模板(Primer2，3)各 I μ I ;Primer F/R (Primer1,4) 各 0· 2 μ I ;Pfu 酶I μ I ;IOXPfu 緩沖液5μ1;dNTP I μ I ；ddH20 41. 6μ I ；2) SBD (5-8)片段模板(Primer6,7)各 I U I ;Primer F/R (Primer5,8) 各 0. 2 μ I ;Pfu 酶I μ I ;IOXPfu 緩沖液5μ1;dNTP I μ I ；ddH20 41. 6μ I ；b.PCR 程序95 °C, 5min — (94 °C,30sec — 62 °C,30sec — 72 °C,40sec) X 25 — 72°C，IOmin — 4°C。2、分段 PCR 產(chǎn)物的膠回收(QIAEX II Gel Extraction Kit 150):參照 QIAGEN 產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。3、二次 PCR將前面PCR反應(yīng)得到的純化好的2個(gè)片段SBD (1-4)和SBD (5-8)繼續(xù)作為模板再次進(jìn)行PCR反應(yīng)，并將反應(yīng)得到的目的基因SBD。
a.反應(yīng)體系模板(SBDI-4, SBD5-8)各 I μ I ;Primer F/R各 I μ I ;Pfu 酶I μ I ;IOXPfu buffer 5 μ I ；
dNTP I μ I ；ddH20 39 μ I ;b. PCR 程序95 °C, 5min — (94 °C,30sec — 65 °C,30sec — 72 °C,45sec) X25 — 72 °C,IOmin — 4°C。在按前述膠回收步驟進(jìn)行純化回收得到目的基因。His-SBD-tagged原核表達(dá)載體的構(gòu)建前述得到目的基因片段SBD經(jīng)過(guò)NdeI和NheI雙酶切定向克隆到原核表達(dá)載體pET28a(自帶 His tag)，構(gòu)建 pET28aHis_SBD 通用載體。對(duì)構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，確認(rèn)目的片段正確插入載體，并委托美季公司進(jìn)行序列測(cè)定。pET28a His-SBD-target gene 表達(dá)載體的構(gòu)建分別設(shè)計(jì)四對(duì)引物1-8，用于構(gòu)建質(zhì)粒pET28aHis-SBD-ULPlc (引物I和 2)，pET28aHi s-SBD-SAEI (引物 3 和 4)，pET28aHis-SBD_SAE2 (引物 5 和 6)，PET28aHis-SBD-Ubc9 (引物7和8)，下劃線(xiàn)為NheI識(shí)別位點(diǎn)或XhoI識(shí)別位點(diǎn))引物I :5’ CTAGCTAGCCTTGTTCCTGAATTAAATGA 3’ (SEQ ID NO 12)引物2 :5’ CCGCTCGAGCTATTTTAAAGCGTCGGTTA 3’ (SEQ ID NO 13)引物3 :5，CGGAATTCGCTAGCATGGTGGAGAAGGAGGAGGCTGG 3，(SEQID NO 14)引物4 :5’ CCGCTCGAGTCACTTGGGGCCAAGGCACT 3’ (SEQ ID NO 15)引物5 :5，CGGAATTCGCTAGCATGGCACTGTCGCGGGGGCTG 3，(SEQID NO 16)引物6 :5’ CCGCTCGAGTCAATCTAATGCTATGACATCATC 3，(SEQ IDNO 17)引物7 :5’ CGGAATTCGCTAGCATGTCGGGGATCGCCCTCAGCAG 3’ (SEQ ID NO: 18)引物8 :5’ CCGCTCGAGTTATGAGGGCGCAAACTTCTTG 3’ (SEQ ID NO: 19)。用上述引物從相應(yīng)的模板質(zhì)粒pET28Ulplc(購(gòu)自廣州復(fù)能基因公司)，pET28SAEl (購(gòu)自廣州復(fù)能基因公司)，pET28 SAE2 (購(gòu)自廣州復(fù)能基因公司)，pET28Ubc9 (購(gòu)自廣州復(fù)能基因公司)通過(guò)PCR擴(kuò)增得到相應(yīng)目的基因片段。這些插入片段經(jīng)過(guò)NheI和XhoI雙酶切，克隆到前述構(gòu)建的通用載體pET28a His-SBD的相應(yīng)位點(diǎn)內(nèi)，從而得到N端帶有SBD標(biāo)簽的融合克隆。Ulp I的Genbank登錄號(hào)為ΝΜ_001183834，截取其羧基端的催化結(jié)構(gòu)域403L-621K，稱(chēng)為UlplCopET28a His-SBD-SUMO-target gene 表達(dá)載體的構(gòu)建I、pET28a His-SBD-SUMO 構(gòu)建Primer F :5’ CTAGCTAGCGGGTCGGACTCAGAAGTCAATCA 3’ (SEQ IDNO :20)下劃線(xiàn)序列NheI識(shí)別位點(diǎn)；
Primer R5fCCCAAGCTTGGTCTCTACCTCCAATCTGTTCGCGGTGA 3，(SEQ ID NO :21)下劃線(xiàn)序列BsaI識(shí)別位點(diǎn)；用上述引物，以pReCeiVer-B12質(zhì)粒(廣州復(fù)能基因公司)為模板，擴(kuò)增獲得酵母SUMO基因(GenBank登錄號(hào)NM_001180818(SUM0蛋白全長(zhǎng)101個(gè)氨基酸，此處獲得的是第1-98位的氨基酸的編碼基因))，以NheI和BsaI酶切后插入到經(jīng)過(guò)同樣酶切的通用載體pET28a His-SBD 中，得到 pET28a His-SBD-SUMO 載體。2、pET28a His-SBD-SUMO-target gene 構(gòu)建分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物1-2和3-4，從模板質(zhì)粒ToplEGFP(購(gòu)自廣州復(fù)能基因公司)和pET28a JNK2(購(gòu)自廣州復(fù)能基因公司)PCR擴(kuò)增得到目的片段EGFP和JNK2。然后以BsaI和XhoI酶切后插入到經(jīng)過(guò)同樣酶切的pET28a His-SBD-SUMO載體，構(gòu)建得到N端帶有SBD-SUMO 聯(lián)合標(biāo)簽的質(zhì)粒 pET28aHis-SBD-SUM0-EGFP，pET28a His-SBD_SUM0-JNK2。EGFP 和JNK2擴(kuò)增引物如下所示引物I :5，GTGGGGTCTCCAGGTATGGCTAGCGTGAGCAAGGG 3，(SEQID NO 22)引物2 :5，CGAATTCTCGAGTCACTTGTACAGCTCGTCCATGC3’ (SEQID NO 23)引物3 :5，GAATTCGGTCTCTACCTATGAGCGACAGTAAATGT 3，(SEQID NO 24)引物4 :5’ CCGCTCGAGTTATCGACAGCCTTCAAG 3’ (SEQ ID NO 25)下劃線(xiàn)BsaI識(shí)別位點(diǎn)或XhoI識(shí)別位點(diǎn)。3、SBD-SENPs 和 ECFP-SUMOs-EYFP 載體構(gòu)建本發(fā)明人克隆了 SENPs C-端催化結(jié)構(gòu)域SENPlc (419_643aa)，SENP2c(363-589aa), SENP3c (353-574aa), SENP5c(536-755aa), SENP6c(628-1112aa)，SENP7c (640-984aa)以及SENP8的編碼基因片段，以上結(jié)構(gòu)域的序列及位點(diǎn)的計(jì)算基于以下 GenBank 登錄號(hào)的序列SENP1 ΝΜ_014554 ；SENP2 NM_021627 ；SENP3 NM_015670 ；SENP5 NM_152699 ；SENP6 NM_001100409 ；SENP7 NM_020654 ；SENP8 AF308450,這些片段都具有全長(zhǎng)蛋白的酶活性。將上述SENP結(jié)構(gòu)域的編碼基因的片段克隆到N-His-SBD的B01. I載體(廣州復(fù)能基因有限公司)；為了更好地檢測(cè)SENPs的酶切酶活性，設(shè)計(jì)以下幾種底物ECFP-SUM01-EYFP，ECFP-SUM02-EYFP，ECFP-SUM03-EYFP，ECFP-SUM04-EYFP，克隆到 B01. I載體當(dāng)中。底物設(shè)計(jì)方法如下利用KpnI和XhoI把EYFP編碼序列(參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)FJ493465)克隆到B01. I載體得到B01. I EYFP ;再利用XmnI和KpnI別將SUMOl編碼序列(參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)NM_003352)，SUM02編碼序列(參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)NM_006937)，SUM03編碼序列(參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)NM_006936)，SUM04編碼序列(參見(jiàn) GenBank 登錄號(hào)NM_001002255)克隆到 B01. IEYFP 得到 B01. 1SUM0-EYFP ;再利用 XmnI將ECFP編碼序列(參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)FJ524330)克隆到B01. 1SUM0-EYFP得到相應(yīng)的B01. 1ECFP-SUM0-EYFP。RbCl感受態(tài)細(xì)胞的制備(I)將 DH5 α 菌種劃線(xiàn)到 LB 平板，37°C，10_12h ；(2)挑單克隆于30ml S. O. B中，37°C，培養(yǎng)過(guò)夜;(3)按 I 100 接過(guò)夜菌到 200ml S. O. B 中，37°C，培養(yǎng)至 0D550 = O. 35，約 2 小時(shí)；
(4)把菌液迅速轉(zhuǎn)移至冰鹽浴(_3 _5°C )中，預(yù)冷15min ( 3分鐘輕輕搖動(dòng)一次)，同時(shí)預(yù)冷500ml離心杯；(5)預(yù)冷離心機(jī)；(6)把菌液迅速轉(zhuǎn)移至500ml離心杯中；(7) 4500rpmX 5min, 4°C,棄上清；(8)加 4X16ml Bufferl,輕混,懸浮,冰鹽浴中 15min ;(9) 4000rpmX 5min, 4°C,棄上清；(10)加 4X4ml Buffer2，懸浮細(xì)胞，至冰上；
(11)立即分裝成200 μ I/管(管預(yù)冷)；(12)液氮速凍；(13)-70Γ保存。轉(zhuǎn)化(I)將5 μ I連接產(chǎn)物加入RbCl感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后冰上放置30min。(2) 42°C溫浴 2min，冰浴 2min。(3)加入 Iml LB，37t^jam45min lh。(4) 6，OOOrpm離心lmin，棄上清，留下約100 μ I液體將沉淀懸浮，吸出液體鋪盤(pán)。(5)倒置放于37 °C培養(yǎng)箱中12 15h。蛋白表達(dá)和溶解性測(cè)試融合蛋白在E. coli中表達(dá)重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，接種單克隆菌落于LB培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)12 14小時(shí)；取上述培養(yǎng)菌液按I : 100比例接種于新鮮的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至OD6tltl為O. 6 O. 8，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，22°C培養(yǎng)16-20h。6000rpm離心收集菌體。將菌體溶于含有O. 5mg/ml溶菌酶的破菌緩沖液中，液氮凍融，反復(fù)三次，加入DNase I至終濃度為25mg/ml以及MgSO4至終濃度20mM，冰上消化至不粘，高速離心(18000rpm/min)后取上清S，沉淀P和全菌W，未誘導(dǎo)全菌Neg分別取樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。His tag鎳柱純化用5mL的裂解緩沖液重懸50mL離心收的菌(含有目的蛋白)，加入溶菌酶至終濃度lmg/ml，冰上放置30分鐘；超聲每3秒一次間隔10秒，功率200W，一共40次；如果超聲后裂解液比較黏稠，加入RNase A(10ug/ml)和DNase I (5ug/ml)冰上消化15分鐘；4°C,IOOOOg離心30分鐘，保留上清；上清加到預(yù)先用裂解緩沖液平衡好的Ni柱，洗去雜蛋白，洗脫得到目的蛋白，每步都留樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。SBD-SAEI, SBD-SAEII, SBD_Ubc9，SBD-Ulplc, SBD-SENPs 的固相化步驟如下(I) 5ml誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心后去除培養(yǎng)液加入500ul Buffer混勻。(2)加入溶菌酶至終濃度O. 5mg/ml，冰上I小時(shí)。(3)超聲破菌，200w，40次，每次2s，間隔10s。(4)超聲后的菌液4°C 13000rpm離心30分鐘。(5)與此同時(shí)對(duì)淀粉樹(shù)脂(淀粉珠，簡(jiǎn)稱(chēng)淀粉珠；購(gòu)自NEB公司)進(jìn)行處理，每份樣品取淀粉珠IOOul，離心以去除保存液，并用Buffer洗滌3次。
(6)超聲后的菌液離心后，取其上清蛋白粗提物加入到洗滌后的淀粉珠。(7) 4°C混旋儀上旋轉(zhuǎn)混勻I小時(shí)以充分結(jié)合。(8) 6000rpm離心I分鐘，收集結(jié)合后的上清。(9)Buffer 500ul洗漆淀粉珠,6000rpm離心I分鐘,洗漆2次,去除雜蛋白，從而得到固相化的目標(biāo)蛋白。SBD-Ulplc的固相化酶催化反應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照中Ulplc為表達(dá)純化的Ulpl的C末端，其具有Ulpl (GenBank登錄號(hào)NC_001148)的第403-625位蛋白質(zhì)序列。Ulplc酶學(xué)活力定義按照Invitrogen公司的手冊(cè)，I單位Ulplc活性定義為在 20μ1 體系，50mM Tris-HCl pH 8. 0,150mM NaCl, 5mM β-mercaptoethanol 條件下，3CTC I小時(shí)能夠切割2ug的SUMO EGFP標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)底物的酶量。步驟如下(I)結(jié)合SBD-Ulplc后的淀粉珠再用Ulplc酶切反應(yīng)buffer 500ul洗滌一次。離心，洗盡上清。(2)加入酶切反應(yīng)緩沖液lOOul，底物蛋白2ug(參見(jiàn)CN200810036879. X)。4°C混旋儀反應(yīng)過(guò)夜。(3)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照底物蛋白2ug，Ulplc酶1U，緩沖液補(bǔ)足至20ul ;陰性對(duì)照底物蛋白(SUMO-GFP) 2ug，不加Ulplc酶，同樣補(bǔ)足緩沖液至20ul，4°C混旋儀反應(yīng)過(guò)夜。(4)過(guò)夜反應(yīng)后，6000rpm離心I分鐘，取上清樣品，加入上樣緩沖液100°C煮樣品10分鐘，留待SDS-PAGE膠電泳分析。(5)固相化的Ulplc酶在取盡上清后，再用酶切反應(yīng)緩沖液500ul洗滌I次，再加入酶切反應(yīng)緩沖液lOOul，底物蛋白2ug，繼續(xù)4°C混旋儀反應(yīng)8小時(shí)。SBD-SENPs的固相化酶催化反應(yīng)SDS-PAGE檢測(cè)(I)取固相化 SBD-Ulplc，SBD-SENPlc，SBD_SENP2c，SBD_SENP7c，SBD-SENP8 各
0.5ug,底物蛋白 2ug CFP-SUMOI-YFP，4ugCFP-SUM02_YFP，CFP-SUM03-YFP，CFP-SUM04-YFP，反應(yīng)緩沖液體系50uL，混勻置30°C水浴反應(yīng)I小時(shí)。(2)設(shè)置對(duì)照組，不加SBD-SENPs酶反應(yīng)組，只加SBD-SENPs酶反應(yīng)組，條件和(I)一樣。(3)反應(yīng)完，6000rmp離心I分鐘，取上清40uL，加上8uL 6 X上樣緩沖液100°C煮樣10分鐘，稍微離心，取3uL樣品SDS-PAGE電泳分析免疫印跡(WesternBlot)檢測(cè)采用的步驟如下(I)將要檢測(cè)的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。(2)轉(zhuǎn)膜(濕式電轉(zhuǎn)儀，Bio-Rad):把SDS-PAGE膠浸泡在常規(guī)的電轉(zhuǎn)移緩沖液中30分鐘。在電轉(zhuǎn)移板上依次鋪兩層緩沖墊片和一層濾紙，把膠鋪在濾紙上，再鋪上硝酸纖維素膜覆蓋目的蛋白所在區(qū)域，再鋪一層濾紙和兩層緩沖墊片。把電轉(zhuǎn)移板夾好。接通恒流電源(250mA)，轉(zhuǎn)膜60分鐘。(3)將轉(zhuǎn)好的膜放置于5%脫脂牛奶中搖晃封閉I小時(shí)。用洗滌緩沖液(10X緩沖液的配方是=Tris 24. 2g ；NaCl 87. 74g ；Tween 5g ；pH 8. O ;加水至1L)漂洗5分鐘，重復(fù)洗漆3次。(4)把膜浸在鼠源一抗(購(gòu)自Sigma)溶液中搖晃I小時(shí)。用洗滌緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)洗滌3次。(5)再將膜浸在含抗小鼠的二抗(購(gòu)自Rockland)的溶液中搖晃O. 5小時(shí)，用緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)洗滌3次。(6)用紅外突光成像儀(Odyssey)觀察結(jié)果。實(shí)施例I、SBD片段的獲得如圖I設(shè)計(jì)淀粉結(jié)合域(SBD)編碼序列的人工合成引物。 在沒(méi)有基因擴(kuò)增的模板或者模板很難獲取的情況下，重疊PCR技術(shù)是目前一種有效合成基因的方法和途徑。本發(fā)明人利用分步重疊PCR技術(shù)人工合成SBD基因片段。按照SBD的序列共設(shè)計(jì)10條引物，1-8每?jī)蓷l引物之間都有一定長(zhǎng)度的互補(bǔ)重疊序列(20bp)。利用中間兩條引物作為模板(如引物2，引物3)，兩邊兩條作為擴(kuò)增引物(如引物1，引物4)，通過(guò)PCR的方式擴(kuò)增出1-4，5-8，兩段較長(zhǎng)的DNA片段，然后再將純化回收后的這兩段片段(SBDl-4，SBD5-8)作為模板，利用引物F和引物R。經(jīng)鑒定最終擴(kuò)增出所需的目的基因片段SBD (Starch binding domain),如圖2,為后續(xù)融合克隆的構(gòu)建提供了模板。獲得的SBD編碼序列為Gcgagcattccgagcagcgcgagcgtgcagctggatagctataactatgatggcagcacctttagcggcaaaatttatgtgaaaaacattgcgtatagcaaaaaagtgaccgtggtgtatgcggatggcagcgataactggaacaacaacggcaacattattgcggcgagctttagcggcccgattagcggcagcaactatgaatattggacctttagcgcgagcgtgaaaggcattaaagaattttatattaaatatgaagtgagcggcaaaacctattatgataacaacaacagcgcgaactatcaggtgagcacc(SEQ ID NO 1)實(shí)施例2、SBD與促溶標(biāo)簽SUMO融合表達(dá)的純化應(yīng)用前面構(gòu)建好的pET28a His-SBD-SUMO-EGFP, pET28a His-SBD_SUM0-JNK2，在大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)O. 5mM IPTG 22°C低溫誘導(dǎo)表達(dá)20小時(shí)后，收集菌液進(jìn)行超聲破菌，離心后所得上清液蛋白粗提物與淀粉珠在4°C混旋結(jié)合I小時(shí)，溶液洗脫兩次以去除雜蛋白。然后再用Ulplc酶(Ulpl的催化domain)進(jìn)行酶切反應(yīng)。如圖3-4所示，可以看到SBD-SUM0-EGFP和SBD-SUMO-JNK2融合蛋白一步法很好地結(jié)合到淀粉珠，通過(guò)Ulplc酶切割后能有效純化到目的蛋白。SBD自身作為一個(gè)固相化標(biāo)簽可以很好地和淀粉珠特異性結(jié)合，這種親和結(jié)合比一般陰陽(yáng)離子結(jié)合更為牢固，不易受PH值和離子濃度影響，因而在高鹽改變離子濃度的情況下仍能夠有效結(jié)合。在這種情況下，非特異性結(jié)合的雜蛋白由于離子濃度的改變而從淀粉珠上解離下來(lái)，從而達(dá)到分離純化的效果。實(shí)施例3、固相化酶催化反應(yīng)I、SBD固相化ULPl活性檢測(cè)Ulpl作為特異性切割SUMO的酶，廣泛用在SUMO標(biāo)簽融合表達(dá)蛋白時(shí)的SUMO標(biāo)簽切除。用游離的Ulplc酶切SUMO tag，Ulplc會(huì)殘留混合在目的蛋白中，從而影響目的蛋白的純度或者活性。本發(fā)明人試著通過(guò)表達(dá)SBD-Ulplc，簡(jiǎn)單洗脫過(guò)程可以將Ulplc酶固定在淀粉珠。此方法可以簡(jiǎn)單快速的固相化大量所需的較高純度的重組蛋白酶。如圖5所示，通過(guò)加入游離的Ulplc作為陽(yáng)性對(duì)照,對(duì)比游離的Ulplc酶,固相化的Ulplc酶仍然具有較好的活性。在固相化體系中，由于酶的固相化，酶本身不會(huì)隨著反應(yīng)液的洗脫而存在于反應(yīng)之后的底物中，更利于后續(xù)相應(yīng)的檢測(cè)和反應(yīng)。同時(shí)可以看到，由于酶的催化反應(yīng)本身的特性，在反應(yīng)的過(guò)程中并不會(huì)被消耗或失活，利用溫和的反應(yīng)條件可以使固相化酶的重復(fù)利用成為可能。通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，該固相化酶的制備過(guò)程和催化反應(yīng)體系具有很大的商業(yè)價(jià)值。2、SBD固相化SAEI/SAEII，Ubc9的體外檢測(cè) SUMO化反應(yīng)體系flag標(biāo)簽的底物蛋白TopI-I (Tl-flag) =TopI-I為人源拓?fù)洚悩?gòu)酶I (Topoisomerase I, Top I)的N-端l_200aa,本實(shí)施例所用的TopI-I蛋白常規(guī)方法將上述片段的編碼序列(PCR時(shí)引入Flag標(biāo)簽)克隆入PET28獲得重組質(zhì)粒pET28His-f Iag-TopI-I，在大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)通過(guò)鎳柱純化得到。在SBD固相化單個(gè)酶進(jìn)行酶促反應(yīng)得到較理想的結(jié)果后，本發(fā)明人探索了 SBD固相化多種酶促反應(yīng)體系。以體外SUMO修飾過(guò)程作為研究模型。在SUMO化的反應(yīng)體系需要El和E2兩個(gè)酶的協(xié)同有序作用，把底物SUMO加到底物蛋白上。利用帶有flag標(biāo)簽的底物蛋白TopI-I (Tl-flag)進(jìn)行體外SUMO反應(yīng)的檢測(cè)。將三個(gè)酶分別通過(guò)SBD固相化(圖6)后混合成固相化催化反應(yīng)體系，通過(guò)加入底物和外源SUMOl能夠一步性的完成底物的SUMO化催化過(guò)程。在實(shí)際的結(jié)果中，可以看到當(dāng)固相化其中的一個(gè)，兩個(gè)或者三個(gè)全部固相化時(shí)，SUMO化底物條帶不一樣，表明它們的催化效率不一樣(圖7)。由圖6，可以看到淀粉基質(zhì)能很好地一步洗脫固相化SBD-SAEI，SBD-SAE2和SBD-Ubc9。由圖7可以發(fā)現(xiàn)，固相化這些酶不同組合，產(chǎn)生的SUMO化的底物不一樣，這可能是因?yàn)镾AEI和SAEII是一對(duì)異源二聚體，在SUMO的起始激活過(guò)程中，SAEI/SAEII通過(guò)在SUMO C端連接上AMP實(shí)現(xiàn)腺苷化，通過(guò)AMP的水解使之與SAEII形成硫脂鍵。因此在lane8中，單一固相化Ubc9的情況下，游離的SAEII在與SAEI結(jié)合形成二聚體后，所受到的“空間位阻”影響最小，最易形成反應(yīng)所需的復(fù)合體，因而SUMO化的催化效率比較高。總之圖7可以說(shuō)明利用SBD固相化的SAE1/SAE2，Ubc9體外檢測(cè)SUMO化是具備可行性的，將來(lái)可以以此為基礎(chǔ)建立一些高通量的篩選方法。 3、SBD固相化去SUMO化相關(guān)酶SENPs篩選其底物的特異性為了了解人的去SUMO化酶(SENPs)內(nèi)切酶活性的底物特異性，本發(fā)明人利用SBD固相化了 SENP1，SENP2, SENP3, SENP5, SENP6, SENP7的C-端催化結(jié)構(gòu)域，并用不同底物(SUM01, SUM02, SUM03, SUM04)來(lái)測(cè)試SENPs的內(nèi)切酶活性。另外還測(cè)試了 SENPs的酵母同源物Ulpl對(duì)人的SUMO活性。從圖8-12可以看出，SENPl，SENP2，Ulpl能很好地識(shí)別SUMOl，SUM02, SUM03，但不能識(shí)別 SUM04，SENP7, SENP8 不能識(shí)別 SUMOl，SUM02, SUM03, SUM04，幾乎看不到內(nèi)切酶活性。另外我們?cè)O(shè)計(jì)的SUMO底物的N端和C端分別融合了兩個(gè)熒光蛋白ECFP和EYFP，當(dāng)SENPs不能水解ECFP-SUM0-EYFP時(shí)，ECFP和EYFP產(chǎn)生熒光能量共振(FRET) ；SENPs水解ECFP-SUM0-EYFP時(shí)，不能發(fā)生熒光能量共振，這種光譜的改變可以通過(guò)熒光分光光度計(jì)或者多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)到，從而可以建立基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移的快速篩選SENPs酶活性及其激動(dòng)劑或抑制劑的方法，見(jiàn)圖18。總結(jié)
本發(fā)明對(duì)于SBD蛋白標(biāo)簽在蛋白純化和蛋白固相化的應(yīng)用方面進(jìn)行了研究和探索。I)利用其自身的特點(diǎn)應(yīng)用于蛋白純化；2)將SBD同促溶標(biāo)簽SUMO串聯(lián)表達(dá)，利用SUMO的促溶效果和特性識(shí)別SUMO的蛋白酶Ulpl能在其C端切割獲得天然蛋白的特點(diǎn)，進(jìn)一步擴(kuò)展SBD標(biāo)簽的應(yīng)用；3)利用SBD與淀粉基質(zhì)強(qiáng)大的親和結(jié)合能力應(yīng)用于固相化研究。我們把催化SUMOyltion的酶El (SAE1/SAE2)和E2 (Ubc9)通過(guò)SBD標(biāo)簽固相化，建立體外篩選SUMO化蛋白底物的固相化酶反應(yīng)體系，用來(lái)高通量篩選SUMO修飾的候選蛋白。另外本發(fā)明人利用SBD標(biāo)簽固相化人的DeSUMOylation相關(guān)酶SENPs研究其內(nèi)切酶活性的底物特異性。這些固相化研究提示，通過(guò)SBD標(biāo)簽可以建立一種非化學(xué)催化和非光學(xué)激活的蛋白偶聯(lián)技術(shù)，并且可以應(yīng)用于藥物的高通量篩選和工業(yè)用 酶催化反應(yīng)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.淀粉酶的淀粉結(jié)合域的用途，用于作為目的蛋白固相化的標(biāo)簽。
2.一種目的蛋白固相化的方法，所述方法包括 (a)將目的蛋白與淀粉酶的淀粉結(jié)合域融合表達(dá)，獲得包含淀粉酶的淀粉結(jié)合域-目的蛋白的融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物； (b)將所述的表達(dá)產(chǎn)物與淀粉基質(zhì)相接觸，從而淀粉酶的淀粉結(jié)合域-目的蛋白的融合蛋白被吸附到淀粉基質(zhì)表面，所述目的蛋白被固相化。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，還包括對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化 步驟(a)中，將目的蛋白與淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白以及類(lèi)泛素小修飾蛋白相融合表達(dá)，獲得包含淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-類(lèi)泛素小修飾蛋白-目的蛋白融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物； 步驟(b)中，將所述的表達(dá)產(chǎn)物與淀粉基質(zhì)相接觸，從而淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-類(lèi)泛素小修飾蛋白-目的蛋白融合蛋白被吸附到淀粉基質(zhì)表面； 之后，利用類(lèi)泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶從被吸附的淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-類(lèi)泛素小修飾蛋白-目的蛋白融合蛋白上切除目的蛋白，從而獲得純化的目的蛋白。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的目的蛋白是能酶切蛋白的酶 步驟(a)中，將酶與淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白相融合表達(dá)，獲得包含淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶的表達(dá)產(chǎn)物； 步驟(b)中，將所述的表達(dá)產(chǎn)物與淀粉基質(zhì)相接觸，從而淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶被吸附到淀粉基質(zhì)表面，獲得淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶復(fù)合物； 之后，將待酶切的蛋白與淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶復(fù)合物接觸，從而待酶切的蛋白被酶切。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的酶是類(lèi)泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶；和 所述的待酶切的蛋白是類(lèi)泛素小修飾蛋白-靶蛋白的融合蛋白。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(b)之后，還包括 (c)加入潛在地可與目的蛋白相互作用的其它蛋白，觀察目的蛋白與其它蛋白的相互作用情況。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的目的蛋白是去類(lèi)泛素化蛋白酶蛋白，所述的其它蛋白是含有類(lèi)泛素小修飾蛋白序列的蛋白，從而觀察去類(lèi)泛素化蛋白酶對(duì)于類(lèi)泛素小修飾蛋白序列的識(shí)別或切割特性。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的目的蛋白是對(duì)于蛋白的類(lèi)泛素小修飾蛋白化有用的酶，步驟(b)之后，還包括 加入底物蛋白；觀察在與所述對(duì)于蛋白的類(lèi)泛素小修飾蛋白化有用的酶接觸后，所述的底物蛋白的類(lèi)泛素小修飾蛋白化情況。
9.一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有以下可操作性相連的元件淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白編碼基因-類(lèi)泛素小修飾蛋白編碼基因-多克隆位點(diǎn)；所述的多克隆位點(diǎn)用于插入目的蛋白編碼基因。
10.權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體的用途，用于表達(dá)、固相化及純化目的蛋白。
11.一種用于表達(dá)、固相化及純化目的蛋白的試劑盒，其中包括用于將目的蛋白與類(lèi)泛素小修飾蛋白和淀粉結(jié)合域蛋白相融合表達(dá)，形成淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-類(lèi)泛素小修飾蛋白-目的蛋白融合蛋白的試劑；以及 用于將目的蛋白與淀粉結(jié)合域蛋白-類(lèi)泛素小修飾蛋白相分離的試劑。
12.如權(quán)利要求11所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中包括 權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體；和/或 類(lèi)泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶；和/或 淀粉基質(zhì)；和/或 宿主細(xì)胞；和/或 蛋白重組表達(dá)試劑；和/或 蛋白純化試劑。
13.一種融合蛋白，其包括淀粉酶的淀粉結(jié)合域，以及與之相連的選自下組的蛋白類(lèi)泛素小修飾蛋白，酵母泛素樣特異性蛋白酶I，去類(lèi)泛素化蛋白酶蛋白，對(duì)于蛋白的類(lèi)泛素小修飾蛋白化有用的酶(如SAEI，SAEII和/或Ubc9)，或它們的或其活性片段。
14.一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有以下可操作性相連的元件淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白編碼基因，以及與之操作性相連的選自下組的蛋白的編碼基因類(lèi)泛素小修飾蛋白，酵母泛素樣特異性蛋白酶1，去類(lèi)泛素化蛋白酶蛋白，對(duì)于蛋白的類(lèi)泛素小修飾蛋白化有用的酶，或它們的活性片段。
15.一種淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶，其包括淀粉基質(zhì)，以及吸附于淀粉基質(zhì)的淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶融合蛋白。
16.權(quán)利要求15所述的淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶的用途，用于酶切蛋白。
17.一種用于酶切蛋白的試劑盒，其包括權(quán)利要求15所述的淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶；或者 其包括淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶融合蛋白，以及淀粉基質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及標(biāo)簽的聯(lián)合應(yīng)用。本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種全新的蛋白標(biāo)簽--淀粉結(jié)合域(Starch Binding Domain，SBD)，目的蛋白在與該SBD融合后，由于SBD能夠很好地與淀粉基質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，可應(yīng)用于目的蛋白的固定化或目的蛋白的純化，還可應(yīng)用于觀察目的蛋白與其它蛋白的相互作用。所述的SBD是一種廉價(jià)而可靠的標(biāo)簽蛋白。
文檔編號(hào)C07K1/14GK102757501SQ20111011035
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者李建中, 楊淑偉 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院