本發(fā)明屬于石油及石油產(chǎn)品污染環(huán)境的生物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用海帶渣制備的用于石油污染修復(fù)的固定化菌劑。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，隨著人類對(duì)海洋石油資源的開采和海上石油產(chǎn)品的運(yùn)輸，海洋溢油事故頻繁發(fā)生，造成了嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境破壞和經(jīng)濟(jì)損失。因此，尋找一種友好且低成本的溢油清除策略是當(dāng)前海洋環(huán)境治理急需解決的問(wèn)題。目前，已有眾多不同方式用于緩解和清除溢油污染。其中傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法主要針對(duì)海面溢油的快速處置，但在實(shí)際應(yīng)用中，常常清理不完全或引起污染物形式的轉(zhuǎn)化，特別是消油劑的使用，容易產(chǎn)生次生污染，所以只能用于海面溢油的早期處置。而對(duì)于沉入海底和漂移至岸灘的溢油污染，通過(guò)物理和化學(xué)的方式根本無(wú)法有效處理。生物修復(fù)技術(shù)是利用環(huán)境中本身存在的具有石油降解能力的微生物，通過(guò)生物刺激或增強(qiáng)的方式對(duì)油污進(jìn)行降解，達(dá)到修復(fù)環(huán)境的目的。生物修復(fù)不僅對(duì)油污清除徹底，環(huán)保性也高于物理化學(xué)方法，所以越來(lái)越多的學(xué)者傾向于采用微生物修復(fù)的方法進(jìn)行油污處理。特別是當(dāng)溢油污染物沉積在海底或岸灘，生物修復(fù)技術(shù)顯得更為重要。然而直接添加石油降解微生物的方式，在風(fēng)、浪、流的作用下，很難讓這些細(xì)菌定殖在石油污染區(qū)，無(wú)法持續(xù)發(fā)揮生物降解作用。

微生物固定化技術(shù)是從20世紀(jì)60年代開始迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，自從70年代起，該技術(shù)就已開始應(yīng)用于水處理行業(yè)，它能將高密度的細(xì)胞定位于限定的區(qū)域，避免菌體流失，提高細(xì)菌環(huán)境適應(yīng)性，使其保持活性并可反復(fù)利用，可以優(yōu)化生物修復(fù)的效果。應(yīng)用固定化菌劑修復(fù)石油污染的近岸底質(zhì)，能夠克服海水沖刷、營(yíng)養(yǎng)鹽水平、溶解氧、溫度等自然環(huán)境因素的影響，并且一次施用固定化菌劑，菌體利用污染物作為能源和結(jié)構(gòu)物質(zhì)，通過(guò)生理代謝，持續(xù)降解污染物，相比液體菌劑需多次施用更具有成本優(yōu)勢(shì)。

傳統(tǒng)的固定化載體材料分為無(wú)機(jī)材料、高分子合成材料、天然有機(jī)材料等。其中無(wú)機(jī)材料無(wú)污染，但獲取成本高；高分子合成材料，機(jī)械強(qiáng)度高，但不易降解，成本高；天然有機(jī)材料成本低，易降解。因此，選擇一種易獲取、可降解、成本低的固定化載體材料，是石油降解微生物固定化技術(shù)廣泛應(yīng)用于海洋底質(zhì)溢油污染生物修復(fù)的技術(shù)前提。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于海洋溢油污染沉積物的生物修復(fù)固定化菌劑，有效解決生物修復(fù)中施加的液體菌劑易受海流、溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽等環(huán)境條件影響的問(wèn)題。

本發(fā)明首先提供海帶渣材料在制備固定化菌劑中的應(yīng)用，所述的固定化菌劑用于處理海洋近岸溢油污染的沉積物；

本發(fā)明再一個(gè)方面提供一種用于制備固定化菌劑的固定化材料，包含有海帶渣、高嶺土和膠黏劑；

所述的膠黏劑為褐藻酸鈉、卡拉膠、明膠、羥甲基纖維素鈉中的任一種，優(yōu)選為褐藻酸鈉；

其中海帶渣、高嶺土的質(zhì)量比為9～5：1～5；

作為實(shí)施例的優(yōu)選，其中海帶渣與高嶺土的質(zhì)量比為7:3；

作為實(shí)施例的優(yōu)選，其中海藻酸鈉的含量為固定化材料總質(zhì)量的0.5％～1.5％；

本發(fā)明所提供的固定化材料用于制備固定化菌劑；

所述的固定化菌劑用于處理海洋近岸溢油污染沉積物；

上述的固定化菌劑的一種具體制備方法如下：

向海帶渣中添加能降解石油烴降解菌的發(fā)酵菌液，攪拌均勻后，在30～45℃烘培干燥，再加入高嶺土攪拌均勻；加入海藻酸鈉溶液攪拌均勻，將攪拌好的全部樣品緩慢投入制粒機(jī)，將制得的顆粒收集，于30～45℃低溫烘干制得固定化菌劑。

本發(fā)明提供的海帶渣材料既可以吸附石油烴，又可以作為固定化材料包埋石油降解菌，這樣一方面海帶渣通過(guò)主動(dòng)吸附石油烴，將其作為碳源供石油降解菌利用，另一方面，固定化的石油降解菌在海帶渣基質(zhì)內(nèi)受到保護(hù)，能長(zhǎng)期定殖于受污染的區(qū)域，并加快石油污染的生物降解。

附圖說(shuō)明

圖1海帶渣對(duì)柴油吸附率圖；

圖2：不同高嶺土配比的原料制粒的物理特性圖；

圖3：不同膠黏劑的處理?xiàng)l件下溶失率比較圖；

圖4：海藻酸鈉固定化顆粒海水浸泡溶失率圖；

圖5：固定化菌劑樣品照片圖；

圖6：固定化菌劑石油降解率圖，其中a,b,c：當(dāng)字母不相同時(shí)，表示兩兩相比，石油降解率數(shù)值差異極顯著，p<0.01。

具體實(shí)施方式

在對(duì)岸灘溢油的生物修復(fù)實(shí)際應(yīng)用中，目前主要采用噴灑液體石油降解菌劑來(lái)促進(jìn)石油污染物的降解，而在海洋環(huán)境中，這種方式往往造成石油降解菌的流失，大大降低降解效果；利用固定化技術(shù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行固定，可以避免菌體流失，提高降解效果，然而現(xiàn)有的固定化材料一方面不具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)，一方面環(huán)境友好性差。申請(qǐng)人選擇將海帶渣來(lái)制備固定化菌劑，不僅變廢為寶，還能提高溢油生物修復(fù)的效果。但在使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，海帶渣制備的固定化顆粒密度輕，固型性不好，水溶失率高，申請(qǐng)人對(duì)固定化材料進(jìn)行了復(fù)配，通過(guò)配比的優(yōu)選組合，最終獲得了本發(fā)明。

實(shí)施例1固定化材料的篩選及制備方法的優(yōu)化

對(duì)固定化菌劑的密度、固型性、吸附率及溶失率指標(biāo)進(jìn)行篩選，最終確定最佳的固定化顆粒的組分及制備方法。

其中使用的儀器如下：恒溫培養(yǎng)搖床:thz-100型,上海一恒科學(xué)儀器公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器公司；電子天平:bsa224s-cw,sartorius公司；大型微生物發(fā)酵罐：30l，120l，上海國(guó)強(qiáng)；120a型兩相3kw制粒機(jī)：領(lǐng)航農(nóng)業(yè)機(jī)械公司；氣相色譜質(zhì)譜儀(gc/ms):6890n-5973n型,agilent公司；

海帶渣是海帶工業(yè)，特別是褐藻酸鈉生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的比例最大的固體廢料。使用時(shí)將海帶渣經(jīng)水洗后，200～400℃高溫烘干，粉碎機(jī)磨碎，過(guò)50目篩并收集。其主要成分中粗纖維含量為10％左右，蛋白質(zhì)8％左右，多糖6％左右，含鈣2％左右，其次還含有少量脂肪、碘和無(wú)機(jī)鹽。

申請(qǐng)人篩選后使用高嶺土與海帶渣一起來(lái)制備固定化材料，并通過(guò)篩選高嶺土、海帶渣與膠黏劑的具體組分配比來(lái)獲得最佳的溶失率。

本發(fā)明的固定化菌的具體制備方法如下：

一、降解菌及培養(yǎng)基

本實(shí)施所使用的石油烴降解菌為bacillussp.e3，購(gòu)買自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號(hào)為cgmccno.1.16125

onr7a培養(yǎng)基配方如下：一種模擬天然海水的培養(yǎng)基，主要用于石油培養(yǎng)基配制。主要成分如下：每l含22.79gnacl、11.18gmgcl2·6h2o、3.98gna2so4、1.46gcacl2·2h2o、1.30gtapso、0.72gkcl，滅菌前添加2ml溶液ⅰ，之后121℃，滅菌15min；使用時(shí)按濃度比例添加溶液ⅱ和溶液ⅲ。

溶液ⅰ(500x，培養(yǎng)基配制時(shí)加入)：

溶液ⅱ(50x，高壓滅菌后加入)：

溶液ⅲ(1000x，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌)：

組分容量(g/l)

feso4·2h2o2.8

溶液ⅰ、溶液ⅱ均需要121℃高壓蒸汽滅菌15min；溶液ⅲ則需要用0.22μm濾膜除菌。

石油培養(yǎng)基:100mlonr7a中添加1g原油(1％)。

2216e培養(yǎng)基：每l含蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高鐵0.01g，陳海水1l，調(diào)節(jié)ph7.6-7.8，之后121℃，滅菌15min，用于擴(kuò)大培養(yǎng)菌液。

二、固定化菌劑的包埋制粒條件優(yōu)化

采用制粒機(jī)加工方法，將石油降解菌液、海帶渣、配重劑、膠黏劑等混合均勻后壓制成包埋固定化石油降解菌劑。為了滿足海洋沉積物石油污染處理的要求，我們對(duì)固定化菌劑的密度、固型性及溶失率指標(biāo)進(jìn)行考察，以確定最佳的固定化顆粒的制備技術(shù)。

(1)固定化菌劑配重比例的研究

為了讓微生物固定化菌劑能在海水介質(zhì)中下沉，需增加固定化菌劑的密度，本專利選取了高嶺土作為固定化菌劑的配重劑，選擇了不同配比的海帶渣來(lái)制粒，制粒過(guò)程中添加30～50％的液體培養(yǎng)基作為固定化菌液。之后將制得的顆粒放入含有海水的三角瓶中，在搖床上150rmp搖動(dòng)處理24h，通過(guò)計(jì)算不同顆粒的密度及溶失率(公式2)來(lái)評(píng)價(jià)顆粒的成型效果。配比實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表如下表所示。

表1配重劑配比測(cè)試設(shè)計(jì)表

溶失率測(cè)定公式：

式中，m為隨機(jī)挑選顆粒的總質(zhì)量，md為浸泡處理d天后收集的成型顆粒烘干后的質(zhì)量。

(2)膠黏劑及濃度的選擇

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇最合適的海帶渣與高嶺土的配比，為了進(jìn)一步增強(qiáng)固定化顆粒的成型穩(wěn)定性，在制粒過(guò)程中分別添加褐藻酸鈉、卡拉膠、明膠、羥甲基纖維素鈉四種膠黏劑水溶液，膠黏劑的添加量為原料總質(zhì)量的0.5％～1.5％。隨機(jī)挑取制得的10粒固定化菌劑分別浸泡在數(shù)只盛有50ml海水的錐形瓶中，并在放入后1-12天區(qū)間取出每個(gè)錐形瓶中的顆粒，烘干挑選出成型顆粒稱重并按公式(2)測(cè)定固定化菌劑的溶失率。通過(guò)比較四種膠黏劑制備的固定化菌劑的溶失率，選取最合適的膠黏劑制備固定化顆粒，放入海水中，延長(zhǎng)浸泡時(shí)間至90天，按上述方法測(cè)定其不同時(shí)間段的溶失率。

3)固定化菌劑的制備工藝

步驟一：菌液制備

取–80℃甘油管藏的上述菌株e3于2216e培養(yǎng)基中活化并擴(kuò)大培養(yǎng)至od630≈(1.2～2.3)×10⁹cfu/ml]；接種于30l發(fā)酵罐中，25℃恒溫培養(yǎng)，2-3d后制得所需菌液。

步驟二：固定化過(guò)程

以質(zhì)量比1：1的比例向海帶渣中添加菌液，充分?jǐn)噭?，?0～45℃烘培至干。加入適量高嶺土，使之與海帶渣質(zhì)量比為3：7，攪拌均勻；加入上述原料總質(zhì)量0.5％～1.5％的海藻酸鈉溶液攪拌均勻，使其水含量為50％～70％。

步驟三：制粒與烘干

將攪拌好的全部樣品緩慢投入制粒機(jī)，待出粒均勻后，可加大原料添加量。將制得的顆粒收集，于烘箱中30～45℃低溫烘干制得固定化菌劑，密封后低溫4℃保存。

石油降解實(shí)驗(yàn)：將上述所制得的固定化菌劑接入石油培養(yǎng)基中，研究其石油降解特性。以添加含等量菌體的菌液為陽(yáng)性對(duì)照，以未添加固定化菌劑和菌液的石油培養(yǎng)基為空白對(duì)照。上述每種處理設(shè)3個(gè)平行，在150r/min，20℃，避光的條件下分別培養(yǎng)21d。

石油降解率測(cè)定方法：降解21d后，用50mlch2cl2分三次倒入三角瓶中萃取培養(yǎng)液中殘余石油。取20mlch2cl2相萃取液轉(zhuǎn)移到尖底燒瓶中，40℃減壓濃縮,氮?dú)獯蹈?按照公式(3)計(jì)算降解率。

式中,m0為最初加入培養(yǎng)基中的石油重量；m1為石油培養(yǎng)基萃取后殘留油樣重量。

海帶渣柴油吸附能力測(cè)試：

取數(shù)個(gè)100ml錐形瓶，分別加入50ml過(guò)濾海水和1ml柴油(0.85g)，取0.3g海帶渣于錐形瓶?jī)?nèi)后將錐形瓶放置于搖床上，分別在0min、5min、10min、15min、20min、30min、60min、120min時(shí)取出，用塞住脫脂棉(0.03g)的漏斗過(guò)濾并獲得濾液。使用20ml正己烷分兩次萃取濾液，氮吹，定量剩余柴油質(zhì)量，按照公式(1)計(jì)算海帶渣的柴油吸附率。以上實(shí)驗(yàn)每組做三個(gè)平行。

m0為模擬體系中添加的柴油含量，ma為模擬體系中海帶渣的質(zhì)量，mb為經(jīng)萃取后剩余柴油的質(zhì)量，mc為陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)中脫脂棉的吸油量。

在本實(shí)施例中通過(guò)向裝有50ml滅菌海水的三角瓶中加入1ml柴油，來(lái)模擬海上浮油污染環(huán)境。在加入海帶渣材料后，我們從不同時(shí)間點(diǎn)取出材料，對(duì)柴油吸附量進(jìn)行檢測(cè)，研究海帶渣的動(dòng)態(tài)柴油吸附過(guò)程，并分析海帶渣的最大柴油吸附能力。

海帶渣的吸油率在0-20min時(shí)間段內(nèi)緩慢上升，并于30min左右達(dá)到最大，吸油率為128％，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，吸油率基本穩(wěn)定在該水平不變，這說(shuō)明海帶渣中的纖維素成分可在短時(shí)間內(nèi)吸附超過(guò)自身重量的柴油。

三、固定化顆粒植物載體的特性改良

1)配重劑添加比例

為了增強(qiáng)制得顆粒的密度和降低顆粒的溶失率，選取了高嶺土來(lái)配合海帶渣。從圖2中可以看到，當(dāng)高嶺土含量從10％增加到30％時(shí)，制備得到的海帶渣-高嶺土復(fù)合顆粒的密度也迅速增加到1.47g/cm³，而顆粒的海水溶失率則迅速下降至8％左右。而當(dāng)高嶺土的含量繼續(xù)增加，顆粒密度的增加幅度和海水溶失率的下降幅度都很小。所以，綜合考慮到顆粒的固定化效果和其下沉性能，當(dāng)添加的海帶渣與高嶺土的質(zhì)量比7：3時(shí)，所制得的顆粒具有較大的密度和較低的溶失率，也保證足夠大的海帶渣添加量，以獲得較好的油污吸附性能和菌體吸附率。

2)膠黏劑選擇結(jié)果

為了進(jìn)一步降低海帶渣-高嶺土復(fù)合顆粒在海水介質(zhì)中長(zhǎng)時(shí)間浸泡的溶失率，考察了四種有機(jī)高分子材料：褐藻酸鈉、卡拉膠、明膠、羥甲基纖維素鈉作為膠黏劑制備的顆粒，在12天海水浸泡實(shí)驗(yàn)中的溶失率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，相同的含量條件下，以海藻酸鈉為膠黏劑制備的固定化顆粒，其海水浸泡12天的溶失率小于15％，而其他三種則均高于15％。

以上結(jié)果表明，海藻酸鈉作為膠黏劑所制得顆粒的耐水性較好，初步滿足了在海水中長(zhǎng)期浸泡的要求。以海藻酸鈉為膠黏劑制備固定化顆粒，在進(jìn)行為期90天的海水浸泡實(shí)驗(yàn)中，也表現(xiàn)出較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)，整個(gè)海水浸泡期間，固定化顆粒的溶失率不超過(guò)23％，證實(shí)用海藻酸鈉作為膠黏劑制備的固定化顆?？梢詽M足在海水環(huán)境中長(zhǎng)期存在的要求。

實(shí)施例2

以最優(yōu)原料配比條件來(lái)固定石油降解細(xì)菌，首先將700g海帶渣和700ml菌液，充分?jǐn)噭?，?0～45℃烘培至干；然后加入300g高嶺土，攪拌均勻；將5～15g海藻酸鈉溶解于500～700ml水中，與上述原料混合，攪拌均勻，緩慢投入制粒機(jī)，將制得的顆粒收集，于烘箱中30～45℃低溫烘干制得固定化菌劑，成品如圖5所示，菌劑為直徑為1cm，高為2～3cm的白褐色圓柱形顆粒。

將含等量石油降解菌的液體菌劑和固定化菌劑添加至石油培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)21d的降解實(shí)驗(yàn)，通過(guò)重量法測(cè)定固定化菌劑、液體菌劑和自然風(fēng)化(陰性對(duì)照)的石油降解率。結(jié)果如圖6所示，與自然風(fēng)化(11.0％)和液體菌劑(31.0％)相比，固定化菌劑的石油降解率有了顯著提高(p＜0.01)，分別提高了接近40％和18％，而液體菌液相對(duì)于自然風(fēng)化，石油降解率僅提高近20％。這說(shuō)明采用海帶渣的細(xì)菌固定化技術(shù)可為細(xì)菌降解提供合適的生存空間，減弱外界復(fù)雜環(huán)境對(duì)菌體的干擾，保持菌體的活性，使得石油降解能力明顯提高。