本發(fā)明屬于石油及石油產(chǎn)品污染環(huán)境的生物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種利用海帶渣制備的用于石油污染修復(fù)的固定化菌劑。
背景技術(shù):
近年來(lái),隨著人類對(duì)海洋石油資源的開采和海上石油產(chǎn)品的運(yùn)輸,海洋溢油事故頻繁發(fā)生,造成了嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境破壞和經(jīng)濟(jì)損失。因此,尋找一種友好且低成本的溢油清除策略是當(dāng)前海洋環(huán)境治理急需解決的問(wèn)題。目前,已有眾多不同方式用于緩解和清除溢油污染。其中傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法主要針對(duì)海面溢油的快速處置,但在實(shí)際應(yīng)用中,常常清理不完全或引起污染物形式的轉(zhuǎn)化,特別是消油劑的使用,容易產(chǎn)生次生污染,所以只能用于海面溢油的早期處置。而對(duì)于沉入海底和漂移至岸灘的溢油污染,通過(guò)物理和化學(xué)的方式根本無(wú)法有效處理。生物修復(fù)技術(shù)是利用環(huán)境中本身存在的具有石油降解能力的微生物,通過(guò)生物刺激或增強(qiáng)的方式對(duì)油污進(jìn)行降解,達(dá)到修復(fù)環(huán)境的目的。生物修復(fù)不僅對(duì)油污清除徹底,環(huán)保性也高于物理化學(xué)方法,所以越來(lái)越多的學(xué)者傾向于采用微生物修復(fù)的方法進(jìn)行油污處理。特別是當(dāng)溢油污染物沉積在海底或岸灘,生物修復(fù)技術(shù)顯得更為重要。然而直接添加石油降解微生物的方式,在風(fēng)、浪、流的作用下,很難讓這些細(xì)菌定殖在石油污染區(qū),無(wú)法持續(xù)發(fā)揮生物降解作用。
微生物固定化技術(shù)是從20世紀(jì)60年代開始迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù),自從70年代起,該技術(shù)就已開始應(yīng)用于水處理行業(yè),它能將高密度的細(xì)胞定位于限定的區(qū)域,避免菌體流失,提高細(xì)菌環(huán)境適應(yīng)性,使其保持活性并可反復(fù)利用,可以優(yōu)化生物修復(fù)的效果。應(yīng)用固定化菌劑修復(fù)石油污染的近岸底質(zhì),能夠克服海水沖刷、營(yíng)養(yǎng)鹽水平、溶解氧、溫度等自然環(huán)境因素的影響,并且一次施用固定化菌劑,菌體利用污染物作為能源和結(jié)構(gòu)物質(zhì),通過(guò)生理代謝,持續(xù)降解污染物,相比液體菌劑需多次施用更具有成本優(yōu)勢(shì)。
傳統(tǒng)的固定化載體材料分為無(wú)機(jī)材料、高分子合成材料、天然有機(jī)材料等。其中無(wú)機(jī)材料無(wú)污染,但獲取成本高;高分子合成材料,機(jī)械強(qiáng)度高,但不易降解,成本高;天然有機(jī)材料成本低,易降解。因此,選擇一種易獲取、可降解、成本低的固定化載體材料,是石油降解微生物固定化技術(shù)廣泛應(yīng)用于海洋底質(zhì)溢油污染生物修復(fù)的技術(shù)前提。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是提供一種用于海洋溢油污染沉積物的生物修復(fù)固定化菌劑,有效解決生物修復(fù)中施加的液體菌劑易受海流、溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽等環(huán)境條件影響的問(wèn)題。
本發(fā)明首先提供海帶渣材料在制備固定化菌劑中的應(yīng)用,所述的固定化菌劑用于處理海洋近岸溢油污染的沉積物;
本發(fā)明再一個(gè)方面提供一種用于制備固定化菌劑的固定化材料,包含有海帶渣、高嶺土和膠黏劑;
所述的膠黏劑為褐藻酸鈉、卡拉膠、明膠、羥甲基纖維素鈉中的任一種,優(yōu)選為褐藻酸鈉;
其中海帶渣、高嶺土的質(zhì)量比為9~5:1~5;
作為實(shí)施例的優(yōu)選,其中海帶渣與高嶺土的質(zhì)量比為7:3;
作為實(shí)施例的優(yōu)選,其中海藻酸鈉的含量為固定化材料總質(zhì)量的0.5%~1.5%;
本發(fā)明所提供的固定化材料用于制備固定化菌劑;
所述的固定化菌劑用于處理海洋近岸溢油污染沉積物;
上述的固定化菌劑的一種具體制備方法如下:
向海帶渣中添加能降解石油烴降解菌的發(fā)酵菌液,攪拌均勻后,在30~45℃烘培干燥,再加入高嶺土攪拌均勻;加入海藻酸鈉溶液攪拌均勻,將攪拌好的全部樣品緩慢投入制粒機(jī),將制得的顆粒收集,于30~45℃低溫烘干制得固定化菌劑。
本發(fā)明提供的海帶渣材料既可以吸附石油烴,又可以作為固定化材料包埋石油降解菌,這樣一方面海帶渣通過(guò)主動(dòng)吸附石油烴,將其作為碳源供石油降解菌利用,另一方面,固定化的石油降解菌在海帶渣基質(zhì)內(nèi)受到保護(hù),能長(zhǎng)期定殖于受污染的區(qū)域,并加快石油污染的生物降解。
附圖說(shuō)明
圖1海帶渣對(duì)柴油吸附率圖;
圖2:不同高嶺土配比的原料制粒的物理特性圖;
圖3:不同膠黏劑的處理?xiàng)l件下溶失率比較圖;
圖4:海藻酸鈉固定化顆粒海水浸泡溶失率圖;
圖5:固定化菌劑樣品照片圖;
圖6:固定化菌劑石油降解率圖,其中a,b,c:當(dāng)字母不相同時(shí),表示兩兩相比,石油降解率數(shù)值差異極顯著,p<0.01。
具體實(shí)施方式
在對(duì)岸灘溢油的生物修復(fù)實(shí)際應(yīng)用中,目前主要采用噴灑液體石油降解菌劑來(lái)促進(jìn)石油污染物的降解,而在海洋環(huán)境中,這種方式往往造成石油降解菌的流失,大大降低降解效果;利用固定化技術(shù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行固定,可以避免菌體流失,提高降解效果,然而現(xiàn)有的固定化材料一方面不具有價(jià)格優(yōu)勢(shì),一方面環(huán)境友好性差。申請(qǐng)人選擇將海帶渣來(lái)制備固定化菌劑,不僅變廢為寶,還能提高溢油生物修復(fù)的效果。但在使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn),海帶渣制備的固定化顆粒密度輕,固型性不好,水溶失率高,申請(qǐng)人對(duì)固定化材料進(jìn)行了復(fù)配,通過(guò)配比的優(yōu)選組合,最終獲得了本發(fā)明。
實(shí)施例1固定化材料的篩選及制備方法的優(yōu)化
對(duì)固定化菌劑的密度、固型性、吸附率及溶失率指標(biāo)進(jìn)行篩選,最終確定最佳的固定化顆粒的組分及制備方法。
其中使用的儀器如下:恒溫培養(yǎng)搖床:thz-100型,上海一恒科學(xué)儀器公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海一恒科學(xué)儀器公司;電子天平:bsa224s-cw,sartorius公司;大型微生物發(fā)酵罐:30l,120l,上海國(guó)強(qiáng);120a型兩相3kw制粒機(jī):領(lǐng)航農(nóng)業(yè)機(jī)械公司;氣相色譜質(zhì)譜儀(gc/ms):6890n-5973n型,agilent公司;
海帶渣是海帶工業(yè),特別是褐藻酸鈉生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的比例最大的固體廢料。使用時(shí)將海帶渣經(jīng)水洗后,200~400℃高溫烘干,粉碎機(jī)磨碎,過(guò)50目篩并收集。其主要成分中粗纖維含量為10%左右,蛋白質(zhì)8%左右,多糖6%左右,含鈣2%左右,其次還含有少量脂肪、碘和無(wú)機(jī)鹽。
申請(qǐng)人篩選后使用高嶺土與海帶渣一起來(lái)制備固定化材料,并通過(guò)篩選高嶺土、海帶渣與膠黏劑的具體組分配比來(lái)獲得最佳的溶失率。
本發(fā)明的固定化菌的具體制備方法如下:
一、降解菌及培養(yǎng)基
本實(shí)施所使用的石油烴降解菌為bacillussp.e3,購(gòu)買自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心,菌種保藏號(hào)為cgmccno.1.16125
onr7a培養(yǎng)基配方如下:一種模擬天然海水的培養(yǎng)基,主要用于石油培養(yǎng)基配制。主要成分如下:每l含22.79gnacl、11.18gmgcl2·6h2o、3.98gna2so4、1.46gcacl2·2h2o、1.30gtapso、0.72gkcl,滅菌前添加2ml溶液ⅰ,之后121℃,滅菌15min;使用時(shí)按濃度比例添加溶液ⅱ和溶液ⅲ。
溶液ⅰ(500x,培養(yǎng)基配制時(shí)加入):
溶液ⅱ(50x,高壓滅菌后加入):
溶液ⅲ(1000x,0.22μm濾膜過(guò)濾除菌):
組分容量(g/l)
feso4·2h2o2.8
溶液ⅰ、溶液ⅱ均需要121℃高壓蒸汽滅菌15min;溶液ⅲ則需要用0.22μm濾膜除菌。
石油培養(yǎng)基:100mlonr7a中添加1g原油(1%)。
2216e培養(yǎng)基:每l含蛋白胨5g,酵母膏1g,磷酸高鐵0.01g,陳海水1l,調(diào)節(jié)ph7.6-7.8,之后121℃,滅菌15min,用于擴(kuò)大培養(yǎng)菌液。
二、固定化菌劑的包埋制粒條件優(yōu)化
采用制粒機(jī)加工方法,將石油降解菌液、海帶渣、配重劑、膠黏劑等混合均勻后壓制成包埋固定化石油降解菌劑。為了滿足海洋沉積物石油污染處理的要求,我們對(duì)固定化菌劑的密度、固型性及溶失率指標(biāo)進(jìn)行考察,以確定最佳的固定化顆粒的制備技術(shù)。
(1)固定化菌劑配重比例的研究
為了讓微生物固定化菌劑能在海水介質(zhì)中下沉,需增加固定化菌劑的密度,本專利選取了高嶺土作為固定化菌劑的配重劑,選擇了不同配比的海帶渣來(lái)制粒,制粒過(guò)程中添加30~50%的液體培養(yǎng)基作為固定化菌液。之后將制得的顆粒放入含有海水的三角瓶中,在搖床上150rmp搖動(dòng)處理24h,通過(guò)計(jì)算不同顆粒的密度及溶失率(公式2)來(lái)評(píng)價(jià)顆粒的成型效果。配比實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表如下表所示。
表1配重劑配比測(cè)試設(shè)計(jì)表
溶失率測(cè)定公式:
式中,m為隨機(jī)挑選顆粒的總質(zhì)量,md為浸泡處理d天后收集的成型顆粒烘干后的質(zhì)量。
(2)膠黏劑及濃度的選擇
在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇最合適的海帶渣與高嶺土的配比,為了進(jìn)一步增強(qiáng)固定化顆粒的成型穩(wěn)定性,在制粒過(guò)程中分別添加褐藻酸鈉、卡拉膠、明膠、羥甲基纖維素鈉四種膠黏劑水溶液,膠黏劑的添加量為原料總質(zhì)量的0.5%~1.5%。隨機(jī)挑取制得的10粒固定化菌劑分別浸泡在數(shù)只盛有50ml海水的錐形瓶中,并在放入后1-12天區(qū)間取出每個(gè)錐形瓶中的顆粒,烘干挑選出成型顆粒稱重并按公式(2)測(cè)定固定化菌劑的溶失率。通過(guò)比較四種膠黏劑制備的固定化菌劑的溶失率,選取最合適的膠黏劑制備固定化顆粒,放入海水中,延長(zhǎng)浸泡時(shí)間至90天,按上述方法測(cè)定其不同時(shí)間段的溶失率。
3)固定化菌劑的制備工藝
步驟一:菌液制備
取–80℃甘油管藏的上述菌株e3于2216e培養(yǎng)基中活化并擴(kuò)大培養(yǎng)至od630≈(1.2~2.3)×109cfu/ml];接種于30l發(fā)酵罐中,25℃恒溫培養(yǎng),2-3d后制得所需菌液。
步驟二:固定化過(guò)程
以質(zhì)量比1:1的比例向海帶渣中添加菌液,充分?jǐn)噭?,?0~45℃烘培至干。加入適量高嶺土,使之與海帶渣質(zhì)量比為3:7,攪拌均勻;加入上述原料總質(zhì)量0.5%~1.5%的海藻酸鈉溶液攪拌均勻,使其水含量為50%~70%。
步驟三:制粒與烘干
將攪拌好的全部樣品緩慢投入制粒機(jī),待出粒均勻后,可加大原料添加量。將制得的顆粒收集,于烘箱中30~45℃低溫烘干制得固定化菌劑,密封后低溫4℃保存。
石油降解實(shí)驗(yàn):將上述所制得的固定化菌劑接入石油培養(yǎng)基中,研究其石油降解特性。以添加含等量菌體的菌液為陽(yáng)性對(duì)照,以未添加固定化菌劑和菌液的石油培養(yǎng)基為空白對(duì)照。上述每種處理設(shè)3個(gè)平行,在150r/min,20℃,避光的條件下分別培養(yǎng)21d。
石油降解率測(cè)定方法:降解21d后,用50mlch2cl2分三次倒入三角瓶中萃取培養(yǎng)液中殘余石油。取20mlch2cl2相萃取液轉(zhuǎn)移到尖底燒瓶中,40℃減壓濃縮,氮?dú)獯蹈?按照公式(3)計(jì)算降解率。
式中,m0為最初加入培養(yǎng)基中的石油重量;m1為石油培養(yǎng)基萃取后殘留油樣重量。
海帶渣柴油吸附能力測(cè)試:
取數(shù)個(gè)100ml錐形瓶,分別加入50ml過(guò)濾海水和1ml柴油(0.85g),取0.3g海帶渣于錐形瓶?jī)?nèi)后將錐形瓶放置于搖床上,分別在0min、5min、10min、15min、20min、30min、60min、120min時(shí)取出,用塞住脫脂棉(0.03g)的漏斗過(guò)濾并獲得濾液。使用20ml正己烷分兩次萃取濾液,氮吹,定量剩余柴油質(zhì)量,按照公式(1)計(jì)算海帶渣的柴油吸附率。以上實(shí)驗(yàn)每組做三個(gè)平行。
m0為模擬體系中添加的柴油含量,ma為模擬體系中海帶渣的質(zhì)量,mb為經(jīng)萃取后剩余柴油的質(zhì)量,mc為陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)中脫脂棉的吸油量。
在本實(shí)施例中通過(guò)向裝有50ml滅菌海水的三角瓶中加入1ml柴油,來(lái)模擬海上浮油污染環(huán)境。在加入海帶渣材料后,我們從不同時(shí)間點(diǎn)取出材料,對(duì)柴油吸附量進(jìn)行檢測(cè),研究海帶渣的動(dòng)態(tài)柴油吸附過(guò)程,并分析海帶渣的最大柴油吸附能力。
海帶渣的吸油率在0-20min時(shí)間段內(nèi)緩慢上升,并于30min左右達(dá)到最大,吸油率為128%,隨著時(shí)間延長(zhǎng),吸油率基本穩(wěn)定在該水平不變,這說(shuō)明海帶渣中的纖維素成分可在短時(shí)間內(nèi)吸附超過(guò)自身重量的柴油。
三、固定化顆粒植物載體的特性改良
1)配重劑添加比例
為了增強(qiáng)制得顆粒的密度和降低顆粒的溶失率,選取了高嶺土來(lái)配合海帶渣。從圖2中可以看到,當(dāng)高嶺土含量從10%增加到30%時(shí),制備得到的海帶渣-高嶺土復(fù)合顆粒的密度也迅速增加到1.47g/cm3,而顆粒的海水溶失率則迅速下降至8%左右。而當(dāng)高嶺土的含量繼續(xù)增加,顆粒密度的增加幅度和海水溶失率的下降幅度都很小。所以,綜合考慮到顆粒的固定化效果和其下沉性能,當(dāng)添加的海帶渣與高嶺土的質(zhì)量比7:3時(shí),所制得的顆粒具有較大的密度和較低的溶失率,也保證足夠大的海帶渣添加量,以獲得較好的油污吸附性能和菌體吸附率。
2)膠黏劑選擇結(jié)果
為了進(jìn)一步降低海帶渣-高嶺土復(fù)合顆粒在海水介質(zhì)中長(zhǎng)時(shí)間浸泡的溶失率,考察了四種有機(jī)高分子材料:褐藻酸鈉、卡拉膠、明膠、羥甲基纖維素鈉作為膠黏劑制備的顆粒,在12天海水浸泡實(shí)驗(yàn)中的溶失率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,相同的含量條件下,以海藻酸鈉為膠黏劑制備的固定化顆粒,其海水浸泡12天的溶失率小于15%,而其他三種則均高于15%。
以上結(jié)果表明,海藻酸鈉作為膠黏劑所制得顆粒的耐水性較好,初步滿足了在海水中長(zhǎng)期浸泡的要求。以海藻酸鈉為膠黏劑制備固定化顆粒,在進(jìn)行為期90天的海水浸泡實(shí)驗(yàn)中,也表現(xiàn)出較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4),整個(gè)海水浸泡期間,固定化顆粒的溶失率不超過(guò)23%,證實(shí)用海藻酸鈉作為膠黏劑制備的固定化顆??梢詽M足在海水環(huán)境中長(zhǎng)期存在的要求。
實(shí)施例2
以最優(yōu)原料配比條件來(lái)固定石油降解細(xì)菌,首先將700g海帶渣和700ml菌液,充分?jǐn)噭?,?0~45℃烘培至干;然后加入300g高嶺土,攪拌均勻;將5~15g海藻酸鈉溶解于500~700ml水中,與上述原料混合,攪拌均勻,緩慢投入制粒機(jī),將制得的顆粒收集,于烘箱中30~45℃低溫烘干制得固定化菌劑,成品如圖5所示,菌劑為直徑為1cm,高為2~3cm的白褐色圓柱形顆粒。
將含等量石油降解菌的液體菌劑和固定化菌劑添加至石油培養(yǎng)基中,經(jīng)過(guò)21d的降解實(shí)驗(yàn),通過(guò)重量法測(cè)定固定化菌劑、液體菌劑和自然風(fēng)化(陰性對(duì)照)的石油降解率。結(jié)果如圖6所示,與自然風(fēng)化(11.0%)和液體菌劑(31.0%)相比,固定化菌劑的石油降解率有了顯著提高(p<0.01),分別提高了接近40%和18%,而液體菌液相對(duì)于自然風(fēng)化,石油降解率僅提高近20%。這說(shuō)明采用海帶渣的細(xì)菌固定化技術(shù)可為細(xì)菌降解提供合適的生存空間,減弱外界復(fù)雜環(huán)境對(duì)菌體的干擾,保持菌體的活性,使得石油降解能力明顯提高。