本發(fā)明屬于微生物
技術領域：
，具體涉及一株有效防治櫻花根癌病的蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)h-b-1及其應用。
背景技術：
：櫻花是世界著名的觀賞花木，隸屬于薔薇科(rosaceae)櫻屬(cerasus)，分布于北半球溫暖地區(qū)，為北溫帶植物。櫻花系淺根性植物，喜微酸疏松肥沃、排水良好的土壤和背風向陽濕潤的環(huán)境。我國擁有十分豐富的櫻花資源，遠遠超過日本及相鄰國家，分布范圍非常廣泛，從東北到西南都有分布，其中有許多觀賞價值極高的種類。近年來櫻花因其株型優(yōu)美、花色艷麗、花期延續(xù)期長且具有極高的觀賞價值而引起苗木培育者的廣泛重視，但是隨著種植面積的不斷增加，所受病害侵染的面積也不斷擴大，其中以櫻花根癌病、櫻花穿孔病及櫻花流膠病最為嚴重。根癌病也稱冠癭病、根頭癌、根腫病，它是由根癌農桿菌引起的且具有嚴重危害的細菌性病害，該病害在全世界范圍均有不同程度的發(fā)生。宋玉雙等人研究發(fā)現(xiàn)，土壤農桿菌的的寄主范圍非常廣泛，可以侵染93個科331屬643余種不同植物，其中以危害雙子葉植物為主，在特殊條件下也可侵染裸子植物和單子葉植物。根癌病的侵染途徑主要是通過傷口。發(fā)病部位主要為根頸、側根和枝干，典型癥狀是在病發(fā)部位形成形狀大小不一的腫瘤。發(fā)病部位初期的病狀為先形成乳白色、如豆粒般微小的瘤狀物，之后隨著苗木的生長瘤狀物逐漸長大，顏色漸深，表面由光滑變成粗糙，進而由內部木質化而變的質地堅硬，呈現(xiàn)出黑褐色，干枯龜裂后變成不規(guī)則形狀，該病害發(fā)生嚴重時瘤體可以將根頸或是枝條包圍?；疾≡缙冢缒净驑潴w的地上部分無明顯癥狀。隨著腫瘤的變大，植株虛根變少，樹勢由強變弱，進而造成葉片黃化，提早落葉。發(fā)病嚴重時，植株在營養(yǎng)吸收和水分運輸方面均會受到影響，植株生長減慢，產量逐年下降，最后直至死亡。櫻花根癌病由根癌土壤桿菌引起，在生產上造成了非常大的損失，1996年被列入國內森林檢疫對象名單。櫻花得病后最明顯的癥狀是在根莖處產生球狀或半球狀瘤狀物，瘤狀物隨著苗木的生長而慢慢長大，嚴重影響了櫻花苗木生長速度和樹勢，降低了觀賞品質和商品價值。病害發(fā)生輕時引起提前落葉，嚴重時可引起整樹枯死，被花農稱為櫻花的“癌癥”。目前針對櫻花根癌病的防治手段主要以化學防治和生物防治為主。utkheders等(1993)在蘋果田間試驗中用氫氧化銅溶液處理發(fā)病幼樹的根部，結果發(fā)現(xiàn)試驗組根瘤數(shù)目較之對照組減少；王慧敏等(1995)通過測定殺菌劑和抗菌素對3種生物型根癌農桿菌的抑菌作用，研究發(fā)現(xiàn)硫酸鏈霉素對全部根癌菌的抑制作用都很好；福美雙對生物ⅲ型根癌農桿菌所有菌株都有較強抑制作用；青霉素鈉只對生物ⅲ型有較好的抑制作用；其他藥劑均無作用。但是長期的使用化學農藥會對環(huán)境和生態(tài)平衡帶來一系列嚴重問題，而生物防治近些年來因其成本低、污染小、防治效果顯著而備受青睞，一些科學工作者在根癌病防治工作期間也篩選出了不同種類且防治效果顯著的生防菌株。kerr教授從桃樹冠癭病患病植株根際土壤中分離得到的菌株k84，可以有效抑制致病型根癌土壤桿菌生長；akira(2007)從日本的葡萄苗木上分離得到的葡萄土壤桿菌var03-1，無致病性，且能產生一種細菌素，可以抑制番茄和葡萄上由致病性葡萄土壤桿菌g-ag-27所引起的腫瘤的形成。芽孢桿菌因培養(yǎng)周期短、生產方便而日益成為生防菌的優(yōu)勢菌株。它是一類產芽孢的革蘭氏陽性細菌，好氧或者兼性厭氧生活，能夠產生耐熱、耐旱、抗紫外線和抗有機溶劑的內生孢子，所產芽孢可制成粉劑、可濕性粉劑等各種劑型，且與化學農藥混用后不失活，是理想的生防菌篩選對象。苜蓿是一般用于醫(yī)院呼吸道感染細菌致病性測定的模式植物。2002年laura用一種在cf病人體內常檢測到的病原菌psudomnoasaeruginosa對苜蓿和老鼠分別接種，比較研究結果發(fā)現(xiàn)，苜?？梢源胬鲜笞鳛槟Ｊ街参餃y定該菌對哺乳動物的毒性，甚至苜蓿模型表現(xiàn)出了比老鼠模型更高的靈敏度(lauraetal.，2002)。隨后，steve對bcc做了同樣的比較測試，發(fā)現(xiàn)bcc在苜蓿上的發(fā)病率與在老鼠上的結果呈正相關，可以代替老鼠作為測定bcc對動物毒性的模式植物(steveetal.，2003)。用苜蓿模型可簡單快捷的檢測出bcc菌株對哺乳動物是否具有致病性，這為我們在農業(yè)和環(huán)保中安全利用bc奠定了堅實的基礎。近些年來，有關芽孢桿菌在櫻花根癌病生物防治領域的研究鮮有報道。因此，將芽孢桿菌用于櫻花根癌病的生物防治工作，有利于對該病害更好的防治。技術實現(xiàn)要素：發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種有效防治櫻花根癌病的蠟樣芽孢桿菌h-b-1。本發(fā)明的另一目的是提供上述蠟樣芽孢桿菌的用途。技術方案：為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下：一株有效防治櫻花根癌病的細菌菌株，分類命名為蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)h-b-1，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心cctcc，保藏編號cctccno：m2017214，保藏日為2017年4月27日，保藏地址：中國武漢武漢大學。該有效防治櫻花根癌病的蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)h-b-1，是一株從患根癌病桃樹根際土壤篩選獲得的對根癌病菌具有拮抗作用的生防細菌菌株。蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)h-b-1在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上菌落較小，淡黃色，直徑一般2-3mm，圓形，邊緣不整齊，表面光滑濕潤，菌體直桿狀，大小為0.7×(1～2)μm。革蘭氏染色表現(xiàn)為陰性；測得16srdna大部分序列1444bp，具體如seqidno.1所示。將所測16srdna序列通過blast比對，能在genbank中找到同源性非常高的相近菌株序列。與h-b-1菌株相似性最高的是bacillusthuringiensis和bacilluscereus，同源性都達到99％。構建進化樹發(fā)現(xiàn)，h-b-1與bacilluscereus同屬一個遺傳分枝，親緣關系十分接近。通過生理生化試驗發(fā)現(xiàn)該菌吲哚反應為陰性；接觸酶反應結果為陽性；甲基紅反應結果為陽性；淀粉水解試驗為陽性；v-p試驗、硝酸鹽還原反應和檸檬酸鹽反應結果也都呈現(xiàn)陽性；伴孢晶體染色發(fā)現(xiàn)該菌不具有伴孢晶體；因此判定該菌為蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)，命名為蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)h-b-1。上述蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1及其代謝產物對櫻花根癌病病原菌根癌農桿菌(agrobacteriumtumefaciens)具有一定的抑菌作用，因此能夠高效防治櫻花根癌病。上述蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1對櫻花還具有促生長的作用。上述蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1防治效果較好的發(fā)酵條件如下：培養(yǎng)基：每1000ml蒸餾水，含牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，ph7.2。工藝條件為：ph6～7，通氣量1：1，28℃～30℃，搖床轉速180～200轉/分，24小時。通過上述發(fā)酵工藝得到的發(fā)酵液即為一種微生物殺菌劑。該發(fā)酵液與水按照1:5比例稀釋并加入適量土壤打成泥漿對植物裸根進行蘸漿處理即可發(fā)揮其殺菌作用。有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1，為植物根際生防促生細菌，對櫻花根癌病有較好的防治效果，同時對櫻花的生長具有促生作用。該蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè)化生產，具有良好的開發(fā)應用前景。附圖說明圖1是蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1的抑菌結果圖；圖2是蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1的發(fā)酵濾液對根癌土壤桿菌的拮抗作用結果圖；圖3是蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1對溫室指示植物根癌病的抗病作用結果圖。具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1：蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1通過瓊脂擴散法測定它們對根癌病菌菌株生長的抑制作用。將純化培養(yǎng)的致瘤土壤桿菌與土壤中分離的細菌制成107～108cfu/ml菌懸液，將致瘤農桿菌a-4菌懸液按5％的接種量與改良523培養(yǎng)基混合，搖勻。每皿加入25ml混有致瘤農桿菌的改良523培養(yǎng)基，凝固后在培養(yǎng)基上用打孔器打2～3個孔，在每孔中加入130μl的土壤細菌菌懸液，置于28℃培養(yǎng)24h～48h，測其抑菌圈直徑。結果表明如圖1所示，左圖為抑菌圖，右圖為ck對照，可見蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1的抑菌效果好，抑菌直徑為7.67cm，其抑菌活性明顯優(yōu)于其它菌株抑菌能力。實施例2：蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1發(fā)酵液與根癌病菌菌株進行平板抑菌能力的測定。將蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1菌株的甘油保藏液按2％的接種量接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，搖培24h。將細菌發(fā)酵液用0.22μm的細菌過濾器過濾即得細菌發(fā)酵濾液。按20％的接種量將每株菌的細菌發(fā)酵濾液與培養(yǎng)基(改良的523培養(yǎng)25ml)混勻，取直徑0.6cm的濾紙片沾取根癌土壤桿菌的菌懸液，適度風干后置于混有細菌發(fā)酵濾液的平板上，每平皿2～3個濾紙片，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后測量菌落直徑。結果發(fā)現(xiàn)菌株h-b-1表現(xiàn)出一定的拮抗活性。菌株的發(fā)酵濾液對根癌病菌菌株的抑菌活性用24h～48h所測得的病原菌菌落直徑大小為1.05cm，低于對照空白處理的2.37cm(圖2，左圖為結果圖，右圖為ck對照)。實施例3：蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1對溫室指示植物根癌病的抗病作用購買番茄幼苗，將其置于混合培養(yǎng)土中培養(yǎng)。待幼苗伸出土面15cm左右時接種(選取長勢相似的健壯幼苗)，在接種前半小時取出待接菌(分離的6株土壤細菌)，使培養(yǎng)菌的溫度恢復至室溫，然后開始接種。先將解剖針在酒精燈上燒灼滅菌，待解剖針冷卻至室溫后，挑取分離純化后的細菌刺至幼苗的莖部，用脫脂藥棉蘸取無菌水在接種處用封口膜綁縛，保濕5～7d；接種櫻花根癌病菌前半小時取出待接菌，使培養(yǎng)菌的溫度恢復至室溫，然后開始接種。先將解剖針在酒精燈上燒灼滅菌，待解剖針冷卻至室溫后，挑取分離純化后的細菌刺至幼苗根莖處，用脫脂藥棉蘸取無菌水在接種處用封口膜綁縛，保濕5～7d。接種菌株h-b-1和病原菌菌株；單獨接種病原菌菌株作為對照、不接菌作為空白對照，共三個處理，每個處理做5個重復，在室溫為23士5℃的溫室里培養(yǎng)生長。3周后觀察是否發(fā)病。結果發(fā)現(xiàn)僅接種桃根癌病病菌的植株莖部明顯腫大，同時接種菌株h-b-1和病原菌菌株的植株莖部略微腫大，表明h-b-1有一定的抗病作用(圖3，左棵為僅接種病原菌，右棵為同時接種h-b-1和病原菌)。實施例4：蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1野外防治櫻花根癌病的抗病效果將蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1施用于根癌病嚴重發(fā)生的野外田間地塊，取母菌液2l，加水定容10l桶中，稀釋5倍，攪拌混勻，加適當土攪拌至呈粘稠狀，做成漿液。將裸根櫻花苗逐一放入桶中浸沒根部，待表面包裹一層泥漿后取出，放入事先挖好的土穴栽植。試驗結果顯示該菌株對一年生新造林地健康櫻花具有良好的防治根癌病效果。根部沾漿法施用該菌株的100棵櫻花苗木，其發(fā)病率為13.3％，遠低于空白處理的53.3％。根瘤直徑平均18.8mm，低于空白處理的28.58mm(表1)。因此判定該菌株能夠有效防治櫻花根癌病。除此之外h-b-1菌株對一年生櫻花苗還具有優(yōu)良的促生作用(表2)。表1、一年生櫻花實驗苗發(fā)病統(tǒng)計菌株發(fā)病率(％)根瘤直徑(mm)成活率(％)ck53.328.5851h-b-113.318.891表2、一年生櫻花苗生長量統(tǒng)計菌株苗高(cm)地徑(mm)ck4.1±2.3b4.4±2.1bh-b-137.2±19.2a7.71±2.7a實施例5：蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1對洋蔥致病性測定。致病性測定參照sijam等(2005)的方法，用注射器取蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1菌懸液(1×107～108cfu/ml)在洋蔥鱗莖上兩點對稱注射(深度為1～2cm)，每點注射量為1ml。以滅菌水處理為對照。所有處理均重復3次，置于26℃培養(yǎng)，4～5天后檢查結果。洋蔥鱗莖接種試驗表明，注射接種蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1不引起洋蔥鱗莖的腐爛，只是在接種處稍有干癟凹陷。以上說明蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1不是植物病原細菌，對植物具有安全性。實施例6：蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1對苜蓿的接種試驗。將h-b-1接種到nb培養(yǎng)基中，30℃下震蕩(150mrp)培養(yǎng)24h，用無菌水調節(jié)菌懸液濃度到109左右用于接種。用laura的方法來準備要接種的苜蓿種子(lauraetal.，2002)。將紫花苜蓿種子用98％濃硫酸浸泡20分鐘(約10ml浸300顆種子)，用500ml滅菌水清洗4次，然后泡在60ml滅菌水中，32℃下震蕩(150prm)浸種6～8小時，再清洗2次，換水后同樣條件培養(yǎng)過夜。次日再用滅菌水清洗2次后(每次60ml水)，用無菌鑷子擺放到1％的水瓊脂平板上等待接種，每皿擺放20顆種子。將水瓊脂平板上的苜蓿種子用接種針在子葉上刺一個小孔，取20ml準備好的菌懸液點在傷口處，每菌株接種3個重復，每重復20顆種子，設2種ck處理，其中1個不作任何處理，另l個針刺接種無菌水。接種后的種子在37℃、70％相對濕度、定時光照(12h光照，12h黑暗)條件的人工氣候箱中培養(yǎng)，7天后檢查發(fā)病率。苜蓿接種結果顯示，無論是ck還是接種處理，均無發(fā)病癥狀(接種點附近壞死、黃化和根畸)出現(xiàn)。苜蓿是代替老鼠作為測定bcc對動物毒性的模式植物(steveetal.，2003)，用苜蓿模型可簡單快捷的檢測出bcc菌株對哺乳動物是否具有致病性。上述試驗結果說明蠟樣芽孢桿菌菌株h-b-1對哺乳動物沒有毒害性。sequencelisting<110>南京林業(yè)大學<120>一株有效防治櫻花根癌病的蠟樣芽孢桿菌h-b-1及其應用<130>100<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1444<212>dna<213>bacilluscereus<400>1gcggcgtgcctatacatgcaagtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagtta60gcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccataagactgggataactccggga120aaccggggctaataccggataacattttgaaccgcatggttcgaaattgaaaggcggctt180cggctgtcacttatggatggacccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggctcac240caaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacg300gcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacg360gagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaaga420acaagtgctagttgaataagctggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaa480ctacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcg540taaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggag600ggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgtgtagcg660gtgaaatgcgtagagatatggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaac720tgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgc780cgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgaagttaacgca840ttaagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacggggg900cccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggt960cttgacatcctctgaaaaccctagagatagggcttctccttcgggagcagagtgacaggt1020ggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgc1080aacccttgatcttagttgccatcattaagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaa1140accggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacac1200gtgctacaatggacggtacaaagagctgcaagaccgcgaggtggagctaatctcataaaa1260ccgttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaa1320tcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaca1380ccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggggtaacctttttggagccagccgcctaa1440ggtg1444當前第1頁12