本發(fā)明屬于食用菌藥用菌遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種紫外線二次誘變育種的方法，尤其涉及一種提高菌種的變異量的蛹蟲草紫外線二次誘變育種的方法。

背景技術(shù)：

冬蟲夏草(拉丁學(xué)名cordycepssinensis(berk.)sacc)又名蟲草，是我國特產(chǎn)的一種名貴滋補(bǔ)藥材，與人參、鹿茸齊名，為傳統(tǒng)三大補(bǔ)品之一。其營養(yǎng)成分高于人參，可入藥，也可食用，是上乘的佳肴，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。冬蟲夏草可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，滋補(bǔ)肺腎，對肺癌、肝癌等有明顯的抑制作用。在臨床上對肺虛久咳，氣喘，肺結(jié)核咯血，盜汗，腎虛腰膝酸痛，陽痿遺精，神經(jīng)衰弱及化療、放療后的紅細(xì)胞下降都有療效。

蛹蟲草(拉丁學(xué)名cordycepsmilitaris)，又稱作北冬蟲夏草、北蟲蛹草、北蛹蟲草等，屬于麥角菌科蟲草屬，與冬蟲夏草同屬異種，藥用價(jià)值與馳名中外的冬蟲夏草相似。蛹蟲草世界性分布，天然資源數(shù)量很少，在我國主要產(chǎn)于云南(昆明、安寧、江川)、吉林(安圖、永吉)、遼寧(沈陽)、內(nèi)蒙古(哲里木盟)等地，生于針、闊葉林或混交林地表土層中鱗翅目昆蟲的蛹體上。

蛹蟲草對環(huán)境的要求較低，液體發(fā)酵可形成菌絲體，人工大規(guī)模固體培養(yǎng)可獲得子座。蛹蟲草的成分如蟲草多糖和蟲草酸，與天然的冬蟲夏草的含量相當(dāng)，有些成分的含量甚至超過冬蟲夏草，如蟲草素的含量是天然冬蟲夏草的35倍以上。蛹蟲草的有效活性成分蟲草多糖被認(rèn)為是非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，可激活肌體的免疫細(xì)胞。與冬蟲夏草相比，蛹蟲草具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：蛹蟲草作為蟲草屬的模式種，分布廣泛，為世界各國學(xué)者所認(rèn)識和接受；蛹蟲草已在人工條件下育成了完整子座；蛹蟲草含有蟲草素和蟲草多糖，其獨(dú)特藥理作用已日益引起藥學(xué)界的高度重視。因?yàn)榫哂幸陨蟽?yōu)點(diǎn)，蛹蟲草已經(jīng)成為蟲草屬中藥用蟲草菌中的佼佼者。

由于蛹蟲草獨(dú)特的藥用價(jià)值、營養(yǎng)價(jià)值、科研價(jià)值以及潛在的巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值，人工培育蛹蟲草的技術(shù)受到了廣泛關(guān)注。蛹蟲草栽培是一系列復(fù)雜操作的工作程序，包括菌株選擇、母種選育與保存、菌種制備、出草管理以及市場銷售等，每個(gè)程序都必不可少且至關(guān)重要。其中育種又是這些程序中的首要內(nèi)容，沒有優(yōu)良的菌種，其他工作程序的準(zhǔn)備或優(yōu)化就沒有基礎(chǔ)，最終可能直接造成蛹蟲草減產(chǎn)或栽培失敗。

然而現(xiàn)有的蛹蟲草人工培養(yǎng)多關(guān)注改進(jìn)或優(yōu)化培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件或總體考慮各個(gè)步驟的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，少關(guān)注菌種馴化。例如，cn1724641a公開了一種北冬蟲夏草液體菌種營養(yǎng)基的制備方法及其應(yīng)用。該發(fā)明主要通過選取不同的原料，包括胡蘿卜、葡萄糖等物料，然后進(jìn)行充分混合，再加入一定量的鏈霉素后進(jìn)行發(fā)酵，制得北冬蟲夏草液體菌種營養(yǎng)基；然后在培育北冬蟲夏草的過程中進(jìn)行溫度、時(shí)間的不同控制，以達(dá)到較好的培育效果。cn101463325a公開了一種北冬蟲夏草工廠化栽培方法，經(jīng)菌種制備、配料裝瓶、滅菌、接種、培養(yǎng)、出草采收步驟、工廠化栽培北冬蟲夏草，采用了常見的人工代料作為培養(yǎng)材料，降低了生產(chǎn)成本。該發(fā)明獲得的北冬蟲夏草質(zhì)量穩(wěn)定性好，生物轉(zhuǎn)化率高。cn104054513a公開了一種可以代替冬蟲夏草入藥、能代替天然冬蟲夏草藥源的北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法，該技術(shù)方案包括下列步驟：(1)母種制備；(2)母種轉(zhuǎn)原種和栽培種；(3)懸浮液菌種或/液體菌種的制備；(4)北冬蟲夏草菌種的人工栽培。該發(fā)明公布的北冬蟲夏草菌種培養(yǎng)方法，能夠增加冬蟲夏草的產(chǎn)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決蛹蟲草人工培養(yǎng)菌株篩選問題，本發(fā)明提供一種蛹蟲草紫外線二次誘變育種的方法。本發(fā)明提供的方法能大幅度地增加菌種的變異量，從而有利于技術(shù)人員從誘變后的群體中篩選優(yōu)良菌株。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種蛹蟲草紫外線二次誘變育種的方法，包括如下步驟：

1)準(zhǔn)備蛹蟲草孢子懸浮液；

2)第一次誘變處理；

3)第二次紫外線照射誘變處理；

4)挑菌篩選。

優(yōu)選地，所述第二次紫外線照射誘變處理的照射時(shí)間為1～2.5分鐘。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述第二次紫外線照射誘變處理，照射時(shí)間為2分鐘。

優(yōu)選地，所述第一次誘變處理選自紫外線誘變處理、x光線誘變處理、y射線及硫酸二乙酯誘變處理、5-溴尿嘧啶誘變處理、氮芥誘變處理、n"廣甲基n"亞硝基胍誘變處理中的一種。

優(yōu)選地，所述第一次誘變處理為紫外線照射誘變處理，照射時(shí)間為0.8～1.5分鐘。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述第一次誘變處理為紫外線照射誘變處理，照射時(shí)間為1分鐘。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，在第二次紫外線照射誘變處理之前，應(yīng)先將紫外線光源紫外燈開啟20～60分鐘。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在第二次紫外線照射誘變處理之前，應(yīng)先將紫外線光源紫外燈開啟20分鐘。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，在第一次紫外線照射誘變處理之前，應(yīng)先將紫外線光源紫外燈開啟20～60分鐘。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在第一次紫外線照射誘變處理之前，應(yīng)先將紫外線光源紫外燈開啟20分鐘。

制備蛹蟲草孢子懸浮液選用無菌生理鹽水或磷酸緩沖液均可。

紫外照射誘變誘變處理應(yīng)在黑暗處進(jìn)行，優(yōu)選黑暗無菌室或超凈工作臺，箱內(nèi)裝15-20瓦紫外燈1支，懸掛于30厘米高處。誘變處理時(shí)應(yīng)先開燈20～60分鐘，使紫外燈波長穩(wěn)定，然后將蛹蟲草孢子懸浮液倒入無菌培養(yǎng)皿中，打開皿蓋，照射數(shù)分鐘。

當(dāng)蛹蟲草孢子懸浮液每毫升所含的活孢子數(shù)約在106～113個(gè)時(shí)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，為得到單個(gè)菌落，孢子懸浮液稀釋倍數(shù)范圍可以是1000-10萬倍。

本發(fā)明取得了以下技術(shù)效果：

本發(fā)明提供的方法能大幅度地增加蛹蟲草孢子的變異量，從而有利于技術(shù)人員從誘變后的群體中篩選優(yōu)良菌株，進(jìn)而篩選出蟲草素、腺苷、多糖或蛹蟲草產(chǎn)量高的優(yōu)良菌株，以提高蛹蟲草的藥用/食用價(jià)值以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

具體實(shí)施方式

為了促進(jìn)對本發(fā)明的理解，以下將參考某些實(shí)施方式，并且將使用特定語言來描述本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，這些具體實(shí)施方式不意圖限制本發(fā)明的范圍。所描述的實(shí)施方式中的任何改變和進(jìn)一步的修改，以及本發(fā)明的任何進(jìn)一步應(yīng)用，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員通常會(huì)想到的。

實(shí)施例1蛹蟲草紫外線二次誘變育種的方法

包括四個(gè)步驟：

1)準(zhǔn)備蛹蟲草孢子懸浮液

出發(fā)菌株：蛹蟲草品種ycc-01。

將新鮮的無菌孢子移入5ml無菌生理鹽水中，搖勻后即成孢子懸浮液。孢子懸浮液的終濃度為每毫升含孢子108～115個(gè)。

2)第一次誘變處理

在黑暗超凈工作臺進(jìn)行，箱內(nèi)裝15-20瓦紫外燈1支，懸掛于30厘米高處，誘變處理時(shí)應(yīng)先開燈20分鐘，使波長穩(wěn)定，然后將蛹蟲草孢子懸浮液倒入直徑為6厘米的無菌培養(yǎng)皿中，打開皿蓋，照射1分鐘。

經(jīng)檢測，照射后的蛹蟲草孢子懸浮液每毫升所含的活孢子數(shù)約在106～113個(gè)。

因此為得到單個(gè)菌落，先用無菌水將照射后的孢子懸浮液稀釋10萬倍、100萬倍、1000萬倍，然后分別取釋釋液0.3ml涂布于裝有瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，在22℃下培養(yǎng)4～6天直到每個(gè)平板上得到單菌落。

3)第二次紫外線照射誘變處理

在黑暗超凈工作臺進(jìn)行，箱內(nèi)裝15-20瓦紫外燈1支，懸掛于30厘米高處，誘變處理時(shí)應(yīng)先開燈20分鐘，使波長穩(wěn)定，然后將第一次誘變處理得到的蛹蟲草單菌落平板打開皿蓋，照射2分鐘。選純正、健壯的單個(gè)菌落移入斜面試管內(nèi)，供下一步挑菌篩選。

4)挑菌篩選

選純正、發(fā)育健全的單個(gè)菌落移入斜面試管內(nèi)，一個(gè)菌落只接一支斜面，待長好后，再分別接入2～3瓶300ml液體營養(yǎng)液中，然后分級進(jìn)行栽培試驗(yàn)，按照本領(lǐng)域常規(guī)方法檢測蛹蟲草蟲草素的含量以評價(jià)蛹蟲草的變異量。

實(shí)施例2蟲草素的含量檢測方法

參考cn102060898b實(shí)施例5公開的方法。

稱取150g的干燥人工培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體，用力壓碎后，加入到行星球磨機(jī)的250ml球磨灌中，調(diào)整轉(zhuǎn)速為500r/min，氧化鋁球個(gè)數(shù)為20(10大球和10小球)，采用正反交替研磨，交替時(shí)間5min，處理總時(shí)間為30min，得到蛹蟲草子實(shí)體粉末。將150g粉末加入到1500ml的蒸餾水中，用0.1mol/lhcl調(diào)整ph為2.5，溫度為45℃，用頻率為30khz超聲波處理1h，處理完后離心(3000r/min，10min)，收集上清液，在上清液中加入45g活性炭吸附色素，再過濾，在濾液中再加入45g活性炭吸附色素，重復(fù)操作，直到上清液沒有顏色為止，將此上清液先用300ml的乙酸乙酯在空化混懸萃取裝置中萃取，棄去乙酸乙酯層，剩余液體再用300ml的氯仿在空化混懸萃取裝置中萃取，棄去氯仿層，剩余液體上d101層析柱，先用蒸餾水洗脫至流出液無色，再用ph為5.5的體積分?jǐn)?shù)為50％的乙醇水溶液以1ml/min速度洗脫，收集洗脫液，真空干燥即得蟲草素晶體，稱量得到每150g的干燥人工培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體蟲草素含量。

實(shí)施例3菌種變異量檢測

以蟲草素的含量為評價(jià)指標(biāo)評價(jià)誘變處理后蛹蟲草的變異量。

待檢測樣品：

樣品1：實(shí)施例1第一次誘變處理后得到的單菌落選純正、發(fā)育健全的100個(gè)單菌落移入斜面試管內(nèi)，一個(gè)菌落只接一支斜面，待長好后，再分別接入2～3瓶300ml液體營養(yǎng)液中，分級進(jìn)行栽培。分別測定每個(gè)單菌落培養(yǎng)得到的子實(shí)體的蟲草素含量。

樣品2：實(shí)施例1第二次紫外線照射誘變處理后得到的單菌落選純正、發(fā)育健全的100個(gè)單菌落移入斜面試管內(nèi)，一個(gè)菌落只接一支斜面，待長好后，再分別接入2～3瓶300ml液體營養(yǎng)液中，分級進(jìn)行栽培。分別測定每個(gè)單菌落培養(yǎng)得到的子實(shí)體的蟲草素含量。

對照樣品1：未做誘變處理的蛹蟲草品種ycc-01無菌孢子移入5ml無菌生理鹽水或磷酸緩沖液中，搖勻后即成孢子懸浮液。孢子懸浮液的終濃度為每毫升含孢子108～115個(gè)。取釋釋液0.3ml涂布于裝有瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，在22℃下培養(yǎng)4～6天直到每個(gè)平板上得到單菌落。選純正、發(fā)育健全的100個(gè)單菌落移入斜面試管內(nèi)，一個(gè)菌落只接一支斜面，待長好后，再分別接入2～3瓶300ml液體營養(yǎng)液中，分級進(jìn)行栽培。分別測定每個(gè)單菌落培養(yǎng)得到的子實(shí)體的蟲草素含量。

對照樣品2：按照實(shí)施例1第一次誘變處理的方法處理蛹蟲草孢子，處理時(shí)間為3分鐘。選純正、發(fā)育健全的100個(gè)單菌落移入斜面試管內(nèi)，一個(gè)菌落只接一支斜面，待長好后，再分別接入2～3瓶300ml液體營養(yǎng)液中，分級進(jìn)行栽培。分別測定每個(gè)單菌落培養(yǎng)得到的子實(shí)體的蟲草素含量。

蛹蟲草栽培方法：

1)采用馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母膏2g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，水1000ml配方按常規(guī)繁育生產(chǎn)用液體菌種。

2)采用750ml的玻璃罐頭瓶為容器，每瓶45克小麥，加水70ml，1.05公斤/平方厘米壓力滅菌75分鐘，冷卻接種。

3)菌瓶先放于20℃避光培養(yǎng)6天，然后轉(zhuǎn)入光暗交叉培養(yǎng)，每天白天以1000勒克斯強(qiáng)度光照，晚上暗培養(yǎng)，環(huán)境濕度85％，每天通風(fēng)3次。

4)整個(gè)生產(chǎn)周期55天，子實(shí)體長度控制在8～12厘米，其它按常規(guī)操作，每批采樣后抽樣測定蟲草素含量。

試驗(yàn)結(jié)果：

檢測結(jié)果顯示，與對照樣品1相比，樣品1中有20％以上的單菌落培養(yǎng)得到的子實(shí)體的蟲草素含量變化值在50％以上；樣品2中有80％以上的單菌落培養(yǎng)得到的子實(shí)體的蟲草素含量變化值在50％以上；對照樣品2中有40％以上的單菌落培養(yǎng)得到的子實(shí)體的蟲草素含量變化值在50％以上。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，第二次紫外線照射誘變處理能大幅度地增加菌種的變異量，且所述誘變效果(變異量)大于單純延長紫外線照射處理時(shí)間的變異量。本發(fā)明公布的蛹蟲草紫外線二次誘變育種的方法將有利于技術(shù)人員從誘變后的群體中篩選優(yōu)良菌株。

本文提供的任何和所有實(shí)施例或示例性語言(例如，“比如、諸如”)的使用僅旨在更好地說明本發(fā)明，而不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制，除非另有要求。說明書中的語言不應(yīng)被解釋為指示任何未要求保護(hù)的元件對于實(shí)施本發(fā)明是必要的。

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