本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種由d-或l-氨基酸酯和烴氧基取代芐醇共同構(gòu)成的新型核苷氨基磷酸/膦酸酯前藥及其制備方法和用途。

發(fā)明背景

核苷類化合物是脫氧核糖核酸和核糖核酸，也即生物遺傳基因dna與rna的結(jié)構(gòu)單體，在所有生命體中皆有重要功能，并被廣泛用于病毒感染和癌癥的治療。1960年代以來，許多生物活性的核苷類似物被用于治療各種病毒感染，如皰疹、艾滋病、乙型和丙型肝炎。這些人工合成的核苷類似物、能夠通過阻斷病毒核酸鏈的生長，破壞病毒基因的復(fù)制，成為抗病毒藥物(圖1)。

如圖1所示，核苷必須首先分三步活化成三磷酸核苷，才能參與dna或rna的合成，進(jìn)而表現(xiàn)出生理活性。當(dāng)一個(gè)核苷類似物能夠選擇性打入病毒或癌細(xì)胞的遺傳基因，阻止其核酸鏈復(fù)制繁殖，同時(shí)對(duì)宿主細(xì)胞基因無傷害(毒性)時(shí)，這個(gè)核苷類似物就可成為抗病毒或抗癌藥物。

三磷酸核苷本身由于攜帶多個(gè)負(fù)電荷、極性非常高，難以通過細(xì)胞壁而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，所以不能直接作為抗病毒藥物使用。早期核苷類抗病毒藥物的形式就是極性適中的核苷本身，它在進(jìn)入細(xì)胞后在宿主細(xì)胞激酶(kinase)作用下分三步磷?；?，最終成為三磷酸核苷而發(fā)揮藥效。近來隨著核苷磷酸酯類前藥技術(shù)的進(jìn)步，用化學(xué)的方法直接將單磷酸的低極性等價(jià)結(jié)構(gòu)單元引入核苷分子中，使核苷磷酸酯前藥在進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后再釋放出單磷酸核苷，而不必受核苷激酶的選擇性限制。由此，核苷磷酸酯前藥就成為了升級(jí)核苷類藥物性能的流行方式。

核苷前藥的研究是當(dāng)前一個(gè)熱點(diǎn)，尤其磷酸酯類前藥是一種最有效的升級(jí)核苷藥物的方式，也能夠使得一些由于核苷激酶限制不能磷?；暮塑毡憩F(xiàn)出生物活性，文獻(xiàn)報(bào)道的核苷的磷酸酯類前藥之結(jié)構(gòu)類型主要有七類(j.am.chem.soc.，2004，126，5154-5163；wo2012094248，cn102532199，cn103980318，cn103435672，圖2)，其杰出代表為mcguigan等發(fā)明的芳基氨基磷酸酯(2-5)，是目前在核苷類化合物前藥中應(yīng)用最為廣泛和成功的一個(gè)；核苷前藥(2-6)和(2-7)含有取代芐基，它們只能在氧化酶(如細(xì)胞色素p450酶)的幫助下，氧化裂解脫去，釋放出單磷酸核苷。由于p450酶系主要分布于肝臟，所以這些核苷前藥主要在肝細(xì)胞內(nèi)裂解釋放，被稱為肝靶向(hepdirect)前藥。

mcguigan型核苷前藥是已故英國科學(xué)家christophermcguigan于1990年代最先發(fā)明、并被不斷完善了的芳基氨基磷酸酯結(jié)構(gòu)單元(3-1，圖3)，結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是它含有一個(gè)氨基酸酯的氨基磷酰胺化生成的磷酰胺鍵p(o)-n，以及一個(gè)芳基酚參與形成的磷酯鍵p(o)-o-ar。已證實(shí)mcguigan前藥(3-1)的氨基酸酯鍵首先斷裂釋放出游離羧酸衍生物(3-2)，產(chǎn)生的羧基官能團(tuán)能夠催化酚基氧磷鍵裂解，形成五元環(huán)磷酸酯衍生物(3-3)，隨后釋放出單核苷酸(3-4)，最終代謝生成能夠參與核酸鏈聚合、具有生理活性的三核苷酸(3-6)。所以核苷前藥(3-1)乃是其單核苷酸(3-4)的等價(jià)物，它能夠用化學(xué)方式繞開選擇性高、效率差的單核苷酸激酶催化下的單磷酸酯化反應(yīng)，直接輸送核苷的5′-單磷酯進(jìn)入細(xì)胞并產(chǎn)生生物活性。其結(jié)果是mcguigan前藥能使那些因無法單磷?；ド锘钚缘暮塑罩匦戮哂猩锘钚?，或者提高已知核苷藥物的生物活性。

眾所周知，mcguigan前藥(3-1)分子中氨基酸酯的酶水解反應(yīng)引發(fā)了其后一系列生成單核苷酸(3-4)的代謝過程，而由于酯水解酶廣泛分布于腸胃消化道內(nèi)，所以化合物(3-1)的水解代謝始自于腸胃道，大量的氨基酸酯基常常在到達(dá)肝細(xì)胞之前就會(huì)被酶水解代謝。當(dāng)核苷與含取代芐基的磷酸酯結(jié)合后，生成的前藥對(duì)腸胃道酯水解酶更加穩(wěn)定，能夠提高核苷單磷酸酯前藥富集于肝細(xì)胞內(nèi)的水平，從而使得這類核苷前藥具有較好的肝靶向作用，特別適合于開發(fā)治療肝病，如肝癌和肝炎等的藥物。

綜合mcguigan前藥和hepdirect前藥的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以hepdirect前藥結(jié)構(gòu)中的取代芐基置換掉mcguigan前藥中的芳基，本申請(qǐng)人曾首次發(fā)明了由短鏈烷基取代芐醇與氨基酸酯構(gòu)成的芐基氨基磷酸酯前藥(cn102532199)。通過后續(xù)的深入研究、系統(tǒng)篩選甄別芐基苯環(huán)上取代基的不同位置和種類的藥理效應(yīng)，本人又發(fā)現(xiàn)了當(dāng)芐基苯環(huán)上帶有酚羥基、或者是可以代謝解離出酚羥基的烴氧基時(shí)，該烴氧基芐基與氨基酸酯構(gòu)成的氨基磷酸酯前藥在體外細(xì)胞中代謝釋放出核苷單磷酸酯的能力，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于相應(yīng)的短鏈烷基取代芐醇構(gòu)成的芐基氨基磷酸酯前藥。作為代謝釋放單核苷酸能力最強(qiáng)的取代芐基氨基磷酸/膦酸酯，本發(fā)明所描述的烴氧基芐基氨基磷酸/膦酸酯衍生物輸送核苷單磷酸酯的能力甚至優(yōu)于或者至少相當(dāng)于mcguigan前藥，可以大大優(yōu)化核苷類化合物的生物活性，可以成為升級(jí)核苷固有的抗病毒或抗癌活性的一種全新選擇。本文在此首次公開含有烴氧基之芐醇與氨基酸酯共同構(gòu)成的核苷氨基磷酸/膦酸酯衍生物的制備、及其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

綜合mcguigan前藥(圖2，2-5)和hepdirect前藥(2-6)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，用hepdirect前藥結(jié)構(gòu)中的取代芐基置換掉mcguigan前藥中的芳環(huán)，本發(fā)明人曾首次合成出了可以成為核苷前藥的短鏈烷基取代芐基氨基磷酸/膦酸酯前藥(cn102532199)，在此基礎(chǔ)上通過后續(xù)的深入研究、系統(tǒng)篩選甄別芐基苯環(huán)上取代基的不同位置和種類的藥學(xué)效應(yīng)，本申請(qǐng)人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)當(dāng)芐基苯環(huán)上帶有酚羥基(例如水楊醇)、或者是可以代謝解離出酚羥基的烴氧基時(shí)，該取代芐基與氨基酸酯構(gòu)成的烴氧基芐基氨基磷酸酯前藥在體外細(xì)胞中代謝釋放出核苷單磷酸酯的能力，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于相應(yīng)的短鏈烷基取代芐醇構(gòu)成的芐基氨基磷酸酯前藥，并且絲毫不亞于mcguigan類芳基氨基磷酸酯前藥。所以本發(fā)明所描述的烴氧基芐基氨基磷酸/膦酸酯前藥可以強(qiáng)化核苷類化合物的生物活性，優(yōu)化核苷固有的抗病毒或抗癌活性。

另一方面，水楊醇氧化代謝產(chǎn)物為水楊酸，所以鄰位烴氧芐基氨基磷酸酯前藥能夠克服mcguigan前藥釋放出有毒代謝產(chǎn)物苯酚的弱點(diǎn)。還有一點(diǎn)優(yōu)勢是，由于芐基磷酸酯相對(duì)于酚基磷酸酯有更高的水解穩(wěn)定性，所以烴氧芐基氨基磷酸酯前藥相對(duì)于mcguigan前藥在消化道內(nèi)的損耗會(huì)減少許多，肝靶向性更強(qiáng)因而特別適合于開發(fā)治療肝病，如肝癌和肝炎等的藥物。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。

一種式(i)所示的烴氧基芐基氨基磷酸酯/膦酸酯化合物，其立體異構(gòu)體、或其藥學(xué)可接受的鹽、水合物、溶劑化物或結(jié)晶，分子結(jié)構(gòu)中的任何一個(gè)氫原子都可以被氘原子置換。

如式(i)所示，本發(fā)明的烴氧基芐基氨基磷酸/膦酸酯前藥結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)由烴氧基芐醇參與形成的磷酯鍵和一個(gè)由l-或d-氨基酸酯參與形成的磷酰胺鍵。

其中，

r1為各種天然或非天然氨基酸側(cè)鏈，氨基酸構(gòu)型可以是d-型、l-型或者其消旋混合物；

r2可以選自c1-12飽和或不飽和烷基、鹵素(f、cl、br、i)取代的c1-12烷基、羥基取代的c1-12烷基、c1-6烷氧基羰基取代的c1-12烷基、羧基取代的c1-12烷基、氰基取代的c1-12烷基、c3-7環(huán)烷基取代的c1-6烷基、苯基取代的c1-6烷基、c1-6烷基砜基取代的c1-6烷基、c1-6烷基亞砜基取代的c1-6烷基、胺基取代的c1-12烷基、c1-6烷基酰胺基取代的c1-6烷基、c1-6烷基磺酰胺基c1-6烷基、胺基羰基c1-6烷基、單環(huán)雜環(huán)烷基c1-6烷基、c3-c8的飽和或不飽和環(huán)烷基；

r2’可以是氫、羥基、鹵素(f、cl、br、i)、氰基、硝基、c1-6烷基、c1-6烷氧基、雜原子(o、s、n)取代c1-6烷基、雜原子取代c1-6烷氧基、c3-7環(huán)烷基、c3-7環(huán)烷基取代的c1-4烷基、c3-7雜環(huán)烷基取代c1-4烷基，這里所述烷基、雜原子取代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基可以被鹵素、羥基、氰基、胺基或者硝基取代；

pg-可以是各種酚羥基的保護(hù)基，它與氧原子構(gòu)成烴氧基pg-o-。式(i)芐醇結(jié)構(gòu)中烴氧基pg-o-可以位于芐醇羥甲基hoch2-的鄰位、間位或者對(duì)位，優(yōu)選鄰位取代。

pg-可選自各類酰基：c1-c22碳鏈的直鏈或帶支鏈的脂肪酸?；鵵0-21co-、c3-c22碳鏈的不飽和的脂肪酸酰基r2-21co-、芳基甲酰基arco-、雜環(huán)芳基甲?；?、芳基烷基脂肪酸?；⑻妓狨ヵ；?如boc-、-co-或cbz-)、氨基碳酸酯?；?-nhcoo-)、丙氨?；⒏拾滨；?、脯氨?；①嚢滨；⒈奖滨；?、亮氨?；?、異亮氨?；?、纈氨?；⑸滨；?、酪胺酰基、天冬氨?；⑻於０孵；?、谷氨?；⒐劝滨０孵；?、甲硫氨?；?、蘇氨?；⒔M胺?；?、絲氨?；?、半胱氨酰基、精氨酰基或β-丙氨?；?/p>

pg-也可選自各類醚類保護(hù)基：c1-12飽和或不飽和烷基，雜原子(o、s、n)取代的c1-12烷基、c3-7環(huán)烷基、c3-7環(huán)烷基取代的c1-4烷基、c3-7雜環(huán)烷基取代c1-4烷基、取代或未取代芐基(如bn-或pmb-)、取代或未取代烯丙基、硅基r’r”r”’si-，這里所述烷基、雜原子取代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基可以被鹵素、羥基、氰基、胺基或者硝基取代；

pg-還可以是縮醛類保護(hù)基：甲氧基亞甲基mom-、四氫吡喃基thp-、特戊酰氧基亞甲基tbuco2ch2-、異丙氧基羰基氧亞甲基iproco2ch2-、亞甲基二氧基-och2o-等等。

x1可以不存在、或者是-och2-或-och(ch3)-。

x2選自o、ch2、c＝ch2、chch3或環(huán)丙烷基

x3可以不存在、或者是亞甲基ch2。

t1、t2相互獨(dú)立，可以是h或者ch2r3，而r3為h、oh或f；t1、t2也可以互相鍵合在一起構(gòu)成如下五元呋喃糖環(huán)：

其中，x1、x2、x3定義如前所述；r4、r5、r6、r7、r8、r9相互獨(dú)立，可以是氫、羥基、氟、氯、溴、氰基、疊氮、氨基或c1-4的烷基、c2-4的烯基、c2-4的炔基或者c1-4的烷氧基。

base是嘌呤或者嘧啶類堿基，或者其化學(xué)和代謝衍生物，其具有以下結(jié)構(gòu)通式：

其中，x4可以選自氫、鹵素(f、cl、br、i)、c1-8短鏈烷基如甲基、乙烯基、2-溴代乙烯基、(取代)乙炔基；

x5、x6和x7各自獨(dú)立，可以選自氫、鹵素(f、cl、br、i)、羥基、氨基、c1-4烷氧基、芐氧基、c3-6環(huán)烷基氧基、c1-4烷硫基、芐硫基、c3-6環(huán)烷基硫基、c1-4烷氨基或者c3-6環(huán)烷基氨基，這里所述烷基、環(huán)烷基、芐基可以被鹵素、羥基、氰基、胺基或者硝基取代。

z為氮、ch或者cx4，x4定義如前所述。

(i)式所描述的烴氧基芐基氨基磷酸/膦酸酯化合物結(jié)構(gòu)中，烴氧基可以是rcoo-或者r’o-，位于芐醇羥甲基的鄰位、間位或者對(duì)位，優(yōu)選鄰位取代，具有下式(ii)-(vii)的結(jié)構(gòu)：

其中，r1、r2、r2’、t1、t2、x1、x2、x3、base的定義如前所述；

r選自c0-21飽和或不飽和烷基、c3-7的飽和或不飽和環(huán)烷基、雜原子(o、s、n)取代的c1-12烷基、c3-7環(huán)烷基取代的c1-4烷基、c3-7雜環(huán)烷基取代c1-4烷基、芳基、雜環(huán)芳基、芳基烷基、雜環(huán)芳基烷基、c1-c12烷氧基、芳基烷氧基、雜環(huán)芳基烷氧基，這里所述烷基、雜原子取代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜環(huán)芳基可以被鹵素、羥基、氰基、氨基、胺基或者硝基取代。

r’選自c1-12飽和或不飽和烷基，雜原子(o、s、n)取代的c1-12烷基、c3-8環(huán)烷基、c3-8環(huán)烷基取代的c1-4烷基、c3-8雜環(huán)烷基取代c1-4烷基、芳基c1-4烷基、雜環(huán)芳基c1-4烷基、硅基r’r”r”’si-、甲氧基亞甲基mom-、亞甲二氧基-och2o-、特戊酰氧基亞甲基tbuco2ch2-、異丙氧基羰基氧亞甲基iproco2ch2-，這里所述烷基、雜原子取代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜環(huán)芳基可以被鹵素、羥基、氰基、氨基、胺基或者硝基取代。

上述結(jié)構(gòu)式(i)-(vii)中，

代表各種核苷類似物，包括常見的呋喃環(huán)核苷、碳環(huán)核苷以及非環(huán)核苷它可以選自以下核苷，但不僅限于以下核苷化合物：

并且，通式(i)-(vii)結(jié)構(gòu)中的磷原子手性中心，可以是差向異構(gòu)體富集的如(ib)、(ic)、(ie)、(if)；也可以是外消旋的如(ia)和(id)：

對(duì)于通式(i)-(vii)所描述的烴氧基芐基氨基磷酸/膦酸酯化合物，可以通過一些具體的實(shí)例來解釋，它們優(yōu)先選擇以下的化合物，但不僅僅局限于以下的化合物：

其中，r1為d-或l-氨基酸的側(cè)鏈；t2為氫、甲基或者亞甲基羥基(-ch2oh)。

上述化合物分為氨基磷酸酯和氨基膦酸酯兩大類，均可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員知曉的任何方法制備。

關(guān)于氨基磷酸酯(尤其是手性氨基磷酸酯)的合成方法，最為常見的是專利wo2010081082、wo2011123668和文獻(xiàn)j.org.chem.，2011，76(20)，8311-19中描述的方法：在四氫呋喃、二氧六環(huán)等適當(dāng)溶劑中，將核苷母體化合物(viii)與強(qiáng)堿(如叔丁基氯化鎂或n-甲基吡啶)混合后，慢慢加入手性或者消旋的氨基磷酸酯中間體磷試劑(ix)或者(x)的溶液，通過縮合反應(yīng)偶聯(lián)而得產(chǎn)物(i)。反應(yīng)分子式如下：

上述制備烴氧基芐基氨基磷酸酯(i)的縮合偶聯(lián)方法，關(guān)鍵之處乃是合成含有烴氧基芐基的氨基磷酸酯中間體磷試劑(ix)和(x)。具體地，本發(fā)明的烴氧基芐基氨基磷酸酯中間體磷試劑的結(jié)構(gòu)如下式(ixa)、(ixb)、(xa)或(xb)所示。

結(jié)構(gòu)式(ix)和(x)中l(wèi)g為離去集團(tuán)，常為苯環(huán)上帶有強(qiáng)吸電子基團(tuán)ewg的酚氧基，而吸電子基常見的有鹵素(f、cl、br)、砜基、磺基和硝基，可以是一個(gè)或者多達(dá)五個(gè)。優(yōu)選地，lg離去集團(tuán)為五氟苯酚氧基或者對(duì)硝基苯酚氧基；r1為氨基酸的側(cè)鏈；r2’可以是氫、羥基、鹵素(f、cl、br、i)、氰基、硝基、c1-6烷基、c1-6烷氧基、雜原子(o、s、n)取代c1-6烷基、雜原子取代c1-6烷氧基、c3-7環(huán)烷基、c3-7環(huán)烷基取代的c1-4烷基、c3-7雜環(huán)烷基取代c1-4烷基，這里所述烷基、雜原子取代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基可以被鹵素、羥基、氰基、胺基或者硝基取代；pg-可以是各種酚羥基的保護(hù)基，它與氧原子構(gòu)成烴氧基pg-o-，烴氧基可以位于芐醇羥甲基hoch2-的鄰位、間位或者對(duì)位，優(yōu)選鄰位取代的烴氧基。

另一方面，本發(fā)明提供了一種氨基磷酸酯中間體磷試劑(ix)和(x)的通用制備方法。反應(yīng)分子式如下：

含烴氧基芐基的氨基磷酸酯中間體(ix)和(x)可以由三氯氧磷依次分步與等當(dāng)量的烴氧基取代的芐醇、氨基酸酯和帶強(qiáng)吸電子基的苯酚反應(yīng)，在適當(dāng)堿性縛酸劑存在下、在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中制備而得。三氯氧磷與烴氧基取代的芐醇的反應(yīng)產(chǎn)物可不必分離而直接用于下一步反應(yīng)，即與氨基酸酯或其鹽酸鹽以及取代苯酚分步縮合、生成含烴氧基芐基的氨基磷酸酯中間體磷試劑(ix)和(x)。多步反應(yīng)可以一鍋處理，合成方法簡單，產(chǎn)率很高，可以工業(yè)化生產(chǎn)。烴氧基芐基氨基磷酸酯中間體(ix)和(x)的穩(wěn)定性高，可以柱層析純化處理，也可以用叔丁基甲基醚、乙醚、乙酸乙酯、石油醚或者它們的混合溶劑重結(jié)晶純化。

優(yōu)選地，堿性縛酸劑是三乙基胺。

優(yōu)選地，有機(jī)溶劑可以是苯、甲苯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、二異丙基醚、叔丁基甲基醚、四氫呋喃、二氧六環(huán)、乙酸乙酯、乙腈等中的一種或多種，推薦為二氯甲烷、乙醚、二異丙基醚。

優(yōu)選地，反應(yīng)溫度為-78℃到溶劑同流溫度，推薦為-78℃到室溫。

優(yōu)選地，反應(yīng)時(shí)間為3-72小時(shí)，推薦以tlc監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。

優(yōu)選地，重結(jié)晶溶劑為叔丁基甲基醚、二異丙基醚、乙醚、乙酸乙酯、石油醚或者它們適當(dāng)比例混合的溶劑。

另一類烴氧基芐基氨基膦酸酯的制備，可以采用專利cn201410168286.4公開的方法，以非環(huán)核苷單膦酸(xi)為原料，在適當(dāng)酰化縮合劑存在下、在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中，分步與氨基酸酯、烴氧基芐醇酰化反應(yīng)可以制得。反應(yīng)分子式如下：

在一定條件下，非環(huán)核苷單膦酸(xi)與氨基酸酯的反應(yīng)產(chǎn)物(xii)可不必分離而直接用于下一步反應(yīng)，即與氨基酸酯或其鹽酸鹽以及烴氧基芐醇分步?；?、生成含烴氧基芐基的氨基膦酸酯(ig)和(ih)。兩步反應(yīng)可以一鍋處理，合成方法簡單，產(chǎn)率很高，可以工業(yè)化生產(chǎn)。反應(yīng)粗產(chǎn)物(ig)和(ih)為磷手性中心未被拆分的差向異構(gòu)體混合物，少量產(chǎn)物可以柱層析純化處理，大量的可以用l-或者d-酒石酸進(jìn)行拆分來純化分離，也即用乙腈、丙酮、乙酸乙酯、水或者它們的混合溶劑來重結(jié)晶分離(ig)或者(ih)與酒石酸形成的鹽；也可以利用兩種差向異構(gòu)體的溶解度差異來動(dòng)力學(xué)拆分；或者利用超臨界色譜進(jìn)行分離純化。

優(yōu)選地，酰化縮合劑是n，n′-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二胺基鹽酸鹽(edc)、1-羥基苯并三唑(hobt)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n，n，n’，n’-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)、pybop等常見氨基酸縮合試劑。

優(yōu)選地，堿性縛酸劑是三乙基胺或者二異丙基乙基胺。

優(yōu)選地，有機(jī)溶劑可以是n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺甲苯、n-甲基吡咯烷酮、二甲亞砜、乙腈等中的一種或多種，推薦為n，n-二甲基甲酰胺、n-甲基吡咯烷酮。

優(yōu)選地，反應(yīng)溫度為0℃到溶劑回流溫度，推薦為室溫到20-60℃。

優(yōu)選地，反應(yīng)時(shí)間為3-72小時(shí)，推薦以tlc監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。

又一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含前述的化合物或其異構(gòu)體或可藥用鹽。

再一方面，本發(fā)明的前述核苷類似物的、含有烴氧基芐基的氨基磷酸酯前藥或其異構(gòu)體或可藥用鹽，可以用于升級(jí)各種核苷類抗病毒藥物或抗癌藥物。即本發(fā)明提供前述的化合物或其異構(gòu)體或可藥用鹽在制備預(yù)防和/或治療由病毒，例如hiv、hbv和hcv等病毒感染引起的疾病的藥物；或者在制備預(yù)防和/或治療癌癥的藥物中的用途。

附圖說明

附圖圖1為核苷、核苷酸與核酸的聚合過程；

附圖圖2為常見核苷前藥；

附圖圖3為mcguigan型芳基胺基磷酸酯(3-1)及其代謝作用機(jī)理。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中，所有水敏感反應(yīng)均在干燥條件下進(jìn)行。苯、四氫呋喃在金屬鈉存在下回流、干燥、蒸餾后保存待用，二氯甲烷用五氧化二磷干燥處理后使用。核苷類似物由市場上購買或者參照文獻(xiàn)方法合成(j.org.chem.2011，76，8311；org.proc.res.dev.，2010，14，1194；j.org.chem.，2003，68，6799；wo2010075549a2)，核苷類似物使用前最好在真空下50℃左右干燥。核苷化合物的含烴氧基芐基的氨基磷酸酯衍生物可以利用硅膠柱層析方法分離，得到的是烴氧基芐基氨基磷酸酯(i)的差向異構(gòu)體混合物，可以進(jìn)一步通過手性拆分或重結(jié)晶或手性柱柱層析等方式分離。

通過下述實(shí)施例有助于理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。

實(shí)施例1

將化合物1(12.8g，50mmol)溶于二氯甲烷(100ml)中并冷卻至-78℃下，20分鐘內(nèi)緩慢滴加2-乙酰氧基芐醇(8.3g，50mmol)和三乙胺(7.7ml，55mmol)的二氯甲烷(100ml)溶液。反應(yīng)液在-78℃下攪拌30分鐘，然后升溫到0℃，慢慢加入干燥d-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(7.68g，50mmol)的二氯甲烷(100ml)溶液，隨后向上述反應(yīng)液中緩慢滴加三乙胺(14.7ml，105mmol)，90分鐘滴加完畢，并使反應(yīng)液零度下繼續(xù)攪拌3小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，加入乙酸乙酯研粉，過濾，濾液濃縮，殘余物用硅膠柱層析分離純化(石油醚∶乙酸乙酯＝7∶3)得到無色油狀產(chǎn)物3(17.7g，84％)、久置能緩慢固化。1hnmr(cdcl3，400mhz)δ8.22(dd，j1＝9.0hz，j2＝1.8hz，2h)，7.23-7.42(m，4h)，7.10(dd，j1＝9.0hz，j2＝1.8hz，2h)，5.10-5.17(m，2h)，4.99-5.05(m，1h)，3.95-4.01(m，1h)，3.65-3.73(m，1h)，2.38(s，3h)，1.35-1.45(m，3h)，1.10-1.30(m，6h)；31pnmr(cdcl3)δ1.92，1.99；ms(m/z)481(m+h)。

實(shí)施例2

將芐醇4(152mg，1mmol)和pocl3(95μl，1mmol)的無水乙醚(5ml)溶液冷卻到-78℃，緩慢滴加三乙胺(140μl，1mmol)，滴加完畢繼續(xù)攪拌2小時(shí)。再于-78℃下向反應(yīng)液中滴加l-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(168mg，1mmol)、三乙胺(280μl，2mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液，反應(yīng)60分鐘后使反應(yīng)液在1.5小時(shí)內(nèi)慢慢升溫到0℃。

向反應(yīng)瓶中加入五氟苯酚(184mg，1mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液，隨后在1小時(shí)內(nèi)慢慢滴加三乙胺(140μl，1mmol)，反應(yīng)液緩慢升至室溫?cái)嚢柽^夜。過濾除去三乙胺鹽酸鹽，濾餅用少量二氯甲烷洗滌，合并的有機(jī)相用水洗后干燥(na2so4)，濃縮后殘余物柱層析可以得到兩個(gè)差向異構(gòu)體5a和5b的等比混合物5，兩個(gè)差向異構(gòu)體5a和5b可以利用乙酸乙酯-石油醚混合溶劑重結(jié)晶而分離。

5：1hnmr(cdcl3)δ6.98-6.67(m，3h)，5.99(s，2h)，5.63-5.79(m，2h)，4.72-4.84(m，1h)，4.34(m，1h)，3.84-3.91(m，1h)，1.40-1.48(m，3h)，1.20-1.36(m，6h)；31pnmr(cdcl3)δ9.93，9.82；ms(m/z)512(m+h)。

5a：1hnmr(cdcl3，400mhz)δ6.67-6.98(m，3h)，5.99(s，2h)，5.67(s，2h)，4.74-4.84(m，2h)，4.32-4.38(m，1h)，3.84-3.90(m，1h)，1.46(d，3h)，1.21-1.37(m，6h)；31pnmr(cdcl3)δ9.93；ms(m/z)512(m+h)。

實(shí)施例3

采用與實(shí)施例2同樣的合成方法，由芐醇6制得化合物7、7a和7b?；旌袭a(chǎn)物7：1hnmr(cdcl3，400mhz)δ7.01-7.31(m，3h)，5.03-5.09(m，1h)，4.72(s，1h)，4.64(s，1h)，4.02-4.08(m，1h)，3.84-3.91(m，1h)，2.33(s，1.5h)，2.30(s，1.5h)，1.36-1.46(m，3h)，1.22-1.34(m，6h)；ms(m/z)516(m+h)。

7a：1hnmr(cdcl3，400mhz)δ7.01-7.28(m，3h)，5.03-5.09(m，1h)，4.64(s，2h)，4.02-4.08(m，1h)，3.84-3.90(m，1h)，2.30(s，3h)，1.41-1.46(m，3h)，1.24-1.28(m，6h)；ms(m/z)516(m+h)。

7b：1hnmr(cdcl3，400mhz)δ7.10-7.32(m，3h)，5.06-5.12(m，1h)，4.71(s，2h)，4.07-4.11(m，1h)，3.77-3.81(m，1h)，2.33(s，3h)，1.45-1.49(m，3h)，1.24-1.30(m，6h)；ms(m/z)516(m+h)。

實(shí)施例4

將化合物1(1.28g，5mmol)溶于二氯甲烷(10ml)中并冷卻至-78℃下，20分鐘內(nèi)緩慢滴加芐醇(0.76g，5mmol)和三乙胺(0.8ml，5.5mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液。反應(yīng)液在-78℃下攪拌30分鐘，然后升溫到0℃，慢慢加入干燥l-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(0.77g，5mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液，隨后向上述反應(yīng)液中緩慢滴加三乙胺(1.5ml，10.5mmol)，90分鐘滴加完畢，并使反應(yīng)液零度下繼續(xù)攪拌3小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，加入乙酸乙酯研粉，過濾，濾液濃縮，殘余物用硅膠柱層析分離純化(石油醚∶乙酸乙酯＝7∶3)得到無色膏狀產(chǎn)物8(77％)。1hnmr(cdcl3，400mhz)δ8.24(d，2h)，7.46(d，2h)，6.66-6.88(m，3h)，5.97(s，2h)，5.29-5.33(m，2h)，5.01-5.07(m，1h)，4.00-4.06(m，1h)，3.78-3.83(m，1h)，3.10-3.13(m，1h)，1.47-1.40(m，3h)，1.20-1.33(m，6h)；ms(m/z)467(m+h)。

實(shí)施例5

采用與化合物8同樣的合成方法，制得化合物9。1hnmr(cdcl3，400mhz)δ8.21-8.26(m，2h)，7.28-7.42(m，3h)，7.09-7.12(m，2h)，5.32(s，1h)，5.13-5.17(m，1h)，4.99-5.04(m，1h)，3.95-4.01(m，1h)，3.83(s，3h)，3.67-3.75(m，1h)，1.35-1.45(m，3h)，1.10-1.30(m，6h)；31pnmr(cdcl3)δ1.95，1.99；ms(m/z)480(m+h)。

實(shí)施例6

在-78℃下向三氯氧磷(1.39g，9.1mmol)的無水二氯甲烷(15ml)溶液中滴加2-甲氧基芐醇(1.26g，9.1mmol)和三乙胺(1.26ml，9.1mmol)的無水ch2cl2(2ml)溶液。在相同溫度下攪拌3小時(shí)后，向反應(yīng)混合物一次性加入d-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(1.52g，9.1mmol)，然后15分鐘內(nèi)滴加三乙胺(2.64ml，18.5mmol)的無水ch2cl2(2ml)溶液。在-78℃下再攪拌1小時(shí)，然后在1小時(shí)內(nèi)升溫至室溫。向反應(yīng)液中滴加五氟苯酚(1.0g，9.1mmol)和三乙胺(1.5ml，10.9mol)在無水二氯甲烷(2ml)中的混合溶液，并在室溫下攪拌過夜。過濾收集固體，濃縮濾液。將所得殘余物和收集的固體合并，并在etoac(20ml)和h2o(10ml)之間分配。分離有機(jī)層，水層用etoac(2×10ml)萃取。將合并的有機(jī)層用鹽水(10ml)洗滌，用無水na2so4干燥，然后濃縮。給出的殘余物用二異丙基醚和石油醚(1∶2，40ml)的混合物處理并加熱至回流。將整個(gè)固體溶解后，將其冷卻并在室溫下保持3天后析出白色固體純品10a(0.97g)。1hnmr(400mhz，chloroform-d)δ7.81-7.00(m，3h)，7.00-6.77(m，1h)，5.37-5.21(m，2h)，5.07(m，1h)，4.16-4.00(m，1h)，3.88(s，3h)，1.47(d，j＝4.0hz，3h)，1.40-1.21(m，6h)；31pnmr(400mhz，chloroform-d)δ3.5；ms(m/z)498(m+h)。

實(shí)施例7

在-78℃下向三氯氧磷(1.39g，9.1mmol)的無水二氯甲烷(15ml)溶液中滴加5-氯-2-甲氧基芐醇(1.74g，9.1mmol)和三乙胺(1.26ml，9.1mmol)的無水ch2cl2(2ml)溶液。在相同溫度下攪拌3小時(shí)后，向反應(yīng)混合物一次性加入d-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(1.52g，9.1mmol)，然后15分鐘內(nèi)滴加三乙胺(2.64ml，18.5mmol)的無水ch2cl2(2ml)溶液。在-78℃下再攪拌1小時(shí)，然后在1小時(shí)內(nèi)升溫至室溫。向反應(yīng)液中滴加五氟苯酚(1.0g，9.1mmol)和三乙胺(1.5ml，10.9mol)在無水二氯甲烷(2ml)中的混合溶液，并在室溫下攪拌過夜。過濾收集固體，濃縮濾液，將所得殘余物和收集的固體合并，并在etoac(20ml)和h2o(10ml)之間分配。分離有機(jī)層，水層用etoac(2×10ml)萃取。將合并的有機(jī)層用鹽水(10ml)洗滌，用無水na2so4干燥，然后濃縮。給出的殘余物用二異丙基醚和石油醚(1∶2，40ml)的混合物處理并加熱至回流。將整個(gè)固體溶解后，將其冷卻并在室溫下保持3天后析出白色固體純品11a(1.17g)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.42-7.34(m，1h)，7.03-6.94(m，1h)，6.95-6.88(m，1h)，5.37-5.21(m，2h)，5.07(m，1h)，4.16-4.00(m，1h)，3.88(s，3h)，1.47(d，3h)，1.40-1.21(m，6h)；31pnmr(400mhz，cdcl3)δ3.7；ms(m/z)532(m+h)。

實(shí)施例8

化合物12(260mg，1mmol)溶于20ml無水四氫呋喃中，0℃下加入叔丁基氯化鎂格氏試劑(1.0m，2ml，2mmol)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30分鐘。緩慢滴加入化合物10a(1.0g，2mmol)的四氫呋喃溶液(4ml)，反應(yīng)混合物室溫下攪拌過夜，加入飽和氯化銨溶液(20ml)淬滅反應(yīng)，乙酸乙酯萃取(20mlx3)，有機(jī)相合并，干燥，濃縮，殘余物以硅膠柱層析純化(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)進(jìn)而得到白色泡沫狀產(chǎn)物13。1hnmr(cd3od，400mhz)δ7.54-7.57(m，1h)，7.22-7.44(m，4h)，6.00(s，1h)，5.75-5.60(m，1h)，4.97-5.13(m，3h)，4.04-4.42(m，4h)，3.88(s，3h)，3.71-3.85(m，2h)，1.71-1.77(m，2h)，1.11-1.38(m，12h)；31pnmr(cd3od)δ7.89；ms(m/z)572(m+h)。

實(shí)施例9

采用實(shí)施例8的合成方法，將化合物14與磷試劑9在叔丁基氯化鎂的催化下sn2取代反應(yīng)，可以得到產(chǎn)物15。1hnmr(cd3od，400mhz)δ7.59(d，j＝7.5hz，1h)，6.88-7.33(m，3h)，6.25(t，j＝7.5hz，1h)，5.85(d，j＝7.5hz，1h)，4.95-5.01(m，2h)，4.32-4.45(m，2h)，4.20-4.25(m，1h)，4.00-4.08(m，1h)，2.32(s，3h)，1.16-1.37(m，9h)；31pnmr(cd3od，400mhz)δ3.67，4.89；ms(m/z)604(m+h)。

實(shí)施例10

采用實(shí)施例8的合成方法，將化合物16與磷試劑8在叔丁基氯化鎂的催化下sn2取代反應(yīng)，可以得到產(chǎn)物17。1hnmr(cd3od，400mhz)δ7.86(d，j＝6.4hz，1h)7.16-7.39(m，4h)，6.22-6.30(m，1h)，5.77(s，2h)，4.96-4.99(m，1h)，3.90-4.50(m，5h)，2.57(t，j＝7.6hz，2h)，1.74-1.79(m，2h)，2.00-2.35(m，2h)，1.20-1.53(m，29h)，0.90(t，j＝6.4hz，3h)；31pnmr(cd3od，400mhz)δ3.91，4.22；ms(m/z)574(m+h)。

實(shí)施例11

采用實(shí)施例8的合成方法，將化合物18與磷試劑3在叔丁基氯化鎂的催化下sn2取代反應(yīng)，可以得到產(chǎn)物19。1hnmr(cd3od，400mhz)δ7.94(d，j＝8.4hz，1h)，7.22-7.45(m，4h)，5.13-5.19(m，1h)，4.67(s，2h)，4.52-4.57(m，2h)，3.77-3.82(m，1h)，3.45-3.48(m，1h)，3.13-3.17(m，2h)，2.57-2.60(m，1h)，2.35(s，3h)，1.12-1.4(m，9h)；31pnmr(cd3od，400mhz)δ5.5，3.9；ms(m/z)589(m+h)。

實(shí)施例12

采用實(shí)施例8的合成方法，將化合物20與手性磷試劑5a在叔丁基氯化鎂的催化下sn2取代反應(yīng)，可以得到產(chǎn)物21，為sp單一差向異構(gòu)體富集的化合物。1hnmr(cd3od)δ7.49(d，j＝8.2hz，1h)，6.67-6.98(m，3h)，6.20(d，j＝18.4hz，1h)，5.99(s，2h)，5.73(d，j＝8.2hz，1h)，5.47(m，2h)，5.01-5.06(m，1h)，3.50-4.40(m，5h)，1.19-1.39(m，12h)；31pnmr(cd3od，400mhz)δ5.2；ms(m/z)588(m+h)。

實(shí)施例13

在80mldmf的溶劑中，加入(r)-9-[2-(膦酰甲氧基)丙基]-腺嘌呤22(3.5g，8.9mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc，1.9g，10mmol)、三乙胺(3.8ml，27mmol)、4-(n，n-二甲氨基)吡啶(320mg，2.6mmol)和芐醇23(2.23g，14.7mmol)，室溫?cái)嚢?0分鐘后，于100度加熱反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)完畢，減壓濃縮除去溶劑，殘余物溶于水中，經(jīng)反相c-18柱層析(甲醇∶水＝1∶9)純化，得到黃色膏狀產(chǎn)物24；ms(m/z)422(m+h)。

實(shí)施例14

將化合物24(47mg，0.11mmol)懸浮于乙腈(1ml)中，50℃攪拌下加入二氯亞砜(33μl，0.25mmol)，然后在75-80℃反應(yīng)兩小時(shí)。隨后氮?dú)獗Ｗo(hù)下蒸除溶劑，殘余物溶于干燥的二氯甲烷(2ml)中并冷卻至-30℃。一小時(shí)內(nèi)慢慢加l-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(30mg，0.2mmol)和三乙胺(30μl，0.22mmol)的二氯甲烷溶液(0.5ml)，反應(yīng)液慢慢升至室溫過夜。待反應(yīng)結(jié)束，加入10％磷酸二氫鈉溶液淬滅反應(yīng)，加入二氯甲烷(10ml)稀釋、萃取，有機(jī)相用飽和食鹽溶液洗滌、干燥(硫酸鈉)、過濾然后濃縮，殘余物以柱層析純化，得到白色固體產(chǎn)物25(30mg，52％)。1hnmr(cdcl3)δ8.32(s，1h)，7.92(s，1h)，6.68-6.96(m，3h)，6.02(s，2h)，5.80(m，2h)，4.94-5.07(m，3h)，4.29-4.42(m，1h)，3.08-4.14(m，4h)，1.16-1.30(m，12h)；31pnmr(cdcl3)δ23.92，24.89；ms(m/z)535(m+h)。

實(shí)施例15

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將化合物22(287mg，1mmol)溶于10ml乙腈中，隨后加入tmsbr(0.66ml，5mmol)并使反應(yīng)液在室溫下攪拌過夜。減壓蒸除溶劑，殘余物溶于無水三乙胺(2ml)和吡啶(8ml)混合溶劑中，隨后加入d-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(250mg，1.5mmol)和對(duì)-乙酰氧基芐醇(250mg，1.5mmol)攪拌溶解。在另外一個(gè)反應(yīng)瓶中將化合物26(1.1g，5mmol)和三苯基膦(1.31g，5mmol)于無水吡啶(50ml)中混合，生成的亮黃色溶液立即用雙頭針轉(zhuǎn)移到化合物22的反應(yīng)瓶中，反應(yīng)液于50-60℃加熱5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后減壓濃縮，殘余物在乙酸乙酯和碳酸氫鈉水溶液間分配，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥、過濾、濃縮，殘余物用手性制備色譜(diacel’schiralpakas)分離，用含25％甲醇的乙腈流動(dòng)相層析，得到產(chǎn)物(27a)和(27b)。

27a：1hnmr(cdcl3)δ8.32(s，1h)，7.92(s，1h)，7.35(d，j＝8.5hz，2h)，7.08(d，j＝8.5hz，2h)，5.99(s，2h)，4，87-5.06(m，3h)，4.55-4.68(m，1h)，3.78-4.07(m，4h)，3.52-3.63(m，1h)，3.32-3.37(m，1h)，2.31(s，3h)，1，14-1.35(m，12h)；31pnmr(cdcl3)δ23.96；ms(m/z)549(m+h)。

27b：1hnmr(cdcl3)δ8.34(s，1h)，7.92(s，1h)，7.31(d，j＝8.5hz，2h)，7.05(d，j＝8.5hz，2h)，5.99(s，2h)，4，87-5.06(m，3h)，4.61-4.71(m，1h)，3.78-4.07(m，5h)，3.52-3.63(m，1h)，2.30(s，3h)，1，14-1.35(m，12h))hhhh；31pnmr(cdcl3)δ24.93；ms(m/z)549(m+h)。

實(shí)施例16

采用實(shí)施例15的合成方法，將化合物22與d-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽和5-氯-2-甲氧基芐醇縮合，得到淺黃色泡沫狀固體產(chǎn)物28(48％)。1hnmr(400mhz，methanol-d4)δ8.19(s，，1h)，8.18(s，1h)，7.27(dt，j＝5.0，2.6hz，2h)，6.95(d，j＝9.4hz，1h)，5.51(s，1h)，5.07-4.93(m，2h)，4.37(d，j＝3.1hz，1h)，4.25(dd，j＝14.6，7.2hz，2h)，4.07-3.89(m，2h)，3.38(s，3h)，1.45-1.31(m，3h)，1.24(dt，j＝6.2，4.0hz，9h)；31pnmr(meoh-d4)δ26.92，26.39；ms(m/z)555(m+h)。

實(shí)施例17

采用實(shí)施例15的合成方法，將化合物22與l-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽和5-氯-2-甲氧基芐醇縮合，得到無色泡沫狀固體產(chǎn)物29(58％)。1hnmr(400mhz，chloroform-d)δ8.23(s，1h)，7.91(s，0.5h)，7.90(s，0.5h)，7.26(dd，1h)，7.18-7.09(m，1h)，6.70(dd，1h)，6.62(s，2h)，5.07-4.79(m，3h)，4.43-4.14(m，2h)，4.09(m，1h)，4.01-3.78(m，2h)，3.73(d，j＝4.7hz，3h)，3.71-3.57(m，2h)，1.34-1.00(m，12h).；31pnmr(meoh-d4)δ25.04，24.20；ms(m/z)555(m+h)。

實(shí)施例18

采用實(shí)施例15的合成方法，將化合物22與l-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽和2-甲氧基芐醇縮合，得到淡黃色泡沫狀固體產(chǎn)物30(58％)。1hnmr(400mhz，chloroform-d)δ8.34(s，1h)，7.98(s，0.5h)，7.93(s，0.5h)，7.38-7.24(m，3h)，7.05-6.80(m，2h)，5.78(s，2h)，5.17-4.88(m，3h)，4.35(m，1h)，4.22-3.75(m，6h)，3.62(m，1h)，1.36(d，j＝7.0hz，3h)，1.32-1.11(m，9h)；31pnmr(cdcl3)δ24.56，23.78；ms(m/z)521(m+h)。

實(shí)施例19

采用實(shí)施例15的合成方法，將化合物22與d-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽和2-甲氧基芐醇縮合，可以得到淡黃色泡沫狀固體產(chǎn)物31，采用硅膠柱層析、dcm-meoh(25∶1)為流動(dòng)相緩慢洗脫，可以純化得到兩個(gè)差向異構(gòu)體31a與31b，其磷手性中心的構(gòu)型未確定，31a為先洗脫下來的產(chǎn)物。

31a：1hnmr(400mhz，methanol-d4)δ8.20(s，1h)，8.16(s，1h)，7.28-7.12(m，4h)，5.03-4.96(m，1h)，4.36(dd，1h)，4.23(dd，1h)，4.11(q，1h)，4.03-3.68(m，4h)，2.29(s，3h)，1.34(dd，3h)，1.29-1.16(m，9h)；31pnmr(cdcl3)δ26.56；ms(m/z)521(m+h)。

31b：1hnmr(400mhz，methanol-d4)δ8.21(s，1h)，8.15(s，1h)，7.35-7.10(m，4h)，5.17-4.95(m，3h)，4.37(dd，1h)，4.22(dd，1h)，4.11(q，1h)，4.00-3.84(m，2h)，3.70(dd，1h)，2.33(s，3h)，1.47-1.11(m，12h)；31pnmr(cdcl3)δ26.04；ms(m/z)521(m+h)。

實(shí)施例20

采用實(shí)施例15的合成方法，將化合物22與l-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽和4-甲氧基芐醇縮合，柱層析方法純化得到無色泡沫狀固體產(chǎn)物32a和32b的混合物32。產(chǎn)物32a和32b兩種差向異構(gòu)體可以使用d-酒石酸拆分的方法分離，其具體方法如下：

將柱層析得到的32a和32b兩種異構(gòu)體的混合物10g溶于100ml乙腈中，加入3.78gd-酒石酸，加熱反應(yīng)液至60-65℃保持3小時(shí)，冷卻后過濾收集得到的白色沉淀，為產(chǎn)物32與d-酒石酸的混合物鹽。

將1.2g上述32的酒石酸鹽懸浮于10ml水-乙腈(10∶1)溶劑中，加熱到60-65℃保持1小時(shí)，得到的沉淀為pr構(gòu)型的32a的酒石酸鹽。

取0.6g化合物32a的酒石酸鹽懸浮于2ml二氯甲烷和1ml水之間，加入氨水調(diào)節(jié)ph8-9之間，萃取分層，有機(jī)相濃縮，加水1ml并在55-60℃之間攪拌一小時(shí)，冷卻后過濾即使游離的化合物32a。

使用l-酒石酸對(duì)混合物32拆分則得到純的ps構(gòu)型的32b。

32a：1hnmr(cdcl3)δ8.35(s，1h)，7.96(s，1h)，7.29(d，j＝8.6hz，2h)，6.90(d，j＝8.6hz，2h)，5.75(s，2h)，4.86-5.06(m，3h)，4.37-4.41(m，1h)，3.14-4.15(m，6h)，3.82(s，3h)，1.14-1.34(m，12h)；31pnmr(cdcl3)δ23.74；ms(m/z)521(m+h)。

32b：1hnmr(cdcl3)δ8.36(s，1h)，7.94(s，1h)，7.28(d，j＝8.6hz，2h)，6.87(d，j＝8.6hz，2h)，5.76(s，2h)，4.86-5.06(m，3h)，4.30-4.34(m，1h)，3.14-4.15(m，6h)，3.81(s，3h)，1.14-1.34(m，12h)；31pnmr(cdcl3)δ24.57；ms(m/z)521(m+h)。

實(shí)施例21

采用實(shí)施例15的合成方法，將化合物22與d-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽和芐醇33縮合，得到無色泡沫狀固體產(chǎn)物34(48％)。1hnmr(cdcl3)δ8.36(s，0.5h)，8.35(s，0.5h)，7.95(s，0.5h)，7.94(s，0.5h)，7.16-7.40(m，4h)，5.89(s，2h)，4.90-5.05(m，4)，3.45-4.40(m，8h)，1.42(s，9h)，1.12-1.26(m，15h)；ms(m/z)678(m+h)。

實(shí)施例22

化合物34(70mg，0.1mmol)于0℃下溶于4毫升二氯甲烷中，慢慢加入1毫升三氟乙酸，攪拌反應(yīng)2小時(shí)，蒸除溶劑后得到的殘余物在飽和nahco3水溶液和氯仿/異丙醇(4∶1)之間分配萃取，有機(jī)相用食鹽水洗滌后干燥，濃縮，殘余物用二異丙基醚洗滌后得到白色的產(chǎn)物35。1hnmr(meoh-d4)8.37(s，0.5h)，8.36(s，0.5h)，7.95(s，0.5h)，7.93(s，0.5h)，7.16-7.44(m，4h)，4.90-5.05(m，4)，3.45-4.40(m，6h)，1.12-1.26(m，15h)；ms(m/z)578(m+h)。

實(shí)施例23

采用實(shí)施例15的合成方法，將化合物22與l-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽和芐醇36縮合，得到淡黃色泡沫狀固體產(chǎn)物37(48％)。1hnmr(cdcl3)δ8.22(s，1h)，7.95(s，1h)，6.88-6.92(m，3h)，6.08(s，2h)，4.94-5.00(m，2h)，4.20-4.25(m，1h)，4.05-4.11(m，1h)，3.78-4.01(m，3h)，3.74(s，1.5h)，3.72(s，1.5h)，3.57-3.65(m，2h)，1.28-1.31(m，3h)，1.10-1.20(m，9h)；ms(m/z)535(m+h)。

實(shí)施例24

采用實(shí)施例15的合成方法，將化合物22與l-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽和芐醇38縮合，得到淡黃色泡沫狀固體產(chǎn)物39(45％)。1hnmr(cdcl3)δ8.22(s，1h)，7.95(s，0.5h)，7.94(s，0.5h)，7.15-7.90(m，3h)，6.02(s，2h)，4.94-5.00(m，2h)，4.20-4.25(m，1h)，4.05-4.11(m，1h)，3.78-4.01(m，3h)，3.74(s，1.5h)，3.72(s，1.5h)，3.57-3.65(m，2h)，1.28-1.31(m，3h)，1.10-1.20(m，9h)；ms(m/z)548(m+h)。

實(shí)施例25

將化合物31(50mg，0.1mmol)溶于1ml乙腈中，加入富馬酸(10mg，0.9eq)，加熱回流30分鐘得到澄清溶液，降溫至45-50℃之間后趁熱過濾，濾液冷卻至室溫后析出白色固體，濾除溶劑，濾餅以冷乙腈洗滌，得到白色固體產(chǎn)物40。

實(shí)施例26

將化合物31a(50mg，0.1mmol)溶于無水乙腈(2ml)中，加入富馬酸(10mg，0.09mmol)后加熱回流1小時(shí)，冷卻至室溫慢慢析出固體，過濾，用0-5℃冷乙腈洗滌濾餅，得到白色粉末固體40a。

實(shí)施例27

將化合物31b(50mg，0.1mmol)溶于無水乙腈(2ml)中，加入富馬酸(10mg，0.09mmol)后加熱回流4小時(shí)，冷卻至室溫慢慢析出固體，過濾，用0-5℃冷乙腈洗滌濾餅，得到白色粉末固體40b。

實(shí)施例28(hcv活性)

化合物的抗hcv活性的測試方法參考文獻(xiàn)報(bào)道(wo2007/027248)在人肝細(xì)胞huh-7中進(jìn)行，待測化合物的活性通過帶有螢光素酶基因的hcv基因型1b復(fù)制子的復(fù)制情況來評(píng)估。螢光素酶的信號(hào)強(qiáng)度直接對(duì)應(yīng)于病毒rna的復(fù)制量。核苷磷酸酯前藥配置成從0.1到30μm等不同濃度的dmso溶液，索菲布韋41為參照，然后施加到96-孔板上，隨后加入復(fù)制子細(xì)胞(每孔6000個(gè)細(xì)胞)。細(xì)胞在核苷前藥的存在下孵化48小時(shí)，然后測量螢光素酶強(qiáng)度。螢光素酶信號(hào)的減弱標(biāo)志著細(xì)胞中hcv復(fù)制子rna的減弱，它可以進(jìn)而用以計(jì)算抗病毒活性指標(biāo)ec50。

經(jīng)測試，化合物13和21表現(xiàn)出較好的抗丙肝病毒活性，具體結(jié)果見下表，在100μm下對(duì)pbm、cem等細(xì)胞均無任何毒性。

對(duì)比化合物13和42的hcv體外活性，可知芐基苯環(huán)上鄰位甲氧基取代明顯比甲基取代使得氨基磷酸酯前藥活性提升更大；而對(duì)比化合物21和41，可見烴氧基芐基與酚基相比具有更強(qiáng)的釋放出核苷單磷酸的能力，表現(xiàn)為化合物21相對(duì)于丙肝藥物索菲布韋具有更佳的體外活性。

實(shí)施例29(hiv活性)

化合物的抗hiv-1活性的測試方法參考文獻(xiàn)報(bào)道(antimicrob.agentschemother.，1992，36，2423)在pbm淋巴細(xì)胞中進(jìn)行。核苷磷酸酯前藥配置成(20-40mm)的dmso溶液，然后稀釋成一系列不同的濃度后與hiv-1lai病毒感染了的pbm細(xì)胞共同培養(yǎng)。hiv-1lai病毒與pbm細(xì)胞數(shù)量比moi＝0.01，dmso溶劑本身對(duì)病毒繁殖沒有影響，azt為參照，抗病毒活性指標(biāo)ec50根據(jù)抑制率-濃度曲線計(jì)算而得(adv.enzymeregul.，1984，22，27)。

經(jīng)測試證實(shí)，化合物25、28、29、30、31a、31b、32a、32b、35及37均表現(xiàn)出非常好的抗艾滋病毒活性，結(jié)果見下表1。

實(shí)施例30大鼠灌胃替諾福韋衍生物后藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

取大鼠三組共12只，按10mg/kg劑量灌胃給予替諾福韋二吡呋酯43、化合物31和44(每組四只大鼠，雌雄各二)，分別于給藥前0.5h和給藥后0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，4.0，6.0，8.0，12，24h取血約150μl至肝素化試管中，于8000rpm離心5min，分離出血漿。取40.0μl大鼠血漿樣品，加入20.0μl內(nèi)標(biāo)工作液(含labetalol500ng/ml)甲醇∶水(1∶1，v∶v)溶液，加入320μl0.1％甲酸乙腈沉淀蛋白，渦旋混合5分鐘，樣品于4℃的離心機(jī)中以17000xg離心10分鐘。取上清液10μl用lc-ms測定替諾福韋22的濃度。利用das2.0藥代動(dòng)力學(xué)專業(yè)軟件，以統(tǒng)計(jì)矩方法進(jìn)行運(yùn)算，求得每只動(dòng)物相應(yīng)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(表2)。

表2大鼠灌胃三種替諾福韋衍生物后大鼠體內(nèi)替諾福韋22的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

由表2可以看出，三個(gè)替諾福韋前藥衍生物灌胃給藥后的達(dá)峰時(shí)間相當(dāng)，主要差別在auc0-24h。2-甲氧基芐基氨基膦酸酯前藥31組的auc較43與44組有較大幅度提升，達(dá)到后者auc的2.5倍以上，而相應(yīng)的前藥44與替諾福韋二吡呋酯43的藥代參數(shù)接近，體現(xiàn)出烴氧基芐醇參與構(gòu)成的氨基膦酸酯前藥在生物體內(nèi)代謝、傳送替諾福韋過程中的優(yōu)越性。