聯(lián)邦贊助的研究和開發(fā)

本發(fā)明在政府支持下進行，合同號為r01eb011872，該合同通過美國生物醫(yī)學成像和生物工程研究所(nationalinstituteofbiomedicalimagingandbioengineering)由美國衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth)給予。政府對本發(fā)明具有一定的權利。

本發(fā)明涉及手術期間的熒光引導的神經(jīng)成像，特別是涉及髓磷脂堿性蛋白(mbp)神經(jīng)成像造影劑的術中局部施用領域。還提供了用于該造影劑的局部給藥以允許術中神經(jīng)識別的藥物制劑。

背景技術：

意外的神經(jīng)損傷是與許多救命手術過程相關的發(fā)病率的主要原因。由這些損傷引起的并發(fā)癥取決于神經(jīng)損傷的嚴重性和位置，并且常常導致對患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生負面影響的癥狀，例如功能和/或感覺喪失、肌肉萎縮、麻痹和慢性神經(jīng)病變。需要在腹部和骨盆中進行根治性切除的癌癥手術是特別重要的，因為許多小神經(jīng)涉及感覺、運動和自主功能。在結腸直腸和婦科手術中，控制膀胱和腸的自主神經(jīng)的保存在實現(xiàn)癌癥控制之后是最重要的。在泌尿外科領域，根治性前列腺切除術后的結果研究表明，由于神經(jīng)損傷，手術后甚至5年泌尿和性功能障礙也是常見的。神經(jīng)血管束中的這些神經(jīng)在手術期間通常難以可見，即使在放大下，原因是它們的復雜性、大小以及個體之間的解剖學變化。神經(jīng)損傷的原因是多樣的，但通常由于區(qū)分神經(jīng)纖維與周圍組織的能力有限；它們可能被誤認為血管，或者它們可能與目標惡性腫瘤一起切除，原因是它們的接近性。當前的神經(jīng)保留(nerve-sparing)技術主要依賴于解剖學上標志性識別，這高度取決于外科醫(yī)生的經(jīng)驗。

在使用全身注射的造影劑的臨床前研究中(引用我們的專利和出版物)，已經(jīng)使用熒光圖像引導手術成功地證明了術中神經(jīng)識別。在動物中靜脈內(nèi)(iv)注射之后，需要足夠的時間讓造影劑分布到全身中、靶向特定蛋白質(zhì)并從非靶區(qū)域清除。由于首次使用熒光引導手術，幾乎沒有在人類中測試靶向光學試劑。由于對在人體中測試全身施用的造影劑的法規(guī)監(jiān)督，存在對臨床轉化的障礙。局部施用具有降低臨床開發(fā)程序的成本的潛力，使得向人類研究的過渡更可行。

與造影劑的全身遞送相比，局部施用具有許多潛在的優(yōu)點。它可能潛在地限制全身吸收的可能性和毒性，從而增強造影劑的安全性質(zhì)。它可以在最需要術中可見的手術部位處產(chǎn)生高且持續(xù)劑量的造影劑，同時限制其他地方的濃度。它還將允許外科醫(yī)生控制局部施用的時間選擇，使得它們可以在需要時將其施用在手術部位。

因此，仍然需要能夠標記神經(jīng)的局部試劑。

技術實現(xiàn)要素：

本文提供了能夠結合髓磷脂堿性蛋白的局部試劑。

在一個實施方案中，提供了包含式i化合物或其鹽的藥物試劑，其中式i為：

r¹是烷基，r²是給電子基團，且r³是吸電子基團。所述藥物試劑還包含水性藥物載體，其包括至少兩種選自peg-300、丙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、carbapol和laurocapram的溶劑。

還提供了通過使手術部位與藥物試劑接觸來局部施用藥物試劑在開放或微創(chuàng)手術領域中使髓磷脂堿性蛋白質(zhì)成像的方法。所述試劑包含式i化合物或其鹽，其中式i為：

其中r¹是烷基，r²是給電子基團且r³是吸電子基團，并且還包含水性藥物載體。所述方法還包括以下步驟，在施用之后，通過施用精調(diào)到試劑的光譜激發(fā)特性的光源來檢測試劑，以及通過精調(diào)到試劑的光譜發(fā)射特性的光學過濾器來觀察受試者。

還提供了用于提供上述局部施用的藥物試劑的試劑盒。

本發(fā)明還公開了以下方面。

第1項.一種局部施用的藥物試劑，其包含式i化合物或其鹽，其中式i為：

其中r¹是烷基，r²是給電子基團且r³是吸電子基團；和

水性藥物載體，其包含：

至少兩種選自peg-300、丙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、carbapol和laurocapram的溶劑。

第2項.第1項的藥物試劑，其中所述水性藥物載體包含，基于體積；

1-30%peg-300、1-20%丙二醇、1-10%聚乙烯基吡咯烷酮和0-10%laurocapram。

第3項.第1項的藥物試劑，其中所述水性藥物載體包含，基于體積；

10-30%peg-300和5-20%聚乙烯醇。

第4項.第1項的藥物試劑，其中r¹是1至6個碳原子的低級烷基，r²是伯胺、仲胺或叔胺或烷氧基。

第5項.第1項的藥物試劑，其中式i是：

其中r¹是烷基，r²是給電子基團，且r⁴和r⁵獨立地是氫、烷基、取代的烷基、胺、取代的胺，或一起形成雜環(huán)或取代的雜環(huán)結構。

第6項.第5項的藥物試劑，其中所述水性藥物載體包含，基于體積；

1-30%peg-300、1-20%丙二醇、1-10%聚乙烯基吡咯烷酮和0-10%laurocapram。

第7項.第5項的藥物試劑，其中所述水性藥物載體包含，基于體積；

10-30%peg-300和5-20%聚乙烯醇。

第8項.第5項的藥物試劑，其中r⁴和r⁵一起形成雜環(huán)或取代的雜環(huán)。

第9項.第8項的藥物試劑，其中r⁴和r⁵一起形成哌啶、哌嗪、嗎啉；烷基或烷氧基取代的哌啶、哌嗪或嗎啉。

第10項.第8項的藥物試劑，其中式i是：

。

第11項.第1項的藥物試劑，其中式i是進一步包含陰離子的鹽且所述陰離子是鹵離子、多原子陰離子或堿性活性化合物。

第12項.第11項的試劑，其中所述陰離子是氯離子。

第13項.一種通過局部施用藥物試劑在開放或微創(chuàng)手術領域中使髓磷脂堿性蛋白成像的方法，其包括以下步驟：

使手術部位與藥物試劑接觸，所述試劑包含

式i化合物或其鹽，其中式i是：

其中r¹是烷基，r²是給電子基團且r³是吸電子基團；和

水性藥物載體，其包含；

至少兩種選自peg-300、丙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、carbapol和laurocapram的溶劑；和

通過施用精調(diào)到試劑的光譜激發(fā)特性的光源來檢測試劑，以及通過精調(diào)到試劑的光譜發(fā)射特性的光學過濾器來觀察受試者；和

任選地基于試劑的光譜激發(fā)來確定髓磷脂的存在。

第14項.第13項的方法，其中所述檢測通過熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、交叉偏振顯微鏡、自動射線照相術或其組合來實現(xiàn)。

第15項.第13項的方法，其中所述水性藥物載體包含，基于體積；

1-30%peg-300、1-20%丙二醇、1-10%聚乙烯基吡咯烷酮和0-10%laurocapram。

第16項.第13項的方法，其中所述水性藥物載體包含，基于體積；

10-30%peg-300和5-20%聚乙烯醇。

第17項.第13項的方法，其中r¹是1至6個碳原子的低級烷基，r²是伯、仲或叔胺或烷氧基。

第18項.第13項的方法，其中式i是：

其中r¹是烷基，r²是給電子基團，且r⁴和r⁵獨立地是氫、烷基、取代的烷基、胺、取代的胺，或一起形成雜環(huán)或取代的雜環(huán)結構。

第19項.第18項的方法，其中所述水性藥物載體包含，基于體積；

1-30%peg-300、1-20%丙二醇、1-10%聚乙烯基吡咯烷酮和0-10%laurocapram。

第20項.第18項的方法，其中所述水性藥物載體包含，基于體積；

10-30%peg-300和5-20%聚乙烯醇。

第21項.第18項的方法，其中r⁴和r⁵一起形成雜環(huán)或取代的雜環(huán)。

第22項.第21項的方法，其中r⁴和r⁵一起形成哌啶、哌嗪、嗎啉；烷基或烷氧基取代的哌啶、哌嗪或嗎啉。

第23項.第22項的方法，其中式i是：

。

第24項.第13項的方法，其中式i是進一步包含陰離子的鹽且所述陰離子是鹵離子、多原子陰離子或堿性活性化合物。

第25項.第24項的方法，其中所述陰離子是氯離子。

第26項.一種用于提供局部施用的藥物試劑的試劑盒，所述藥物試劑包含：

式i化合物或其鹽，其中式i是：

其中r¹是烷基，r²是給電子基團且r³是吸電子基團；和

水性藥物載體，其包含；

至少兩種選自peg-300、丙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、carbapol和laurocapram的溶劑。

第27項.第26項的試劑盒，其中所述水性藥物載體包含，基于體積；

1-30%peg-300、1-20%丙二醇、1-10%聚乙烯基吡咯烷酮和0-10%laurocapram。

第28項.第26項的試劑盒，其中所述水性藥物載體包含，基于體積；

10-30%peg-300和5-20%聚乙烯醇。

第29項.第26項的試劑盒，其中所述藥物載體還包含共溶劑、表面活性劑、緩沖溶液、穩(wěn)定劑和防腐劑或其組合。

第30項.第26項的試劑盒，其中所述試劑盒還包括用于在第一室中儲存藥物試劑和在第二室中儲存藥物載體的多室容器。

附圖說明

當參照附圖閱讀以下詳述時，本發(fā)明的這些和其它特征、方面和優(yōu)點將變得更好理解，其中：

圖1表示在鼠模型中iv注射的formulai(f)formulai(f)的吸收和清除的動力學。

圖2a是在鼠模型中術中局部施用formulai(f)[式i(f)的化合物]之后來自神經(jīng)的代表性白光圖像。

圖2b是與圖2a相同的鼠模型，是在鼠模型中術中局部施用formulai(f)之后來自神經(jīng)的代表性熒光圖像。

圖2c是熒光顯微鏡圖像，顯示在鼠模型中術中局部施用之后環(huán)形髓磷脂束被formulai(f)染色。

圖2d是顯示通過局部施用的formulai(d)[式i(d)的化合物]在小鼠中的熒光神經(jīng)標記的顯微鏡圖像。

圖3是當在鼠模型中在手術部位處局部施用時比較在不同藥物載體中配制的formulai(f)的相對的神經(jīng)與肌肉(n/m)和神經(jīng)與脂肪組織(n/a)比率的圖。

圖4是在鼠模型中比較全身(靜脈內(nèi))施用的formulai(f)(圖a)與局部施用的formulai(f)(圖b)之間的對比的多譜成像圖。

圖5是在手術部位局部施用的在制劑6中的0.01毫克(a)和0.02毫克(b)formulai(f)的熒光圖像。

圖6a是從實時術中成像視頻提取的幀，其顯示局部施用于豬手術模型的4mg在制劑4中的formulai(f)的白光和熒光圖像；在白光成像下神經(jīng)完全不可見，而在熒光引導下是高度可檢測的(這兩個圖中的箭頭)。

圖6b是從實時術中成像視頻提取的幀，其顯示施用于腹膜后區(qū)域周圍的手術部位的0.3mg在制劑6中的formulai(f)的白光和熒光圖像；在較低劑量下，與白光成像相比，熒光成像下的神經(jīng)(箭頭)更明顯。

圖7是與僅與緩沖液一起溫育的對照組織相比，用10μm式i染料(ib-f)標記的冷凍切片神經(jīng)組織的比較性熒光顯微鏡圖像。標尺(scalebar)為約50微米。

具體實施方案

以下詳細描述是示例性的，并且不旨在限制應用本發(fā)明和本發(fā)明的用途。此外，不旨在受到在本發(fā)明的前述背景技術或附圖描述中給出的任何理論的限制。

為了更清楚簡明地描述和指出所要求保護的本發(fā)明的主題，對在下面的描述和所附權利要求中使用的特定術語提供以下定義。

“與髓磷脂相關的神經(jīng)病”通常是指其中包裹神經(jīng)元細胞一部分的絕緣材料以綜合征、疾病或其他病理狀況的組成部分的形式出現(xiàn)損傷或功能障礙的任何狀況，例如但不限于多發(fā)性硬化、guillain-barré綜合征、腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、refsum’s病、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、克拉伯病(krabbe’sdisease)、苯丙酮酸尿癥、卡納萬病(canavandisease)、pelizaeus-merzbacher病、亞歷山大病(alexander’sdisease)、糖尿病性神經(jīng)病、化療誘發(fā)的神經(jīng)病、阿爾茨海默病(alzheimer’sdisease)、血管性癡呆、路易體(lewybodies)癡呆或其任何組合。

“試劑”是指以允許化合物以所需濃度和功效施用的方式將化合物引入受試者的溶液或載體。所述試劑可以包括但不限于溶劑、穩(wěn)定助劑、緩沖劑和填料。藥物試劑是指具有藥物或其他生物學性質(zhì)的試劑，包括但不限于用于治療或診斷。

與不含髓磷脂的組織相比，如果試劑更頻繁地、更快地、更長時間地與髓磷脂結合，或對髓磷脂具有更大的親和力，則該試劑對髓磷脂表現(xiàn)出“特異性結合”?！胺翘禺愋越Y合”是指試劑與不含髓磷脂組織的結合。對于相對結合值，例如特異性結合或非特異性結合，應在類似的物理條件(即溫度、ph、制劑和施用模式)下測定每個樣品。通常，特異性結合的特征在于試劑對靶具有相對高的親和力和相對低至中等的容量(capacity)。通常，當親和力常數(shù)ka為至少10⁶m^-1時，認為結合是特異性的。更高的親和力常數(shù)表示更大的親和力，因此通常表示更高的特異性。例如，抗體通常以10⁶m^-1至10⁹m^-1或更高的親和力常數(shù)與抗原結合?！胺翘禺愋浴苯Y合通常具有低親和力，具有中等至高的容量。當親和力常數(shù)低于10⁶m^-1時，通常發(fā)生非特異性結合?？刂朴糜谑乖噭┡c組織接觸的時間和方法減少非特異性結合。

“洗滌”通常是指任何方法，例如但不限于浸沒在非標記溶液或其他物質(zhì)中或通過重復施用非標記溶液或其他溶液沖洗，例如但不限于水、鹽水、緩沖鹽水或乙醇，以便提供用于從組織或組織樣品的無髓鞘組分中解離、分散和去除未結合或非特異性結合的標記化合物而不消除對髓磷脂的特異性結合的介質(zhì)。

“基線熒光”是指在沒有施用或結合任何熒光化合物的情況下，在暴露于外部電磁輻射源時由組織或組織樣品發(fā)出的電磁輻射的頻率和幅度，區(qū)別于在施用和結合這種熒光化合物并暴露于外部電磁輻射源之后發(fā)出的輻射。

“組織切片的對照樣品代表”是指與待分析的組織樣品具有相似尺寸、形態(tài)或結構并具有一定的髓磷脂水平的組織樣品，籍此該樣品的髓磷脂水平用作對照，其他樣品的髓磷脂水平可以與之比較。

“藥物載體”是指這樣的組合物，其允許將試劑材料施用到施用部位、周圍組織或制備的組織切片上以允許試劑具有用于特異性結合靶標的有效停留時間或提供方便的釋放方式。增溶策略可包括但不限于ph調(diào)節(jié)、鹽形成、可電離化合物的形成、共溶劑的使用、絡合作用、表面活性劑和膠束、乳液和微乳液。藥物載體可以包括但不限于增溶劑、經(jīng)皮增強劑、去污劑、緩沖溶液、穩(wěn)定劑和防腐劑。這些的實例包括但不限于hcl、檸檬酸、dmso、丙二醇、乙醇peg300、環(huán)糊精、檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽或三(羥甲基)氨基甲烷。經(jīng)皮增強劑的實例是laurocapram，其還能夠運輸或攜帶化合物穿過屏障例如經(jīng)皮滲透。

“脫髓鞘模型”是指可以用于神經(jīng)性脫髓鞘的實驗研究中的任何實驗誘導的包裹神經(jīng)元細胞一部分的絕緣材料的損傷或功能障礙，包括但不限于實驗性過敏性腦脊髓炎。

“髓鞘再生(remyelination)”是指自發(fā)的、治療性的或實驗性誘導的修復、再生或以其他方式的包裹神經(jīng)元軸突的絕緣材料的構造或功能的增強。

“烷基”旨在包括直鏈、支鏈或環(huán)狀的烴結構及其組合，包括低級烷基和高級烷基。烷基是c20或更低的那些?！暗图壨榛笔侵?至6個碳原子、優(yōu)選1至4個碳原子的烷基，包括甲基、乙基、正丙基、異丙基和正丁基、仲丁基和叔丁基。高級烷基是指具有七個或更多個碳原子、優(yōu)選7-20個碳原子的烷基，并且包括正、仲和叔庚基、辛基和十二烷基。環(huán)烷基是烷基的子集并且包括3至8個碳原子的環(huán)狀烴基。環(huán)烷基的實例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和降冰片基。烯基和炔基是指其中兩個或更多個氫原子分別被雙鍵或三鍵置換的烷基。

“取代的”是指殘基，包括但不限于烷基、烷基芳基、芳基、芳基烷基和雜芳基，其中所述殘基的至多三個h原子被低級烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、鹵代烷基、烷氧基、羰基、羧基、烷氧基羰基(carboxalkoxy)、甲酰氨基(carboxamido)、酰氧基、脒基、硝基、鹵素、羥基、och(cooh)2、氰基、伯氨基、仲氨基、酰氨基、烷硫基(alkylthio)、亞砜、砜、苯基、芐基、苯氧基、芐氧基、雜芳基或雜芳氧基置換。

“給電子基團”是指向共軛π體系添加電子密度使其更親核的化學基團。給電子基團可以通過與π體系相鄰的原子上的孤對電子來識別。給電子基團的實例包括但不限于-nr’r’’、-nhr、-nh2、-nc(nh2)2、-oh、-or、-sr、-nhcor、-ocor、-c6h5和-ch=cr2。

“吸電子基團”是指從共軛π體系中移除電子密度使得結構較少親核的化學基團。吸電子基團可以通過與π體系相鄰的原子具有數(shù)個連接更加電負性原子的鍵或具有形式正電荷來識別。吸電子基團的實例包括但不限于-cho、-cor、-coor、-cooh、-conh2、-conhr、-conr2、-cf3、-cn、c=c(cn)2、-so3h、-nh3⁺、-nr3⁺、-no2、-sor、-so2r、-so2nh2、-so2nhr和-so2nr2。

如果與無髓鞘組織相比試劑更頻繁地、更快地、更長時間地或更大親和力地與有髓鞘組織結合，或者如果試劑被更多地吸收，或者更多地累積在有髓鞘組織中，則所述試劑顯示出對有髓鞘組織的“特異性吸收”。通常，特異性吸收的特征在于試劑對靶標的相對高的親和力。

除非另有說明，否則在說明書和權利要求書中使用的表示成分的量、性質(zhì)(如分子量)、反應條件等的所有數(shù)字應理解為在所有情況下由術語“約”修飾。因此，除非有相反的指示，否則在下面的說明書和所附權利要求中闡述的數(shù)值參數(shù)是近似值，其可以根據(jù)本發(fā)明尋求獲得的期望性質(zhì)而變化。至少而不是試圖限制權利要求范圍的等同原則的應用，每個數(shù)值參數(shù)應當至少根據(jù)記錄的有效數(shù)字的值并通過應用普通的舍入技術來解釋。

本文所述的許多化合物可包含一個或多個不對稱中心，并因此可產(chǎn)生對映異構體、非對映異構體和其它立體異構形式，根據(jù)絕對立體化學，其可定義為(r)-或(s)-。試劑的化學結構包括例如但不限于所有這些可能的異構體以及它們的外消旋和光學純形式。光學活性的(r)-和(s)-異構體可以使用手性合成子或手性試劑制備，或使用常規(guī)技術拆分。當本文所述的化合物包含烯屬雙鍵或其它幾何不對稱中心時，除非另有說明，否則該化合物旨在包括e和z幾何異構體兩者。同樣，也包括所有互變異構形式。

在某些實施方案中，提供了通過局部施用特異性結合髓磷脂堿性蛋白的試劑來定性或定量檢測髓磷脂堿性蛋白的方法?？赏ㄟ^式i化合物或其鹽與髓磷脂堿性蛋白特異性結合：

其中r¹是烷基，r²是給電子基團且r³是吸電子基團。

在某些實施方案中，r¹是具有1至6個碳原子、優(yōu)選1至4個碳原子的低級烷基，并且包括甲基、乙基、正丙基、異丙基和正丁基、仲丁基和叔丁基。給電子基團r²可以包括伯胺、仲胺或叔胺或烷氧基。優(yōu)選地，r²可以是胺，更優(yōu)選nh2。

在某些優(yōu)選的實施方案中，可通過式i(a)的化合物或其鹽與髓磷脂堿性蛋白特異性結合：

其中r⁴和r⁵可以用于改進水溶性并降低試劑的logp。r⁴和r⁵可以獨立地為氫原子或烷基，優(yōu)選為1至6個碳原子的低級烷基。在其它實施方案中，r⁴和r⁵可以獨立地為取代的烷基，例如但不限于烷氧基或醇。在某些實施方案中，所述烷氧基可以包含乙二醇單元或乙二醇封端的醇；例如(ch2ch2o)nx或ch2ch2ch2(och2ch2)nox，其中n是1和6之間的整數(shù)，x是氫、甲基或乙基。在其它實施方案中，r⁴和r⁵形成未取代或取代的雜環(huán)結構。所述雜環(huán)結構可以是哌啶、哌嗪或嗎啉；或烷基或烷氧基取代的哌啶、哌嗪或嗎啉。

在每個實施方案中，r²和磺酰胺基團r⁴r⁵nso2通過苯環(huán)的π雙鍵軌道和烯屬取代基共軛，從而為電子從供電子基團流向吸電子基團提供了清楚的路徑。

在某些實施方案中，所述試劑可以是式i的鹽，其中r⁴和r⁵可以包含具有陰離子的銨陽離子。銨鹽可以是叔銨鹽，其中陰離子可以是鹵離子。在其它實施方案中，陰離子可以是多原子的，例如但不限于硝酸根、碳酸根、硫酸根和磷酸根。多原子陰離子還可以包括鹵離子，例如但不限于四氟硼酸根、六氟磷酸根、氟代多磷酸根或其組合。在其它實例中，陰離子可以來源于羧酸，例如但不限于檸檬酸根、酒石酸根、馬來酸根、蘋果酸根、富馬酸根、衣康酸根或抗壞血酸根。對于體內(nèi)施用，具有低生物毒性的那些陰離子將是優(yōu)選的。

式i的其它非限制性實例示于表1(式i(b-f))中。

表1

在某些實施方案中，與類似試劑相比具有改進的水溶性的試劑可以減少試劑向非靶標組織例如脂肪組織的非特異性分配。此外，改進的水溶性可以使試劑配制在具有較少毒性或沒有已知毒性作用的藥物載體中，因此使它們更適合以較高劑量使用，并為研究人員和臨床醫(yī)生提供重要的診斷和治療工具。

在某些實施方案中，精調(diào)到試劑的光譜激發(fā)特性的光源可以施加于施用區(qū)域?？梢酝ㄟ^精調(diào)到其光譜發(fā)射特性的光學過濾器觀察試劑。由于它們與熒光劑的特異性結合，神經(jīng)和其它含髓磷脂組織可與不含髓磷脂堿性蛋白的組織區(qū)分開。這使得外科醫(yī)生能夠通過避免發(fā)熒光的組織來避免疏忽地切割或損傷有髓鞘組織，或有助于準確地對目標有髓鞘組織進行治療。

在某些實施方案中，藥物試劑可以是特別配制的，并且可以作為溶液、粉末、凝膠、乳液、霜劑、軟膏、珠?；蚰z原植入物局部施用。

在局部施用之后，精調(diào)到試劑的光譜激發(fā)特性的光源可以施加于施用區(qū)域?？梢酝ㄟ^精調(diào)到其光譜發(fā)射特性的光學過濾器觀察試劑。由于它們與熒光劑的特異性結合，神經(jīng)和其它含髓磷脂的組織可與不含髓磷脂堿性蛋白的組織區(qū)分開。這使得例如外科醫(yī)生能夠通過避免發(fā)熒光的組織來避免疏忽地切割或損傷有髓鞘組織，或有助于準確地對目標有髓鞘組織進行治療。在某些實施方案中，所述試劑包含式i化合物。

為了確定患者中的髓鞘形成是否有缺陷，可以將髓鞘形成水平與被認為或已知沒有患有與髓磷脂相關的神經(jīng)病的受試者所表現(xiàn)出來的那些相比較。在另一個實施方案中，可以確定脫髓鞘或髓鞘再生的速率。在用被認為或預期在罹患與髓磷脂相關的神經(jīng)病的患者中預防或減緩脫髓鞘或促進髓鞘再生的已知或建議的治療劑治療之后，通過對用治療劑治療的患者隨時間進行成像來評估髓鞘形成水平?？梢栽诓煌臅r間點進行成像且將在一個時間點的髓鞘形成水平與另一個時間點的髓鞘形成水平進行對比。因此，可以定性或定量地測定髓鞘形成水平。

在與髓磷脂堿性蛋白結合后，可以以適于從樣品中除去任何未結合和非特異性結合的標記的方式和介質(zhì)洗滌樣品，而不消除對髓磷脂堿性蛋白的特異性結合。

某些實施方案中，藥物載體可用于增強包含式i化合物或其鹽的試劑的溶解度、滲透性或生物利用度中的至少一種。在某些實施方案中，藥物載體可用于增強化合物在溶液中的溶解度，以及用于攜帶或運輸化合物穿過屏障，例如允許經(jīng)皮滲透。

在某些實施方案中，藥物載體可包括carbopol、聚乙二醇(例如peg-300)、丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮或laurocapram用于術中局部施用。

在某些實施方案中，藥物載體是水溶液，包含1-30%peg-300、1-20%丙二醇，1-10%聚乙烯基吡咯烷酮和0-10%laurocapram，基于體積。

在某些實施方案中，藥物載體是水溶液，包含20%peg-300、10%丙二醇，5%聚乙烯基吡咯烷酮和5%laurocapram，基于體積。

其它藥物載體可包括但不限于表面活性劑包括非離子表面活性劑、脂質(zhì)(包括三甘油酯)、環(huán)糊精和磷脂以及其它去污劑、緩沖溶液、穩(wěn)定劑和防腐劑。在每種情況下，水溶性和水不溶性有機溶劑兩者的使用可以與其它藥物載體組合使用以限制施用時的析出、疼痛、炎癥和同種溶解(homolysis)的發(fā)生。

增強試劑溶解度的技術可以包括ph調(diào)節(jié)、如上所述的鹽形成、共溶劑、絡合作用、乳液、膠束和脂質(zhì)體。藥物載體還可以包括但不限于表面活性劑例如去污劑、緩沖溶液、穩(wěn)定劑和防腐劑。在某些實施方案中，載體還可以包括經(jīng)皮增強劑，其用于攜帶化合物或藥物穿過屏障，包括透皮遞送。

在某些實施方案中，包含式i化合物或其鹽的試劑可以以試劑盒的形式包裝并提供，所述試劑盒確保試劑的無菌性以及其它關鍵參數(shù)例如ph、溶解度和濃度得以保持。試劑盒將包含以適于施用的形式的試劑，例如溶解于藥物載體中。在某些實施方案中，藥物載體可以進一步包括用于正確儲存或操作試劑的共溶劑、表面活性劑、緩沖溶液、穩(wěn)定劑和防腐劑或其組合。

在某些實施方案中，試劑盒可以被構造為用于在第一室中儲存藥物試劑并在第二室中儲存藥物載體的多室容器。在某些實施方案中，藥物試劑可以與藥物載體和任選的緩沖溶液、穩(wěn)定劑和防腐劑或其組合一起儲存在第一室中。第二室可包含藥物載體的其它組分，以在施用前增強溶解性。因此，載體的組分可能對于按照預期施用試劑是期望的，但是對于試劑的儲存或長期穩(wěn)定性是有害的。

實施例

示出了以下非限制性實施例，且這些實施例描述了本發(fā)明的各種實施方案。實施例包括了將全身施用的造影劑與術中局部施用神經(jīng)標記造影劑相比較所獲得的數(shù)據(jù)。如所示，證明了當正確地配制時，與全身施用的神經(jīng)標記試劑相比，局部施用的神經(jīng)標記造影劑可以在快得多的時間內(nèi)、以更低的劑量以及更好的神經(jīng)與肌肉的對比選擇性地標記神經(jīng)。造影劑的體外表征：

在100%二甲基亞砜(dmso)、無水甲醇(meoh)和蒸餾/去離子水(ddh2o)中使用200至800nm波長范圍的lambda20uv/vis光譜儀(perkinelmer,waltham,ma)測定試劑的吸收光譜。然后將最大吸光度的波長用作穩(wěn)態(tài)熒光計(photontechnologyinternational,birmingham,nj)上收集熒光發(fā)射光譜的激發(fā)波長。

神經(jīng)的離體(exvivo)標記：

從雄性spraguedawley大鼠收獲各種神經(jīng)。通過灌注固定組織并用10%中性緩沖福爾馬林后固定。在后固定后，將組織在20%蔗糖溶液(在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中制成)中低溫保護。然后使用甲醇和干冰在oct培養(yǎng)基中使神經(jīng)快速冷凍。在一些情況下，聚偏二氟乙烯膜用于幫助保持神經(jīng)在oct培養(yǎng)基中垂直。在leica切片機上切成5-10微米的切片并儲存在-80℃的冰箱中，然后用試劑(1)-(5)染色。

對于神經(jīng)切片的離體染色，將載玻片在pbs中漂洗(3×5分鐘)。將造影劑(終濃度為10μm)加到在緩沖液(含有在pbs中的10%cremophorel和65%大鼠血清)中的組織上。將載玻片在黑暗、潮濕的室中溫育1小時，然后用pbs洗滌(3×5分鐘)，蓋上蓋玻片并使用定制過濾立方體(filtercube)(激發(fā)過濾器：387nm，帶通11nm，409nm二向色鏡；發(fā)射過濾器：長通409nm)成像。也在相同設置下使用完全相同的程序對僅含緩沖液的對照物進行操作以確定自身熒光。

體內(nèi)成像裝置：

市售小動物系統(tǒng)：使用配備有多譜成像相機(nuance,cri,woburn,ma)的熒光立體顯微鏡(stereolumarv12,carlzeissinc.,thornwood,ny)，暴露時間為1-5秒。使用帶寬15nm以406nm為中心的過濾器實現(xiàn)熒光團的激發(fā)。使用附帶的多譜照相機以10nm增量在420至720nm的波長范圍記錄熒光發(fā)射光譜?；蛘?，我們還使用具有550長通過濾器的發(fā)射過濾器(在沒有多譜相機的情況下)。

使用雙模式腹腔鏡熒光成像裝置實現(xiàn)實時術中成像。腹腔鏡模塊包括：具有70度視野的標準10mm零度外科腹腔鏡；直徑4mm、長1800mm的腹腔鏡光導；35mm視頻連接器；緊湊型90g、659×494像素gige彩色照相機(aca640-90gcbasler,ahrensburg,德國)和405nm阻塞過濾器(blockingfilter)(blp01-405rsemrock,rochester,ny)，其在420至800nm具有>97%透射率。1/3”格式傳感器提供高靈敏度和7.4μm的像素尺寸和足夠的視野(70度中的40度被腹腔鏡通過)。視頻連接器與腹腔鏡的目鏡接口，為不同類型的腹腔鏡提供可互換的設置。405nm過濾器直接固定在帶有c型安裝固定環(huán)的圖像傳感器的前面。攝像機直接螺紋連接到視頻連接器。

使用常規(guī)光學器件將用于白光成像和熒光成像的輻照耦合到單個光導中。光耦合模塊由兩個32mm的校準白光led的非球面透鏡和耦合到直徑400μm的多模光纖中的500mw、405nm藍色激光二極管(shanghailaser&opticscenturyco.,ltd.,china)組成。用450nm的長通過濾器(nt49-819,edmundoptics,barrington,nj)過濾led光譜，以使熒光劑的激發(fā)最小化，同時保持白光色譜。led和激光器與425nm二向色鏡(dmlp425r,thorlabs)組合。組合的輻照用第三個32mm非球面透鏡(acl4532,thorlabs)耦合到光導中。來自led和405nm激光器的最大輻照度在距離腹腔鏡尖端25mm處分別為2.0mw/cm²和7.3mw/cm²。

在動物模型中用于全身iv注射造影劑之后體內(nèi)成像的制劑、劑量和動力學：

對于通過iv注射全身施用，使用以下賦形劑配制造影劑：5-15%丙二醇(fisherp355-1)、5-30%2-羥丙基-β-環(huán)糊精(2-hpβcd,sigmah5784)和70-90%蒸餾/去離子水。在一些情況下，還加入peg-300和dmso。使用1m鹽酸使iv制劑的最終ph達到7.4。使用以下方法來驗證formulai(f)在制劑中的完全溶解：(1)目視觀察顆粒，(2)離心(在12,000g下5分鐘)，然后觀察，(3)溶解于生理學上相關的緩沖液(例如sorenson's磷酸鹽緩沖液)中，隨后目視觀察和uv/vis分析，和(4)使用動態(tài)光散射評價沉降和粒度。

特別是，formulai(f)的iv制劑由80%蒸餾/去離子水、10%2-羥丙基-β-環(huán)糊精(2-hpβcd,sigmah5784)和10%丙二醇(fisherp355-1)組成。

為了對鼠進行研究，從charlesriverlaboratories(wilmington,ma)購買體重為25至30g的cd-1小鼠和體重為250至300g的sprague-dawley大鼠。在實驗當天，使用2%-4%異氟烷麻醉小鼠或大鼠，并給予單次尾靜脈注射16mg/kg的每種iv配制的formulai(f)。然后將動物放回窩籠，直到指定的成像時間點。

用于術中局部施用的制劑和劑量：

測試數(shù)種不同的制劑，包括但不限于：

制劑1：10%peg-300；20%pg；0.4%carbopol；69.6%水；

制劑2：10%dmso；20%peg-800；20%pg；0.1%聚山梨醇酯-80；49.9%水；

制劑3：30%peg-300；5%dmso；10%pva；55%水；

制劑4：30%peg-300；10%pva；60%水；

制劑5：30%peg-300；5%dmso；30%pluronicf-68；0.1%聚山梨醇酯-80；34.9%水；

制劑6：20%peg-300；10%pg；5%pvp；5%laurocapram；60%水；

制劑7：20%peg-300；10%pg；5%pvp；5%laurocapram；5%乙醇；5%油酸；10%吐溫-80；40%水；

其中：pva=聚乙烯醇；pvp=聚乙烯基吡咯烷酮；且peg=聚乙二醇。

將各種量的粉末狀造影劑配制到上述賦形劑中。將溶液或凝膠施用于鼠模型中的手術部位，接觸時間為小于1分鐘至20分鐘。然后用洗液(例如溫鹽水)沖洗手術部位，并對動物成像。

對于豬成像研究，用替來他明(tiletamine)/唑拉西泮(zolazepam)(4.4mg/kg)使豬鎮(zhèn)靜，給予胃長寧(glycopyrrolate)(0.007mg/kg)，并且在剖腹術之前沿著中線皮下實現(xiàn)丁哌卡因(bupivacaine)(0.25%)的局部浸潤。對豬實施插管并在手術期間保持在異氟烷(1.5%-2.5%)下。將16號血用導管(angiocatheter)置于耳靜脈中用于血液收集和藥物施用。在過程期間以10-15ml/kg/h的速率給予normosol-r。連續(xù)監(jiān)測生命體征、溫度，進行輸氧以確保豬的安全和健康。將溶液或凝膠施加到手術部位中，接觸時間為1分鐘至5分鐘。然后用溫鹽水沖洗手術部位，并對手術部位成像。

圖1顯示了在鼠模型中iv注射的formulai(f)的吸收和清除的動力學。使用16.6mg/kg劑量的formulai(f)在iv注射之后0.5、1、2、3和4小時處測量神經(jīng)熒光。在注射后1小時處觀察到最大坐骨神經(jīng)和脂肪組織熒光，并在隨后的時間點迅速減少。在注射后1小時處觀察到最佳的神經(jīng)與肌肉比率，該值為3.7。

局部施用的神經(jīng)標記染料還能夠在活動物中標記神經(jīng)。在術中局部施用之后幾分鐘內(nèi)可以檢測到來自神經(jīng)的熒光。在小鼠中局部施用的formulai(f)的代表性白光和熒光圖像顯示在圖2a(白光)和圖2b(熒光)中。當使用術中雙模式腹腔鏡裝置觀察時，在鼠模型的臂叢神經(jīng)分支中的非常細的神經(jīng)纖維在熒光引導下更容易檢測。在該實施例中，將在制劑4中的formulai(f)施用于小鼠的臂叢神經(jīng)手術部位持續(xù)5分鐘，然后在成像之前用無菌鹽水沖洗該區(qū)域。

圖2c表明，類似于iv注射的造影劑，局部施用的造影劑可以滲透到神經(jīng)束中。在鼠模型中局部施用、沖洗和切除坐骨神經(jīng)之后，將神經(jīng)組織低溫切片成15微米厚的切片。熒光顯微鏡成像顯示，環(huán)形髓磷脂束被熒光團染色。

圖2d表示通過局部施用的formulai(d)在小鼠中的熒光神經(jīng)標記，formulai(d)是其核心結構與formulai(f)相關的化合物。使用小動物市售裝置進行成像。

圖3顯示當施用于鼠模型中的手術部位時局部施用的formulai(f)的相對的神經(jīng)與肌肉(n/m)和神經(jīng)與脂肪組織(n/a)，比較了用于術中局部施用的不同藥物載體。如上所述formulai(f)以不同方式配制。不同的制劑影響神經(jīng)和周圍組織之間的對比。例如，制劑6和制劑4證明了在神經(jīng)與肌肉和神經(jīng)與脂肪組織之間的最佳對比。加入各種制劑組分以影響：(a)試劑的溶解，(b)配制的試劑的穩(wěn)定性，(c)配制的試劑的粘度以增強手術部位的暴露，(d)試劑在手術部位內(nèi)的滲透，和(e)特異性信號和非特異性背景熒光。將約70微克的配制的formulai(f)施用于手術部位保持約1分鐘，然后用鹽水洗滌。

由于來自周圍非靶標組織(例如肌肉)的非特異性熒光較低，局部施用的神經(jīng)標記劑可以進一步產(chǎn)生更清晰的圖像。圖4顯示了多譜成像曲線，該曲線比較了在鼠模型中全身(靜脈內(nèi))施用的formulai(f)(圖4a)與局部施用的formulai(f)(圖4b)之間的對比。對于局部施用的造影劑，在給定手術部位中可見所需的總劑量較少。在該實施例中，formulai(f)的iv注射劑量為約16mg/kg(對于典型的小鼠為0.4毫克)。在制劑4中局部施用劑量為約0.1毫克。圖4顯示了神經(jīng)在局部施用的試劑下更清晰可見，原因是與全身施用的造影劑相比在所有發(fā)射波長上來自周圍肌肉組織的熒光強度較低。

可以以低得多的濃度施用術中局部劑量。劑量低至0.01mg可以有效地可見小鼠模型中的熒光神經(jīng)。在圖5中，在手術部位局部施用0.01或0.02mg在制劑6中的formulai(f)，溫育3分鐘，隨后立即用鹽水沖洗。

放大到更大的動物，還在豬手術模型中對局部施用的formulai(f)進行測試。在圖6a中，將4mg在制劑4中的formulai(f)施用于手術區(qū)域中，溫育5分鐘，隨后用溫鹽水沖洗。在白光成像下神經(jīng)完全不可見，而在熒光引導下高度可檢測(在這兩個圖中的箭頭)。在圖6b中，將0.3mg在制劑6中的formulai(f)施用于腹膜后區(qū)域周圍的手術部位，然后溫育3分鐘，隨后用鹽水沖洗。即使在該較低的劑量下，與白光成像相比，神經(jīng)(箭頭)在熒光成像下更明顯。在豬模型中的這些術中局部劑量遠小于全身iv注射的典型劑量(對于35千克的豬通常在30-50毫克神經(jīng)標記劑之間)。

已經(jīng)針對formulai(f)和formulai(d)在活動物中證明了神經(jīng)標記染料的術中局部施用。與這類化合物的“推拉型(push-pull)”核結構相關的分子也將受益于這種新施用方法。以下是切除的神經(jīng)組織的離體標記的實例。在這里，化合物用于染色來自大鼠的低溫切片神經(jīng)組織。圖7顯示了熒光標記的大鼠神經(jīng)組織切片的顯微圖像的實例。這里，“推拉型”化合物(formulai(f)、formulai(d)和formulai(e))顯示出神經(jīng)組織切片最穩(wěn)健的熒光染色。

雖然本文僅示出和描述了實施方案的某些特征，但是本領域技術人員將想到許多修改和改變。因此，應當理解，所附權利要求旨在覆蓋落入本發(fā)明的精神內(nèi)的所有這樣的修改和改變。