本發(fā)明涉及5-醛基胞嘧啶的標(biāo)記
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及5-醛基胞嘧啶的標(biāo)記方法及其在單堿基分辨率測(cè)序中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：dna甲基化與去甲基化研究是表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域最為重要的研究?jī)?nèi)容之一?；蛘{(diào)控區(qū)的甲基化與去甲基化調(diào)控關(guān)系到下游基因的表達(dá)激活與抑制，從而參與相應(yīng)的生物學(xué)過程。在哺乳動(dòng)物中，dna的甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶的5號(hào)位上形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mc)。5mc的去甲基化過程是通過tet(ten-eleventranslocation)家族蛋白的氧化完成的：5mc被氧化逐步產(chǎn)生5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmc)、5-醛基胞嘧啶(5-formylcytosine，5fc)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5cac)，并通過堿基切除修復(fù)通路切除5fc及5cac實(shí)現(xiàn)dna的去甲基化過程(mamtatahiliani,etal.,science,2009,324:931-935；skirmantaskriaucionisandnathanielheintz,science,2009,324:929-930；tonipfaffeneder,etal.,angewandtechemieinternationaledition,2011,123:7146–7150；shinsukeito,etal.,science,2011,333:1300-1303；yufeihe,etal.,science,2011,333:1303-1307)。為了研究這一類表觀遺傳修飾堿基的生物學(xué)功能，了解其在基因組中的分布區(qū)域和具體序列信息是重要前提。成熟的dna甲基化分析方法有亞硫酸氫鈉測(cè)序方法(bisulfitesequencing)，可以鑒定出單堿基分辨率的5mc序列信息。通過亞硫酸氫鈉的處理，基因組中的普通的胞嘧啶c轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,pcr)擴(kuò)增并測(cè)序讀取為胸腺嘧啶t；而5mc由于5號(hào)位供電子效應(yīng)的甲基存在，使得亞硫酸氫鈉處理過程難以發(fā)生脫氨基化轉(zhuǎn)變，因而在pcr擴(kuò)增和測(cè)序過程中仍舊讀取c(michaelj.booth,etal.,science,2012,336:934-937.)。在dna的甲基化之外，5hmc、5fc及5cac作為能穩(wěn)定存在于基因組中的修飾堿基，也可能存在特有的生物學(xué)功能，因此確定這三種胞嘧啶衍生物在基因組中的分布信息對(duì)于探索其功能至關(guān)重要。但5hmc、5fc及5cac的發(fā)現(xiàn)使得亞硫酸氫鈉測(cè)序變得更為復(fù)雜。如在正常亞硫酸氫鈉測(cè)序過程中，5hmc會(huì)對(duì)亞硫酸氫鹽處理有抵抗力，因此會(huì)被讀取為c，而5fc和5cac均讀取為t(michaelj.booth,etal.,science,2012,336:934-937)。為了區(qū)分這些胞嘧啶衍生物，需要發(fā)展新的單堿基分辨率測(cè)序技術(shù)來鑒定這些新修飾堿基在基因組中的位置。目前已有一些針對(duì)5-醛基胞嘧啶相關(guān)化學(xué)反應(yīng)的研究，這些研究主要著眼于5fc胞嘧啶環(huán)上5號(hào)位醛基?；谌┗軌蚺c羥胺化合物的氨基反應(yīng)生成肟，研究人員設(shè)計(jì)了針對(duì)5fc醛基的反應(yīng)(shinsukeito,etal.,science,2011,333:1300-1303；eun-angraiber,etal.,genomebiology,2012,13:r69；chunxiaosong,etal.,cell,2013,153:678–691)，并將其應(yīng)用于檢測(cè)基因組中5fc的位置；利用醛基與氨基的反應(yīng)發(fā)展了熒光基團(tuán)標(biāo)記5fc的方法(jianlinhu,etal.,chemistry-aeuropeanjournal,2013,19:5836-5840)；利用nabh4將醛基還原為羥甲基從而使5fc還原為5hmc，并在亞硫酸氫鈉測(cè)序過程中5fc位點(diǎn)轉(zhuǎn)變讀取為c，也可在特定區(qū)域鑒定出5fc堿基的位置(chunxiaosong,etal.,cell,2013,153:678–691；michaelj.booth,etal.,naturechemistry,2014,6:435-440)。遺憾的是，這些方法都不適用于單細(xì)胞基因組中5fc的檢測(cè)。因此，需要發(fā)展一種新的高生物兼容性、高靈敏度的單細(xì)胞水平的5fc標(biāo)記和檢測(cè)方法，這對(duì)進(jìn)一步推進(jìn)dna主動(dòng)去甲基化的研究具有關(guān)鍵作用，同時(shí)對(duì)于表觀遺傳在臨床檢測(cè)和疾病診療方面的研究(例如胚胎、癌細(xì)胞等)也具有重要意義。目前在單細(xì)胞水平上進(jìn)行對(duì)dna表觀遺傳學(xué)修飾的測(cè)序技術(shù)主要集中于5mc及5hmc。單細(xì)胞5mc測(cè)序技術(shù)基于亞硫酸氫鈉處理(hongshanguo,etal.,genomeresearch,2013；sebastienasmallwood,etal.,naturemethods,2014；matthiasfarlik,etal.,cellreports,2015)。通過對(duì)亞硫酸氫鈉處理與建庫流程進(jìn)行優(yōu)化，可以穩(wěn)定檢測(cè)到約18％的cpg位點(diǎn)(sebastienasmallwood,etal.,naturemethods,2014)。因?yàn)閱渭?xì)胞基因組中5fc的含量相比5mc非常低，且亞硫酸氫鈉處理會(huì)對(duì)dna造成較大的損傷，導(dǎo)致大量dna降解，所以基于亞硫酸氫鈉處理的測(cè)序技術(shù)并不適合單細(xì)胞基因組中5fc的測(cè)定；因此，尋找一種適用于單細(xì)胞基因組中5fc的測(cè)序方法是本領(lǐng)域亟待解決的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種5-醛基胞嘧啶的標(biāo)記方法及其在單堿基分辨率測(cè)序中的應(yīng)用，以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平、單堿基分辨率地對(duì)dna或rna中的5-醛基胞嘧啶的檢測(cè)；具體技術(shù)方案如下：本發(fā)明提供了一種5-醛基胞嘧啶的標(biāo)記方法，其包括以下步驟：(1)準(zhǔn)備dna或rna樣品；(2)將dna或rna樣品與緩沖溶液、化合物r1-ch2-cn混合，得到標(biāo)記反應(yīng)體系；并使其中的化合物r1-ch2-cn與dna或rna分子中的5-醛基胞嘧啶反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)5-醛基胞嘧啶的標(biāo)記；反應(yīng)過程如下：其中，r1為緊鄰著ch2基團(tuán)的吸電子基團(tuán)，優(yōu)選為-cn、更優(yōu)選為-cn；r為與5-醛基胞嘧啶連接的dna或rna分子：所述標(biāo)記反應(yīng)體系的ph值為7.5-9。一種優(yōu)選實(shí)施方式中，其中所述標(biāo)記反應(yīng)體系的ph值為8-9，優(yōu)選為8。一種優(yōu)選實(shí)施方式中，其中化合物r1-ch2-cn在所述標(biāo)記反應(yīng)體系中的濃度為75-1500mm,優(yōu)選為75-1000mm，更優(yōu)選為75-500mm，最優(yōu)選為150mm。一種優(yōu)選實(shí)施方式中，其中在步驟(2)中，反應(yīng)條件為：20℃-60℃，優(yōu)選為30℃-40℃，更優(yōu)選為37℃下反應(yīng)12-48小時(shí)，優(yōu)選18-30小時(shí)，更優(yōu)選為20小時(shí)。本發(fā)明還提供了一種5-醛基胞嘧啶的單堿基分辨率的測(cè)序方法，其中，該方法包括以下步驟：(ⅰ)按前述的方法標(biāo)記dna或rna樣品；(ⅱ)將反應(yīng)完成后的標(biāo)記反應(yīng)體系擴(kuò)增及測(cè)序，得到標(biāo)記后測(cè)序結(jié)果；(ⅲ)將標(biāo)記后的測(cè)序結(jié)果與dna或rna參照序列圖譜進(jìn)行對(duì)比，若序列中同一位置的堿基在參照序列圖譜中讀取為胞嘧啶，在標(biāo)記后讀取為胸腺嘧啶，則確定該位置的堿基為5-醛基胞嘧啶。一種優(yōu)選實(shí)施方式中，其中所述dna或rna樣品是痕量樣品或從單細(xì)胞獲得的樣品，所述單細(xì)胞來源于胚胎干細(xì)胞、配子、早期胚胎、癌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或血細(xì)胞等。一種優(yōu)選實(shí)施方式中，其中步驟(ii)中反應(yīng)完成后的標(biāo)記反應(yīng)體系不經(jīng)過純化直接進(jìn)行擴(kuò)增。一種優(yōu)選實(shí)施方式中，其中擴(kuò)增的方法采用malbac或scrrbs擴(kuò)增方法。本發(fā)明還提供了一種dna或rna的擴(kuò)增體系，其包含前述步驟(ii)中反應(yīng)完成后的標(biāo)記反應(yīng)體系。本發(fā)明還提供了一種5-醛基胞嘧啶的單堿基分辨率測(cè)序用試劑盒，其包括ph值為7.5-9的緩沖溶液、丙二腈和擴(kuò)增相關(guān)試劑。本發(fā)明還提供了一種5-醛基胞嘧啶的定量檢測(cè)方法，其包括以下步驟：(a)將n個(gè)已知的5-醛基胞嘧啶含量不同的模式序列按照前述的測(cè)序方法測(cè)序并確定c-t轉(zhuǎn)換比例，其中n≥2；所述c-t轉(zhuǎn)換比例為序列中同一位置的堿基標(biāo)記前讀取為胞嘧啶c，標(biāo)記后讀取為胸腺嘧啶t的比例；(b)以5-醛基胞嘧啶含量為橫/縱坐標(biāo)，以c-t轉(zhuǎn)換比例為縱/橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(c)按照前述的測(cè)序方法對(duì)5-醛基胞嘧啶含量未知的dna或rna測(cè)序，并確定c-t轉(zhuǎn)換比例；(d)根據(jù)步驟(c)中確定的c-t轉(zhuǎn)換比例及步驟(b)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定5-醛基胞嘧啶含量未知的dna或rna中的5-醛基胞嘧啶含量。本發(fā)明利用化合物r1-ch2-cn與5-醛基胞嘧啶的特異性化學(xué)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞、單堿基分辨率的5-醛基胞嘧啶標(biāo)記。進(jìn)一步地，利用本發(fā)明提供的標(biāo)記方法，可以對(duì)dna或rna樣品中的5-醛基胞嘧啶進(jìn)行測(cè)序分析，確定5-醛基胞嘧啶的序列分布信息。由于標(biāo)記過程中不進(jìn)行亞硫酸氫鈉處理，不會(huì)造成dna或rna的損傷；而且丙二腈的處理也不會(huì)使得dna或rna降解；進(jìn)一步地，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，在對(duì)dna或rna中的5-醛基胞嘧啶進(jìn)行測(cè)序分析過程中，反應(yīng)完成后的標(biāo)記反應(yīng)體系可以不經(jīng)過純化直接進(jìn)行擴(kuò)增，減少了dna的損失；因此本發(fā)明提供的5-醛基胞嘧啶測(cè)序分析方法可以在單細(xì)胞水平上進(jìn)行，并實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率水平的測(cè)序；使其更適用于多種痕量樣品及珍貴生物學(xué)樣品，例如胚胎干細(xì)胞、配子或早期胚胎、癌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為實(shí)施例1中用丙二腈與6種含不同胞嘧啶的9堿基dna序列反應(yīng)前后的質(zhì)譜結(jié)果圖，其中，經(jīng)丙二腈(malononitrile，m)標(biāo)記的5fc簡(jiǎn)稱為5fc-m。圖2a為實(shí)施例2中利用丙二腈標(biāo)記5-醛基胞嘧啶的結(jié)果；圖2b為實(shí)施例3-12中利用丙二腈標(biāo)記5-醛基胞嘧啶的結(jié)果；圖2c為對(duì)比例1-4中利用丙二腈標(biāo)記5-醛基胞嘧啶的結(jié)果，圖2d為實(shí)施例13中利用3-氧代丁腈標(biāo)記5-醛基胞嘧啶的結(jié)果。圖3為實(shí)施例16中未經(jīng)純化與經(jīng)純化的丙二腈標(biāo)記后的反應(yīng)體系的擴(kuò)增產(chǎn)物比較結(jié)果。圖4a及圖4b為實(shí)施例17中丙二腈標(biāo)記反應(yīng)不會(huì)降解dna的驗(yàn)證結(jié)果。圖5為實(shí)施例18、19的部分測(cè)序?qū)Ρ冉Y(jié)果。圖6為實(shí)施例20繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式本發(fā)明首先提供了一種5-醛基胞嘧啶的標(biāo)記方法，其包括以下步驟：(1)準(zhǔn)備dna或rna樣品；(2)將dna或rna樣品與緩沖溶液、化合物r1-ch2-cn混合，得到標(biāo)記反應(yīng)體系；并使其中的化合物r1-ch2-cn與dna或rna分子中的5-醛基胞嘧啶反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)5-醛基胞嘧啶的標(biāo)記；從而實(shí)現(xiàn)反應(yīng)過程如下：其中，r1為緊鄰著ch2基團(tuán)的吸電子基團(tuán)，優(yōu)選為-cn、等，更優(yōu)選為-cn；r為與5-醛基胞嘧啶連接的dna或rna分子：所述標(biāo)記反應(yīng)體系的ph值為7.5-9。對(duì)于步驟(1)準(zhǔn)備dna或rna樣品，其可以采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，例如可以將一個(gè)細(xì)胞采用常規(guī)方法裂解，得到的dna或rna樣品；本發(fā)明在此對(duì)步驟(1)不進(jìn)行限定。發(fā)明人通過研究意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)標(biāo)記反應(yīng)體系的ph值為7.5-9，優(yōu)選為ph值為8-9，優(yōu)選為8時(shí)，步驟(2)反應(yīng)的產(chǎn)率很高，可以達(dá)到98％以上。本文中所說的產(chǎn)率指的是在標(biāo)記反應(yīng)體系中，5-醛基胞嘧啶與化合物r1-ch2-cn成環(huán)反應(yīng)后的產(chǎn)物的量與反應(yīng)前5-醛基胞嘧啶的量的比值，再乘以100％。發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，當(dāng)化合物r1-ch2-cn具體為丙二腈時(shí)，標(biāo)記反應(yīng)體系中存在同樣濃度的丙二腈的情況下，步驟(2)的產(chǎn)率明顯高于ph值為7以下的標(biāo)記反應(yīng)體系。例如，當(dāng)丙二腈在標(biāo)記反應(yīng)體系中的濃度為150mm，標(biāo)記反應(yīng)體系的ph值為7.5-9，優(yōu)選為ph值為8-9，優(yōu)選為8時(shí)，產(chǎn)率可以達(dá)到99％以上，一些具體實(shí)施方案中，可以達(dá)到99.1％，一些具體實(shí)施方案中，可以達(dá)到99.2％；一些具體實(shí)施方案中，可以達(dá)到99.3％；一些具體實(shí)施方案中，可以達(dá)到99.4％。而當(dāng)標(biāo)記反應(yīng)體系在弱酸性條件下時(shí)，產(chǎn)率最多略高于98％。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，將產(chǎn)率從98％提升至99％以上是極難實(shí)現(xiàn)的。而且在現(xiàn)有技術(shù)中，沒有報(bào)道過將標(biāo)記反應(yīng)體系調(diào)至弱堿性，可以提高產(chǎn)率，可見本申請(qǐng)取得了意料不到的技術(shù)效果。一種具體實(shí)施方案中，可以通過將dna樣品或rna樣品在與化合物r1-ch2-cn反應(yīng)后進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序；并根據(jù)測(cè)序結(jié)果峰圖中對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的c(胞嘧啶)信號(hào)峰高度(hc)及t(胸腺嘧啶)信號(hào)峰高度(ht)，通過公式：hc/[hc+ht]×100％計(jì)算產(chǎn)率。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，得到標(biāo)記反應(yīng)體系的過程可以是將緩沖溶液、含有化合物r1-ch2-cn的水溶液及dna或rna樣品混合在一起，從而使標(biāo)記反應(yīng)體系的ph值為7.5-9的過程。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)標(biāo)記反應(yīng)體系中所加入的化合物r1-ch2-cn及dna或rna樣品相對(duì)緩沖溶液的體積較小時(shí)，所得到的標(biāo)記反應(yīng)體系的ph值與所加的緩沖溶液的ph值是基本一致的。也就是說，可以將緩沖溶液的ph值作為標(biāo)記反應(yīng)體系的ph值，顯然這是合理的。例如，分別配制如表1所示的2ml的50mmnh4ac及10mmtris-hcl緩沖溶液，用醋酸或稀鹽酸調(diào)整ph至表1(0mm丙二腈一欄)所示。分別加入20μl15m丙二腈水溶液到各緩沖溶液中使丙二腈終濃度達(dá)到150mm，渦旋混勻并使用ph計(jì)再次測(cè)量含有丙二腈的緩沖溶液ph值，如表1(150mm丙二腈一欄)所示。從表1中可以看出，即使向緩沖溶液中加入少量其它物質(zhì)，也基本不會(huì)改變緩沖溶液的ph值。表1.緩沖溶液50mmnh4ac50mmnh4ac50mmnh4ac10mmtris-hcl10mmtris-hcl0mm丙二腈5.06.07.08.09.0150mm丙二腈5.06.06.98.08.9本發(fā)明下述各實(shí)施例中其它物質(zhì)的加入量相比緩沖溶液的量較小，發(fā)明人經(jīng)過驗(yàn)證確認(rèn)，均滿足將緩沖溶液的ph值作為標(biāo)記反應(yīng)體系的ph值的條件；因此在下述各實(shí)施例中將緩沖溶液的ph值作為標(biāo)記反應(yīng)體系的ph值。一個(gè)具體實(shí)施方案中，得到標(biāo)記反應(yīng)體系的緩沖溶液可以為tris-hcl緩沖溶液(ph值為7.5-9)。在本發(fā)明技術(shù)方案的具體實(shí)施過程中，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記反應(yīng)體系中化合物r1-ch2-cn，例如丙二腈的濃度也對(duì)產(chǎn)率有影響；并不限于任何理論地得到以下結(jié)論：當(dāng)化合物r1-ch2-cn，例如丙二腈在所述標(biāo)記反應(yīng)體系中的濃度為75-1500mm，優(yōu)選為75-1000mm，更優(yōu)選為75-500mm，最優(yōu)選為150mm時(shí)，其標(biāo)記效果，即產(chǎn)率要好于75mm以下或1500mm以上的濃度。需要說明的是，當(dāng)采用濃度為75-1500mm化合物r1-ch2-cn時(shí)，其相對(duì)標(biāo)記反應(yīng)體系中的5-醛基胞嘧啶是過量的。在得到標(biāo)記反應(yīng)體系后，可以使標(biāo)記反應(yīng)體系在適宜的溫度下進(jìn)行反應(yīng)，以使化合物r1-ch2-cn與dna或rna分子中的5-醛基胞嘧啶反應(yīng)。一個(gè)具體實(shí)施方案中，使標(biāo)記反應(yīng)體系在20℃-60℃，反應(yīng)12-48小時(shí)，優(yōu)選18-30小時(shí)，更優(yōu)選為20小時(shí)。一個(gè)具體實(shí)施方案中，使標(biāo)記反應(yīng)體系在30℃-40℃，反應(yīng)12-48小時(shí)，優(yōu)選18-30小時(shí)，更優(yōu)選為20小時(shí)。一個(gè)具體實(shí)施方案中，使標(biāo)記反應(yīng)體系在37℃下反應(yīng)12-48小時(shí)，優(yōu)選18-30小時(shí)，更優(yōu)選為20小時(shí)。在反應(yīng)過程中，可以采用一定的混勻方式將化合物r1-ch2-cn及dna或rna樣品混勻。例如當(dāng)dna或rna樣品是將一個(gè)細(xì)胞采用常規(guī)方法裂解后所得到的dna或rna樣品時(shí)，可以采用恒溫混勻儀進(jìn)行混勻孵育。本發(fā)明利用化合物r1-ch2-cn與5-醛基胞嘧啶的特異性化學(xué)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)5-醛基胞嘧啶的標(biāo)記。不僅如此，由于化合物r1-ch2-cn不會(huì)與c，5mc，5hmc，5cac及5fu(5-醛基尿嘧啶)發(fā)生反應(yīng)，因此，本發(fā)明提供的標(biāo)記方法能夠特異性的標(biāo)記5-醛基胞嘧啶。在實(shí)現(xiàn)利用化合物r1-ch2-cn特異性地標(biāo)記5-醛基胞嘧啶的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了一種5-醛基胞嘧啶的單堿基分辨率的測(cè)序方法，其包括以下步驟：(ⅰ)按本發(fā)明前述的方法標(biāo)記dna或rna樣品；(ⅱ)將反應(yīng)完成后的標(biāo)記反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序，得到標(biāo)記后測(cè)序結(jié)果；(ⅲ)將標(biāo)記后的測(cè)序結(jié)果與dna或rna參照序列圖譜進(jìn)行對(duì)比，若序列中同一位置的堿基在參照序列圖譜中讀取為胞嘧啶，在標(biāo)記后讀取為胸腺嘧啶，則確定該位置的堿基為5-醛基胞嘧啶。所述“dna或rna參照序列圖譜”是已經(jīng)公開的基于現(xiàn)有技術(shù)中的測(cè)序方法獲得的dna或rna樣品或基因組的序列信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過例如從加州大學(xué)圣克魯茲分校基因組瀏覽器(ucsc基因組瀏覽器，ucscgenomebrowser)或genbank獲得這些dna或rna參照序列圖譜。在所述參照序列圖譜中，5-醛基胞嘧啶仍然讀取為胞嘧啶。本發(fā)明則利用5-醛基胞嘧啶與化合物r1-ch2-cn的反應(yīng)產(chǎn)物在擴(kuò)增過程中突變?yōu)樾叵汆奏，因而測(cè)序結(jié)果也顯示為t。通過與參照序列圖譜對(duì)比，尋找c-t的突變位點(diǎn)，可鑒定出5-醛基胞嘧啶的單堿基分辨率序列信息。需要說明的是，在本發(fā)明中，所采用的擴(kuò)增及測(cè)序方法，均為本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)，例如擴(kuò)增可以常用的pcr方法，也可以采用適于單細(xì)胞的malbac(multipleannealingandloopingbasedamplificationcycles，多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù))或scrrbs(single-cellreducedrepresentativebisulfitesequencing，單細(xì)胞簡(jiǎn)化代表亞硫酸氫鹽測(cè)序)擴(kuò)增技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。而測(cè)序則可以采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)來進(jìn)行。例如可以采用：1)第一代雙脫氧堿基法測(cè)序，可利用商業(yè)化測(cè)序平臺(tái)包括abi公司一代測(cè)序平臺(tái)系列儀器；2)第二代高通量測(cè)序技術(shù)，可利用的商業(yè)化測(cè)序平臺(tái)包括：illumina公司系列測(cè)序平臺(tái)，包括但不限于miseq，hiseq2000，hiseq2500，nextseq500，hiseqx等；roche公司焦磷酸測(cè)序法測(cè)序平臺(tái)，如但不限于gsflx；abi公司的solid測(cè)序平臺(tái)，如但不限于solid5500；3)第三代單分子測(cè)序技術(shù)，可利用商業(yè)化測(cè)序平臺(tái)包括：pacificbioscience公司的smrt測(cè)序平臺(tái)，如但不限于smrtrsii；oxfordnanoporetechnologies公司的納米孔單分子測(cè)序平臺(tái)，如mniion平臺(tái)；helicosbiosciences公司的heliscope平臺(tái)。需要說明的是，從細(xì)胞中獲得dna或rna樣品的方法為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，本發(fā)明在此不進(jìn)行詳述。一種具體實(shí)施方案中，所述dna或rna樣品是痕量樣品或從單細(xì)胞獲得的樣品，所述單細(xì)胞來源可以是但不限于胚胎干細(xì)胞、配子、早期胚胎、癌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或血細(xì)胞等?；诒景l(fā)明提供的5-醛基胞嘧啶的單堿基分辨率的測(cè)序方法，本發(fā)明還提供了一種5-醛基胞嘧啶的單堿基分辨率測(cè)序用試劑盒，其包括ph值為7.5-9、優(yōu)選8-9、更優(yōu)選為8的緩沖溶液、丙二腈和擴(kuò)增相關(guān)試劑，所述擴(kuò)增相關(guān)試劑可以理解為：實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增所需要的各種物質(zhì)的和，例如可以包括聚合酶、引物、dntp、緩沖液、水等與dna或rna擴(kuò)增相關(guān)的物質(zhì)，但是不包括擴(kuò)增對(duì)象，例如dna或rna分子；具體物質(zhì)的選擇可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要確定，本發(fā)明在此不進(jìn)行詳述。發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)過程中意外地發(fā)現(xiàn)，在按本發(fā)明提供的方法標(biāo)記5-醛基胞嘧啶后，其標(biāo)記反應(yīng)體系可以直接進(jìn)行擴(kuò)增，標(biāo)記反應(yīng)體系中所剩余的化合物r1-ch2-cn及其它成分不會(huì)影響擴(kuò)增，甚至有利于擴(kuò)增；因此，一個(gè)具體實(shí)施方案中，上述步驟(ii)中標(biāo)記反應(yīng)體系不經(jīng)過純化可直接進(jìn)行擴(kuò)增。由于省去了純化步驟，因此可以有效避免純化步驟中造成的dna或rna損失。因此本發(fā)明的方法適用于dna或rna量很少的樣品，例如來源于單細(xì)胞的dna或rna樣品的檢測(cè)?；诖?，本發(fā)明還提供了一種dna或rna的擴(kuò)增體系，其包含前述5-醛基胞嘧啶的單堿基分辨率的測(cè)序方法中步驟(ii)中反應(yīng)完成后的標(biāo)記反應(yīng)體系。基于本發(fā)明提供的單堿基分辨率的測(cè)序方法，本發(fā)明還提供了一種5-醛基胞嘧啶的定量檢測(cè)方法，其包括以下步驟：(a)將n個(gè)已知的5-醛基胞嘧啶含量不同的模式序列按照前述的測(cè)序方法測(cè)序并確定c-t轉(zhuǎn)換比例，其中n≥2，優(yōu)選n≥3，更優(yōu)選n≥5；所述c-t轉(zhuǎn)換比例為序列中同一位置的堿基標(biāo)記前讀取為胞嘧啶c，標(biāo)記后讀取為胸腺嘧啶t的比例；(b)以5-醛基胞嘧啶含量為橫/縱坐標(biāo)，以c-t轉(zhuǎn)換比例為縱/橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(c)按照前述的測(cè)序方法對(duì)5-醛基胞嘧啶含量未知的dna或rna測(cè)序，并確定c-t轉(zhuǎn)換比例；(d)根據(jù)步驟(c)中確定的c-t轉(zhuǎn)換比例及步驟(b)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定5-醛基胞嘧啶含量未知的dna或rna中的5-醛基胞嘧啶含量。本文中，所述模式序列是一段天然的或人工合成的dna或rna序列，序列中各位點(diǎn)的堿基及其修飾堿基是已知的或預(yù)先設(shè)計(jì)的。一個(gè)具體實(shí)施方案中，5-醛基胞嘧啶含量可以為5-醛基胞嘧啶占所有胞嘧啶的比例，具體可以是百分含量，可以用5fc/c表示；下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。以下實(shí)施例所涉及的模式dna序列如表2所示。表2實(shí)施例1以丙二腈為例，測(cè)定化合物r1-ch2-cn標(biāo)記5-醛基胞嘧啶的特異性使用從glenresearch公司購(gòu)買的亞磷酸酰胺單體以及expetidedna/rna固相合成儀化學(xué)合成含有單個(gè)位點(diǎn)修飾為5fc，5mc，5hmc，5cac，c以及5-醛基尿嘧啶(5fu)的9堿基模式dna序列(oligoidno.1-6)，按照說明進(jìn)行脫保護(hù)并純化，純化后的模式序列使用乙醇沉淀進(jìn)行進(jìn)一步純化。向1.5mleppendorf管中加入4μg純化后的模式序列，再加入100mmtris-hcl(ph8.0)10μl,1.5m丙二腈水溶液10μl，加水補(bǔ)齊使標(biāo)記反應(yīng)體系體積為100μl，標(biāo)記反應(yīng)體系中的丙二腈含量為150mm。反應(yīng)在eppendorfthermomixer中以37℃，850rpm混勻孵育20小時(shí)。反應(yīng)完成后用乙醇沉淀純化經(jīng)標(biāo)記的模式dna序列，并使用bio-radspin-6柱進(jìn)行進(jìn)一步脫鹽純化。使用maldi-tof(abi，7500)對(duì)純化后的dna進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。質(zhì)譜結(jié)果如圖1所示：化合物丙二腈與含有5fc的模式dna序列反應(yīng)后，模式dna的相對(duì)分子質(zhì)量增加了49.0，與計(jì)算值吻合，說明丙二腈能夠與模式dna序列上的5fc發(fā)生反應(yīng)。同時(shí)，化合物丙二腈與含有c，5mc，5hmc，5cac及5fu的模式序列反應(yīng)后，模式dna的相對(duì)分子質(zhì)量沒有發(fā)生變化，說明丙二腈不能與c，5mc，5hmc，5cac及5fu反應(yīng)。以上結(jié)果說明化合物丙二腈能夠特異性的標(biāo)記5fc。對(duì)于其它的化合物r1-ch2-cn，也可以得到同樣的結(jié)論，本發(fā)明在此不進(jìn)行贅述。實(shí)施例2-12丙二腈標(biāo)記含5-醛基胞嘧啶的模式序列并測(cè)序?qū)嵤├?使用從glenresearch公司購(gòu)買的亞磷酸酰胺單體以及expetidedna/rna固相合成儀化學(xué)合成含有單個(gè)位點(diǎn)修飾為5fc的76堿基模式dna序列(oligoidno.7)，按照說明進(jìn)行脫保護(hù)并純化，純化后的模式序列使用乙醇沉淀進(jìn)行進(jìn)一步純化。向1.5mleppendorf管中加入1μg純化后的模式序列，再加入100mmtris-hcl(ph8.0)2μl,1.5m丙二腈水溶液2μl，加水補(bǔ)齊使標(biāo)記反應(yīng)體系體積為20μl，標(biāo)記反應(yīng)體系中的丙二腈含量為150mm。反應(yīng)體系在避光的條件下，在eppendorfthermomixer(恒溫混勻儀)中以37℃，850rpm混勻孵育20小時(shí)。標(biāo)記完成后，向20μl反應(yīng)混合液中直接加入25μl2xmightyampbuffer(takara)并混勻，加入2μl正向及反向引物(引物序列如表3所示)，1μlmightyampdnapolymerase(takara)使體系終體積為50μl并進(jìn)行pcr擴(kuò)增。使用測(cè)序引物(引物序列如表3所示)用sanger測(cè)序檢測(cè)擴(kuò)增出的單一條帶產(chǎn)物。使用snapgene軟件測(cè)量測(cè)序結(jié)果峰圖中對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的c(胞嘧啶)信號(hào)峰高度(hc)及t(胸腺嘧啶)信號(hào)峰高度(ht)，根據(jù)公式hc/[hc+ht]×100％計(jì)算產(chǎn)率；如圖2a所示，從圖2a中可知，hc＝0.16，ht＝25.28，產(chǎn)率＝hc/[hc+ht]×100％＝99.4％。表3實(shí)施例3-12改變tris-hcl緩沖溶液的ph值及標(biāo)記反應(yīng)體系中丙二腈的濃度后，按照實(shí)施例2的方法利用丙二腈標(biāo)記5-醛基胞嘧啶，所改變的具體值及所得到的產(chǎn)率見表4及圖2b。對(duì)比例1-4將緩沖溶液的ph值調(diào)至弱酸性后，按照實(shí)施例2的方法利用丙二腈標(biāo)記5-醛基胞嘧啶，所改變的具體值及所得到的產(chǎn)率見表4及圖2c。表4注：對(duì)比例3中的緩沖溶液為nh4ac緩沖溶液；對(duì)比例4中的緩沖溶液為tris-hcl緩沖溶液。實(shí)施例133-氧代丁腈標(biāo)記含5-醛基胞嘧啶的模式序列并測(cè)序使用從glenresearch公司購(gòu)買的亞磷酸酰胺單體以及expetidedna/rna固相合成儀化學(xué)合成含有單個(gè)位點(diǎn)修飾為5fc的76堿基模式dna序列(oligoidno.7)，按照說明進(jìn)行脫保護(hù)并純化，純化后的模式序列使用乙醇沉淀進(jìn)行進(jìn)一步純化。向1.5mleppendorf管中加入1μg純化后的模式序列，再加入100mmtris-hcl(ph7.5)2μl,1.0m3-氧代丁腈水溶液2μl，加水補(bǔ)齊使標(biāo)記反應(yīng)體系體積為20μl，標(biāo)記反應(yīng)體系中的3-氧代丁腈含量為100mm。反應(yīng)體系在避光的條件下，在eppendorfthermomixer(恒溫混勻儀)中以60℃，850rpm混勻孵育48小時(shí)。標(biāo)記完成后，向20μl反應(yīng)混合液中直接加入25μl2xmightyampbuffer(takara)并混勻，加入2μl正向及反向引物(引物序列如表3所示)，1μlmightyampdnapolymerase(takara)使體系終體積為50μl并進(jìn)行pcr擴(kuò)增。使用測(cè)序引物(引物序列如表3所示)用sanger測(cè)序檢測(cè)擴(kuò)增出的單一條帶產(chǎn)物。使用snapgene軟件測(cè)量測(cè)序結(jié)果峰圖中對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的c(胞嘧啶)信號(hào)峰高度(hc)及t(胸腺嘧啶)信號(hào)峰高度(ht)，根據(jù)公式hc/[hc+ht]×100％計(jì)算產(chǎn)率；如圖2d所示，從圖2d中可知，hc＝0.41，ht＝25.12，產(chǎn)率＝hc/[hc+ht]＝98.4％。實(shí)施例14將實(shí)施例2中的反應(yīng)溫度調(diào)整為20℃，反應(yīng)時(shí)間調(diào)整為48小時(shí)后，按照實(shí)施例2的方法利用丙二腈標(biāo)記5-醛基胞嘧啶，所得到的產(chǎn)率為：98.7％實(shí)施例15將實(shí)施例2中的反應(yīng)溫度調(diào)整為60℃，反應(yīng)時(shí)間調(diào)整為12小時(shí)后，按照實(shí)施例2的方法利用丙二腈標(biāo)記5-醛基胞嘧啶，所得到的產(chǎn)率為：99.0％。實(shí)施例16以丙二腈為例，測(cè)定化合物r1-ch2-cn標(biāo)記后的反應(yīng)體系不純化有利于dna擴(kuò)增使用從glenresearch公司購(gòu)買的亞磷酸酰胺單體以及expetidedna/rna固相合成儀化學(xué)合成含有單個(gè)位點(diǎn)修飾為5fc的76mer模式dna序列(oligoidno.7)，按照說明進(jìn)行脫保護(hù)并純化，純化后的模式序列使用乙醇沉淀進(jìn)行進(jìn)一步純化。向1.5mleppendorf管中加入20ng純化后的模式序列，再加入100mmtris-hcl(ph8.0)4μl,1.5m丙二腈水溶液4μl，加水補(bǔ)齊使標(biāo)記反應(yīng)體系體積為40μl，標(biāo)記反應(yīng)體系中的丙二腈含量為150mm。反應(yīng)體系在避光的條件下，在eppendorfthermomixer中以37℃，850rpm混勻孵育20小時(shí)。標(biāo)記完成后，取出一半反應(yīng)液(20μl)使用vistechdna純化回收試劑盒進(jìn)行純化，作為純化后樣品組。剩余的另一半反應(yīng)液作為純化前組。向純化前及純化后組里加入25μl2xmightyampbuffer(takara)并混勻，加入2μl正向及反向引物(引物序列如表3所示)，1μlmightyampdnapolymerase(takara)使體系終體積為50μl并進(jìn)行擴(kuò)增。每當(dāng)完成1、3、5、7、9、11及13各擴(kuò)增循環(huán)后暫停擴(kuò)增，混勻后取出2.5μl擴(kuò)增樣品保留，并繼續(xù)擴(kuò)增直至15個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。凝膠電泳分析經(jīng)過不同循環(huán)數(shù)擴(kuò)增后的樣品的相對(duì)含量；結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，純化前及純化后組的擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)含量均增高。純化前組進(jìn)行5循環(huán)擴(kuò)增后已經(jīng)可以明顯看到擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，而純化后組進(jìn)行5循環(huán)擴(kuò)增后無可見擴(kuò)增產(chǎn)物條帶；在進(jìn)行到15循環(huán)擴(kuò)增后，純化前組的擴(kuò)增產(chǎn)物量明顯高于純化后組。以上結(jié)果說明丙二腈標(biāo)記體系無需進(jìn)行純化即可進(jìn)行擴(kuò)增，相比較純化后的對(duì)照組可以使用更少的循環(huán)數(shù)擴(kuò)增出所需產(chǎn)物，也可以使用相同擴(kuò)增循環(huán)數(shù)擴(kuò)增出更多的所需產(chǎn)物。因此不需要純化的丙二腈標(biāo)記反應(yīng)更有利于dna的擴(kuò)增。對(duì)于其它的化合物r1-ch2-cn，也可以得到同樣的結(jié)論，本發(fā)明在此不進(jìn)行贅述。實(shí)施例17以丙二腈為例，測(cè)定化合物r1-ch2-cn標(biāo)記反應(yīng)不會(huì)降解dna向1.5mleppendorf管中加入1μg經(jīng)乙醇沉淀純化后的模式序列(oligoidno.7)，再加入100mmtris-hcl(ph8.0)5μl,1.5m丙二腈水溶液5μl，用水補(bǔ)齊使標(biāo)記反應(yīng)體系體積為50μl，標(biāo)記反應(yīng)體系中的丙二腈含量為150mm；作為丙二腈處理組。向1.5mleppendorf管中加入1μg乙醇沉淀純化后的模式序列(oligoidno.7)，10mmtris-hcl(ph8.0)，終體積50μl，作為未處理組。反應(yīng)體系在避光的條件下在eppendorfthermomixer中以37℃，850rpm混勻孵育0、12，20及36小時(shí)。取出5μl反應(yīng)后的樣品通過凝膠電泳進(jìn)行相對(duì)含量的測(cè)定，結(jié)果如圖4a所示。未進(jìn)行孵育的dna作為對(duì)照組，從圖4a中可以看出，處理組與未處理組在0、12、20及36小時(shí)后均具有與對(duì)照組同樣的條帶大小及濃度，同時(shí)沒有觀察到小片段的產(chǎn)生(圖4a)。向1.5mleppendorf管中加入1μg小鼠胚胎干細(xì)胞基因組dna，10mmtris-hcl(ph8.0)以及150mm丙二腈，反應(yīng)體系終體積為50μl，作為丙二腈處理組。向1.5mleppendorf管中加入1μg小鼠胚胎干細(xì)胞基因組dna，10mmtris-hcl(ph8.0)，終體積50μl，作為對(duì)照組。反應(yīng)體系在避光的條件下在eppendorfthermomixer中以37℃，850rpm混勻孵育0、12，20及36小時(shí)。孵育完成后，加入1μg糖原(invitrogen)，5μl醋酸鈉(ph5.4)及168μl冰上預(yù)冷的無水乙醇進(jìn)行乙醇沉淀純化。純化后使用nanodrop測(cè)量并計(jì)算基因組dna的回收率，結(jié)果如圖4b所示。從圖4b中可以看出，處理組與對(duì)照組在進(jìn)行0、12、20及36小時(shí)孵育后均具有基本一致的基因組dna回收率，說明丙二腈處理不會(huì)造成基因組dna的損失。對(duì)于其它的化合物r1-ch2-cn，也可以得到同樣的結(jié)論，本發(fā)明在此不進(jìn)行贅述。實(shí)施例18丙二腈標(biāo)記5-醛基胞嘧啶對(duì)接malbac單細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞單堿基分辨率全基因組5fc的檢測(cè)在顯微鏡下，挑起一個(gè)小鼠胚胎干細(xì)胞并移至4μl裂解液(20mmtris,ph8.0,2mmedta,20mmkcl,0.3％triton-x100)中，向裂解液中加入20單位蛋白酶，并在50℃孵育3小時(shí)以裂解細(xì)胞。向5μl的單細(xì)胞裂解液中加入0.5μl1.5m化合物丙二腈，再加入15μl礦物油液封。反應(yīng)體系在避光的條件下37℃，850rpm搖晃(eppendorf，thermomixer)孵育20小時(shí)以標(biāo)記單細(xì)胞基因組中的5-醛基胞嘧啶。標(biāo)記后的dna可以使用malbac單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增(引物序列如表5所示)：對(duì)于標(biāo)記后的單細(xì)胞裂解液，需要進(jìn)行11輪預(yù)擴(kuò)增以及15輪指數(shù)擴(kuò)增，可以獲得500ng到1μg的擴(kuò)增產(chǎn)物。在擴(kuò)增過程中，被標(biāo)記的5-醛基胞嘧啶會(huì)被讀取為胸腺嘧啶t，因此可以用于單堿基分辨率的5-醛基胞嘧啶檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物使用nebnextultradnalibraryprepkit試劑盒進(jìn)行建庫并使用illuminahiseq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與參考基因組(從ucsc基因組瀏覽器(ucscgenomebrowser)或genbank獲得)進(jìn)行比較，部分比較結(jié)果如圖5所示，從圖5中可以看出，不含5fc的位點(diǎn)與參考基因組完全匹配；含有5fc的位點(diǎn)相比參考基因組發(fā)生轉(zhuǎn)換，即在參考基因組中顯示為c，在測(cè)序所得數(shù)據(jù)中顯示為t。該結(jié)果表明這一位點(diǎn)為5fc。此外，由于參考基因組中也標(biāo)明了基因的位置，因此5fc在基因組上的具體位置也同時(shí)獲得。圖5中，5fc信號(hào)圖中每一條黑色豎線代表一個(gè)檢測(cè)到的5fc位點(diǎn)；對(duì)于magi2基因(起始位點(diǎn)以倒三角標(biāo)注)，在其左側(cè)的啟動(dòng)子區(qū)域(圖中magi2基因的左側(cè)方框)內(nèi)，含有一個(gè)5fc位點(diǎn)。表5實(shí)施例19丙二腈標(biāo)記5-醛基胞嘧啶與scrrbs技術(shù)結(jié)合實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞單堿基分辨率的簡(jiǎn)化表達(dá)5fc檢測(cè)在顯微鏡下，挑起一個(gè)小鼠胚胎干細(xì)胞并移至4μl裂解液中(20mmtris,ph8.0,2mmedta,20mmkcl,0.3％triton-x100)，向裂解液中加入20單位蛋白酶，并在50℃孵育3小時(shí)以裂解細(xì)胞。向單細(xì)胞裂解液中加入9udpnii(neb)，并37℃孵育3小時(shí)。加入5uklenowpolymerase(3’-5’exo-,fermentas)，37℃孵育30分鐘，65℃孵育20分鐘失活。加入接頭序列及接頭序列互補(bǔ)鏈(序列如表6所示)及30u高濃度t4dna連接酶(fermentas)，10℃連接過夜(至少8小時(shí))并60℃孵育30分鐘失活。此時(shí)單細(xì)胞裂解液體系為9μl，加入1μl1.5m化合物丙二腈，再加入15μl礦物油液封。反應(yīng)體系在避光的條件下37℃，850rpm搖晃(eppendorf，thermomixer)孵育20小時(shí)以標(biāo)記單細(xì)胞基因組中的5-醛基胞嘧啶。標(biāo)記后的單細(xì)胞裂解液使用mightyampdna聚合酶(takara)進(jìn)行擴(kuò)增(擴(kuò)增引物如表6所示)：經(jīng)過35輪指數(shù)擴(kuò)增后約可獲得500ng到1μg擴(kuò)增產(chǎn)物。凝膠電泳分離純化合適的片段(～200-700bp)，純化除掉多余的接頭后使用illuminahiseq4000進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與參考基因組(從ucsc基因組瀏覽器(ucscgenomebrowser)或genbank獲得)進(jìn)行比較，結(jié)果與實(shí)施例18相同(如圖5所示)。表6實(shí)施例20在50μl反應(yīng)體系中加入100ng模式序列(模式序列由序列相同含有或不含5fc的序列組成，6組平行的反應(yīng)體系中分別含有0％、20％、40％、60％、80％、100％的含有5-醛基胞嘧啶的序列，序列如表7所示)、1.5m化合物丙二腈水溶液5μl、100mmtris-hcl(ph8.0)5μl，用水補(bǔ)齊至50μl。反應(yīng)體系在避光的條件下，37℃，850rpm搖晃(eppendorf，thermomixer)孵育20小時(shí)以標(biāo)記5-醛基胞嘧啶。標(biāo)記后的單細(xì)胞裂解液使用mightyampdna聚合酶(takara)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物使用nebnextultradnalibraryprepkit試劑盒進(jìn)行建庫并使用illuminahiseq4000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。通過統(tǒng)計(jì)含有不同修飾比例的模式序列中觀察到的c-t轉(zhuǎn)變比例確定標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6所示。在50μl反應(yīng)體系中加入100ng5fc含量為50％的測(cè)試序列(序列為含5fc模式序列與不含5fc模式序列1：1混合，序列如表7所示)、1.5m化合物丙二腈5μl、100mmtris-hcl(ph8.0)5μl，用水補(bǔ)齊至50μl。反應(yīng)體系在避光的條件下37℃，850rpm搖晃(eppendorf，thermomixer)孵育20小時(shí)以標(biāo)記5-醛基胞嘧啶。標(biāo)記后的單細(xì)胞裂解液使用mightyampdna聚合酶(takara)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物使用nebnextultradnalibraryprepkit試劑盒進(jìn)行建庫并使用illuminahiseq4000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與模式序列進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示5fc對(duì)應(yīng)位點(diǎn)t讀數(shù)(nt)與c、t兩種堿基總讀數(shù)(nc+nt)的為：nt/(nc+nt)*100％＝38％，代入圖6中標(biāo)準(zhǔn)曲線中擬合方程：y＝69.5*x+2.468中，其中x為5fc的含量，y為所測(cè)到nt/(nc+nt)值。計(jì)算5fc含量:5fc％＝[nt/(nc+nt)–2.468]/69.5*100％＝(38-2.468)/69.5*100％＝51.1％。表7以上對(duì)本發(fā)明所提供的5-醛基胞嘧啶的標(biāo)記方法及其在單堿基分辨率測(cè)序中的應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)介紹。本文中應(yīng)用了具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其中心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。序列表<110>北京大學(xué)<120>5-醛基胞嘧啶的標(biāo)記方法及其在單堿基分辨率測(cè)序中的應(yīng)用<130>pp179876<160>11<170>patentinversion3.5<210>1<211>76<212>dna<213>人工序列<220><221>5-醛基胞嘧啶<222>(38)..(38)<400>1cctcaccatctcaaccaatattatattacgcgtatatcgcgtatttcgcgttataatatt60gagggagaagtggtga76<210>2<211>27<212>dna<213>人工序列<400>2cctcaccatctcaaccaatattatatt27<210>3<211>80<212>dna<213>人工序列<400>3ctccgacattatcactaccatcaaccacccatcctacctggactacattcttattcagta60ttcaccacttctccctcaat80<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4ctccgacattatcactacca20<210>5<211>35<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(28)..(35)<223>nisa,c,g,ort<400>5gtgagtgatggttgaggtagtgtggagnnnnnnnn35<210>6<211>58<212>dna<213>人工序列<400>6aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58<210>7<211>63<212>dna<213>人工序列<400>7gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacatcacgatctcgtatgccgtcttctgc60ttg63<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8aatgatacggcgaccaccga20<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9caagcagaagacggcatacga21<210>10<211>137<212>dna<213>人工序列<220><221>5-醛基胞嘧啶<222>(38)..(38)<400>10cctcaccatctcaaccaatattatattacgcgtatatcgcgtatttcgcgttataatatt60gagggagaagtggtgaatactgaataagaatgtagtccaggtaggatgggtggttgatgg120tagtgataatgtcggag137<210>11<211>137<212>dna<213>人工序列<400>11cctcaccatctcaaccaatattatattacgcgtatatcgcgtatttcgcgttataatatt60gagggagaagtggtgaatactgaataagaatgtagtccaggtaggatgggtggttgatgg120tagtgataatgtcggag137當(dāng)前第1頁12