具有抗除草劑活性的小麥蛋白質(zhì)、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
本發(fā)明屬于抗除草劑蛋白質(zhì)領(lǐng)域，具體涉及具有抗除草劑活性的小麥蛋白質(zhì)、其編碼基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)俏覈拇笾骷Z作物之一(其他主糧為水稻、玉米、土豆)，產(chǎn)量關(guān)乎國家的穩(wěn)定和安全。但是，雜草與小麥爭光、爭肥、爭水，造成小麥生產(chǎn)減產(chǎn)，甚至絕收。
禾本科雜草，例如節(jié)節(jié)麥、雀麥、野燕麥、早熟禾等與小麥同屬不同種，越年生或一年生，外部形態(tài)無論苗期、成株期都與小麥極為相似，尤其是生長前期難以辨認(rèn)。近年來，由于冬季氣候變暖、少免耕面積擴(kuò)大等原因，小麥田雜草發(fā)生危害加重，對小麥生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，且危害呈擴(kuò)展蔓延之勢。種植抗除草劑小麥可以簡單、經(jīng)濟(jì)、有效地解決小麥田中雜草的危害。
小麥內(nèi)源的抗除草劑乙酰羥基酸合成酶(acetohydroxy acid synthase，簡稱AHAS)蛋白質(zhì)由ahas基因突變產(chǎn)生?？钩輨〢HAS蛋白質(zhì)由ahas基因突變產(chǎn)生，表達(dá)抗除草劑AHAS蛋白質(zhì)可以使植物獲得抗除草劑特性，解決田塊中的雜草問題。AHAS蛋白質(zhì)主要分布在微生物和植物中，在動(dòng)物中幾乎不存在，AHAS抑制除草劑對人畜無害。
但是，小麥?zhǔn)钱愒?倍體植物，基因的同源性和異源性比較復(fù)雜，目前，國內(nèi)外對小麥基因功能的研發(fā)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于水稻、玉米等2倍體植物，其中，小麥內(nèi)源抗除草劑蛋白質(zhì)研究甚少。因此，發(fā)掘和研究具有抗除草劑活性的小麥AHAS蛋白質(zhì)具有良好的創(chuàng)新性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
目前，培育抗AHAS抑制除草劑小麥的方法為以小麥種子或者植株為材料進(jìn)行化學(xué)或者物理誘變，進(jìn)行植物體內(nèi)基因組突變。這種方法獲得抗除草劑玉米的試驗(yàn)時(shí)間長(大于5年)，獲得新突變體難(突變結(jié)果為核苷酸單個(gè)堿基變化引起單個(gè)氨基酸的替換，容易與已經(jīng)存在的突變重復(fù))，而且成功幾率小(通常突變成功率小于百萬分之一)，很多實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行多年的研發(fā)無法獲得新的突變體。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供具有抗除草劑活性的小麥蛋白質(zhì)、其編碼基因及其應(yīng)用，其為抗多類型除草劑活性的小麥AHAS突變體蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有抗咪唑啉酮類、磺酰脲類或者嘧啶類等多類型除草劑的活性，其編碼基因轉(zhuǎn)化的植物具有抗咪唑啉酮類、磺酰脲類或者嘧啶類等多類型除草劑的活性。
與目前通過體內(nèi)突變獲得的氨基酸替換突變體不同，本發(fā)明采用氨基酸刪除策略，通過基因體外突變，改造小麥AHAS蛋白質(zhì)，獲得小麥AHAS突變體蛋白質(zhì)，使其具有抗除草劑活性。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
具有抗除草劑活性的小麥蛋白質(zhì)，其為小麥乙酰羥基酸合成酶的突變體蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示。
本發(fā)明其氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的抗除草劑活性的小麥蛋白質(zhì)為前體全長蛋白質(zhì),該前體全長蛋白質(zhì)刪除信號肽后成為成熟蛋白質(zhì)，對應(yīng)于如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的前體全長蛋白質(zhì)的氨基酸系列，成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.10所示。
具有抗除草劑活性的基因，其為編碼所述具有抗除草劑活性的小麥蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
進(jìn)一步，所述氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的小麥蛋白質(zhì)的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，或者氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的小麥蛋白質(zhì)的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，或者氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的小麥蛋白質(zhì)的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，或者氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的小麥蛋白質(zhì)的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，或者氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的小麥蛋白質(zhì)的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，或者氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的小麥蛋白質(zhì)的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。
本發(fā)明所述具有抗除草劑活性的蛋白質(zhì)用于培育抗咪唑啉酮類、磺酰脲類和嘧啶類除草劑植物。
一種獲得抗咪唑啉酮類、磺酰脲類和嘧啶類除草劑植物的方法，包括，將所述小麥AHAS突變體蛋白質(zhì)的編碼基因轉(zhuǎn)化到植物中，使所述植物產(chǎn)生具有抗除草劑活性的小麥AHAS突變體蛋白質(zhì)。
優(yōu)選地，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示小麥蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示小麥蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示小麥蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，氨基酸序列如SEQ ID No.7所示小麥蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，氨基酸序列如SEQ ID No.8所示小麥蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，氨基酸序列如SEQ ID No.9所示小麥蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。
進(jìn)一步，所述咪唑啉酮類除草劑為咪唑乙煙酸、甲氧咪草煙或者甲基咪草煙，但不限于這幾種咪唑啉酮類除草劑。
又，所述磺酰脲類除草劑為甲嘧磺隆，但不限于這種磺酰脲類除草劑。
優(yōu)選地，所述嘧啶類除草劑為雙草醚，但不限于這種嘧啶類除草劑。
進(jìn)一步，所述植物為小麥、玉米或棉花。
本發(fā)明抗除草劑活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)為小麥6號染色體6A、6B、6D中ahas基因表達(dá)中經(jīng)過人工改造的小麥AHAS突變體蛋白質(zhì)，源于小麥基因組中ahas基因的表達(dá)，將野生型小麥AHAS通過體外突變，獲得小麥AHAS突變體蛋白質(zhì)，其氨基酸序列的特點(diǎn)為：表達(dá)染色體6A突變基因的氨基酸序列與野生型小麥AHAS相比，缺失Trp551位點(diǎn)氨基酸。表達(dá)染色體6B突變基因的氨基酸序列與野生型小麥AHAS相比，缺失Trp550位點(diǎn)氨基酸，表達(dá)染色體6D突變基因氨基酸的序列與野生型小麥AHAS相比，缺失Trp548位點(diǎn)氨基酸，這些突變體蛋白質(zhì)對咪唑啉酮類、磺酰脲類和嘧啶類等多類型除草劑具有抗性。
本發(fā)明中，表達(dá)小麥6號染色體6A突變基因的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；表達(dá)小麥6號染色體6B突變基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示；表達(dá)小麥6號染色體6D突變基因的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。
將本發(fā)明獲得的AHAS突變體編碼基因轉(zhuǎn)化到植物中，在植物中進(jìn)行表達(dá)，使植物中含有AHAS突變體蛋白質(zhì)，可使植物具有抗咪唑啉酮類、磺酰脲類和嘧啶羧酸類等多類型除草劑的活性。
本發(fā)明的AHAS突變體編碼基因的核苷酸序列不限于小麥內(nèi)源序列，包括表達(dá)所述蛋白質(zhì)的人工合成核苷酸序列。
在小麥、玉米或者棉花中表達(dá)AHAS突變體，得到轉(zhuǎn)基因小麥W-WA1M5、W-WA2M5、W-WA3M5，轉(zhuǎn)基因玉米M-WA1M5、M-WA2M5、M-WA3M5、轉(zhuǎn)基因棉花C-WA1M5、C-WA2M5、C-WA3M5，在轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物苗期噴灑抗咪唑啉酮類、磺酰脲類或者嘧啶羧酸類等多類型除草劑，野生型植物植株全部死亡，轉(zhuǎn)基因植物全部存活。說明表達(dá)本發(fā)明小麥AHAS突變體的植物具有抗咪唑啉酮類、磺酰脲類或者嘧啶羧酸類等多類型除草劑活性。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
1)本發(fā)明采用氨基酸刪除策略，對氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，可對刪除氨基酸后的突變體蛋白質(zhì)進(jìn)行體外抗除草劑活性測定，為開發(fā)更多新型抗除草劑AHAS突變體蛋白質(zhì)提供基礎(chǔ)，具有操作簡單，篩選過程簡單、創(chuàng)新性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，發(fā)掘了小麥內(nèi)源抗除草劑基因，增加抗除草劑基因的種類。
2)本發(fā)明的AHAS突變體蛋白質(zhì)是通過體外突變獲得的，體外突變具有可設(shè)計(jì)性強(qiáng)、試驗(yàn)時(shí)間短、創(chuàng)新性強(qiáng)等體內(nèi)突變無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，獲得突變體時(shí)間小于2個(gè)月，同時(shí)，通過特定的突變設(shè)計(jì)，避免與已報(bào)道AHAS突變體蛋白質(zhì)重復(fù)。
3)將本發(fā)明AHSA突變體蛋白質(zhì)的編碼基因表達(dá)后，獲得的AHAS全長突變體蛋白質(zhì)和AHAS無信號肽成熟突變體蛋白質(zhì)均具有抗咪唑啉酮類、磺酰脲類和嘧啶羧酸類等多類型除草劑的活性。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中純化后的AHAS蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖；
其中，泳道1：純化后的WA1M5S蛋白質(zhì)；泳道2：純化后的WA2M5S蛋白質(zhì)；泳道3：純化后的WA3M5S蛋白質(zhì)；泳道4：純化后的WA1WS蛋白質(zhì)；泳道5：純化后的WA2WS蛋白質(zhì)；泳道6：純化后的WA3WS蛋白質(zhì)；Mk：蛋白質(zhì)Marker，分子量已在圖上標(biāo)出。
圖2-圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中WA1M5S、WA2M5S、WA3M5S及其對照WA1WS、WA2WS、WA3WS對咪唑啉酮類除草劑(咪唑乙煙酸和甲氧咪草煙)的抗性曲線圖。
圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中WA1M5S、WA2M5S、WA3M5S及其對照WA1WS、WA2WS、WA3WS對嘧啶羧酸類除草劑(雙草醚)的抗性曲線圖。
圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中WA1M5S、WA2M5S、WA3M5S及其對照WA1WS、WA2WS、WA3WS對磺酰脲類除草劑(甲嘧磺隆)的抗性曲線圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
以下實(shí)施例中，如無特殊說明為《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，2002年)所記載方法。
引物合成和測序委托生工上海生物工程股份有限公司進(jìn)行，試劑、菌株、載體等實(shí)驗(yàn)用品從杭州西格瑪生物技術(shù)公司購買。
咪唑煙乙酸除草劑為山東先達(dá)公司的“豆說好”，稀釋濃度為稀釋200倍。甲基咪草煙除草劑為德國巴斯夫公司的“百壟通”，稀釋濃度為稀釋1000倍。甲氧咪草煙除草劑為美國氰胺公司的“金豆”，稀釋濃度為稀釋100倍。甲嘧磺隆除草劑為江蘇瑞邦農(nóng)藥廠的“森草凈”，稀釋濃度為稀釋5000倍。雙草醚除草劑為江蘇省激素研究所股份有限公司的“雙草醚”，稀釋濃度為稀釋1000倍。
實(shí)施例1獲得小麥6號染色體中刪除Trp551(6A)/Trp550(6B)/Trp548(6D)AHAS突變體蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟：
1.構(gòu)建刪除Trp551(6A)/Trp550(6B)/Trp548(6D)基酸的小麥ahas基因
1.1構(gòu)建刪除Trp551(6A)氨基酸的小麥ahas1基因
(1)通過多聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法，從小麥基因組中擴(kuò)增出AHAS1所在的DNA片段A6A(公共數(shù)據(jù)庫NCBI序列號：TGACv1 473240_6AL中3996-7551)，通過瓊脂糖電泳分離、純化出PCR產(chǎn)物，即A6A。
其中，進(jìn)行PCR反應(yīng)使用的引物為：
CH6AL-F：5’tttgtgtcgttttatactggtatag；
CH6AL-R：5’atcggtgtgacttagaatcggggtc。
PCR反應(yīng)體系為：2×高保真聚合酶預(yù)混液50μl、引物CH6AL-F(10μM)4μl、引物CH6AL-R(10μM)4μl、野生型小麥基因組DNA1μl和去離子水41μl，總體積為100μl。
PCR程序：a)95℃，10分鐘；b)95℃，40秒；c)52℃，40秒；d)68℃，2分鐘；e)循環(huán)步驟2-4，25次；f)68℃，10分鐘；g)16℃，保存。
以A6A為模板，使用引物6AL F和TA A1EcoR，擴(kuò)增出ahas1基因wa1w(NCBI序列號：TGACv1 473240_6AL中4575-6520)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T克隆(pGEMT，美國Promega公司)，獲得T-WA1W。
其中，PCR反應(yīng)體系和程序中，除模板和引物外，其它條件同上。
引物的具體序列為：
6AL F：5’ccatggccgccgccacctcccccgc；
TA A1EcoR：5’gaattctcagtacgaggtcctgccatcaccc。
(2)以T-WA1W為模板，使用引物6AL 551WF和6AL 551WR，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T克隆，獲得刪除Trp551(6A)氨基酸的突變體克隆T-WA1M5。
其中，PCR反應(yīng)體系和程序中，除模板和引物外其它條件與步驟(1)相同。
引物的具體序列為：
6AL 551WF：5’catctgggaatggtggtgcaagaggataggttttacaaggcc；
6AL 551WR：5’ggccttgtaaaacctatcctcttgcaccaccattcccagatg。
其中，WA1M5的DNA序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
1.2構(gòu)建刪除Trp550(6B)氨基酸的小麥ahas2基因
使用與上述1.1構(gòu)建刪除Trp551(6A)氨基酸的小麥ahas1基因中步驟相同的PCR方法，使用引物CH6BL-F和CH6BL-R從小麥基因組中擴(kuò)增出ahas2所在的DNA片段B6A(NCBI序列號：TGACv1 500462_6BL中40831-44374)，再以B6A為模板，使用引物6BL F和TA A1EcoR，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出ahas2基因wa2w(NCBI序列號：TGACv1 500462中42182-44124)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T克隆，獲得T-WA2W，再以T-WA2W為模板，使用引物6BL 550WF和6BL 550WR，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T克隆，獲得刪除Trp550(6B)氨基酸的突變體克隆T-WA2M5，其中，WA2M5的DNA序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中，擴(kuò)增B6A時(shí)，使用的引物CH6BL-F和CH6BL-R的具體序列如下：
CH6BL-F：5’ccacaaccgcgagtggaaatacc；
CH6BL-R：5’catgaagcaggaaaaagggat。
其中，擴(kuò)增ahas2基因wa2w時(shí)，使用的引物6BL F具體序列如下：
6BL F:5’ccatggccgcagccacctcccccgc；
其中，擴(kuò)增刪除Trp550氨基酸的突變體WA2M5時(shí)，使用的引物6BL 550WF和6BL 550WR具體序列如下：
6BL 550WF：5’catctgggaatggtggtgcaggaggataggttttacaaggcc；
6BL 550WR：5’ggccttgtaaaacctatcctcctgcaccaccattcccagatg。
1.3構(gòu)建刪除Trp548(6D)氨基酸的小麥ahas3基因
使用與上述步驟1.1構(gòu)建刪除Trp551(6A)氨基酸的小麥ahas1基因中相同的PCR方法，使用引物CH6DL-F和CH6DL-R，從小麥基因組中擴(kuò)增出ahas3所在的DNA片段D6A(NCBI序列號：TGACv1 527727_6DL中28689-32840)，D6A為模板，使用引物6AL F和TA A1EcoR(參見本實(shí)施例1.1中步驟(1))，擴(kuò)增出ahas3基因wa3w(NCBI序列號：TGACv1 527727_6DL中29526-31462)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T克隆，獲得T-WA3W，再以T-WA3W為模板，使用引物6AL 551WF和6AL 551WR(具體序列參見本實(shí)施例中1.1步驟(2))，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T克隆，獲得刪除Trp548氨基酸的突變體克隆T-WA3M5，其中，WA3M5的DNA序列如SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
其中，擴(kuò)增DNA片段D6A時(shí)，所用的引物CH6DL-F和CH6DL-R的具體序列為：
CH6DL-F：5’gtgtaaaagtagacatgtgtt；
CH6DL-R：5’tgcgaccccccacaacacccg。
2.表達(dá)、純化刪除信號肽的小麥AHAS成熟蛋白質(zhì)
(1)以上述步驟1.1中獲得的T-WA1W為模板，使用引物6AL BamF和TA A1EcoR，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T克隆，獲得刪除信號肽的wa1w基因克隆T-MA1WS。
其中，PCR反應(yīng)體系和程序中，除模板和引物外其它條件同上，引物6AL BamF：的具體序列為：
6AL BamF：5’ggatccacaatgctccggccctggggcccgtccgag；
(2)構(gòu)建蛋白質(zhì)表達(dá)載體，將WA1WS克隆入pGEX4T2，獲得表達(dá)無信號肽AHAS野生型蛋白質(zhì)的載體4T2-WA1WS。
(3)將表達(dá)無信號肽AHAS野生型蛋白質(zhì)的載體4T2-WA1WS轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株Rosetta中，培養(yǎng)、收獲細(xì)胞，超聲波破碎細(xì)胞，將離心獲得上清液通過GST柱，清洗GST柱，洗脫，最終獲得成熟的野生型蛋白質(zhì)WA1WS。
用與上述步驟2(1)-2(3)相同的方法，分別以上述步驟1中獲得的T-WA2W、T-WA3W、T-WA1M5、T-WA2M5以及T-WA3M5為模板，使用相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T克隆，構(gòu)建蛋白質(zhì)表達(dá)載體，分別獲得無信號肽的表達(dá)成熟AHAS野生型蛋白質(zhì)載體4T2-WA2WS和4T2-WA3WS、無信號肽且刪除Trp551(6A)氨基酸的表達(dá)成熟AHAS突變體蛋白質(zhì)載體4T2-WA1M5S、無信號肽且刪除Trp550(6B)氨基酸的表達(dá)成熟AHAS突變體蛋白質(zhì)載體4T2-WA2M5S以及無信號肽且刪除Trp548(6D)氨基酸的表達(dá)成熟AHAS突變體蛋白質(zhì)載體4T2-WA3M5S，再將上述表達(dá)載體分別通過表達(dá)菌株Rosetta進(jìn)行表達(dá)，獲得對應(yīng)的無信號肽的成熟野生型蛋白質(zhì)WA2WS和WA3WS、無信號肽而且刪除Trp551氨基酸的成熟AHAS突變體蛋白WA1M5S，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，DNA序列如SEQ ID NO.10所示、無信號肽而且刪除Trp550氨基酸的成熟AHAS突變體蛋白WA2M5S，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，DNA序列如SEQ ID NO.11所示、無信號肽而且刪除Trp548氨基酸的成熟AHAS突變體蛋白WA3M5S，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，DNA序列如SEQ ID NO.12所示。
其中，以T-WA2W為模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，使用的引物為6BL BamF和TA A1EcoR，引物6BL BamF的具體序列為：
6BL BamF：5’ggatccacaatgctccggccgtggggcccctccgag；
以T-WA3W為模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，使用的引物為6AL BamF和TA A1EcoR。
以T-WA1M5為模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，使用的引物為6AL BamF和TA A1EcoR。
以T-WA2M5為模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，使用的引物為6BL BamF和TA A1EcoR。
以T-WA3M5為模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，使用的引物為6AL BamF和TA A1EcoR。
將獲得的野生型蛋白質(zhì)WA1WS、WA2WS和WA3WS，以及突變體蛋白質(zhì)WA1M5S、WA2M5S和WA3M5S，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，獲得蛋白質(zhì)膠，蛋白質(zhì)膠參見圖1。
由圖1可見，泳道1至泳道6中的AHAS蛋白質(zhì)在90kDa位置具有明顯條帶，此位置與蛋白質(zhì)理論大小相符。此外，該蛋白質(zhì)條帶在整個(gè)泳道的蛋白質(zhì)條帶中占主要比例，說明通過步驟2獲得了高純度的AHAS蛋白質(zhì)。
實(shí)施例2檢測AHAS突變體蛋白質(zhì)對除草劑的抗性
分別以實(shí)施例1獲得的小麥AHAS變體蛋白質(zhì)WA1M5S、WA2M5S和WA3M5S，以及AHAS野生型蛋白質(zhì)WA1WS、WA2WS和WA3WS為檢測主體，水為空白對照處理，以濃度在0-100μM的不同品種除草劑(咪唑煙乙酸、甲氧咪草煙、甲嘧磺隆、雙草醚)為影響因素，進(jìn)行抗除草劑生物測定。
在2ml離心管中配置溶液反應(yīng)體系：450μl測定緩沖液，10μl AHAS蛋白質(zhì)(WA1M5S、WA2M5S、WA3M5S、WA1WS、WA2WS或WA3WS，0.5μg/μl)，40μl影響因素溶液(水為空白對照處理，除草劑為影響因素)，總體積500μl。
AHAS活性測定緩沖液：100mM丙酮酸鈉，10mM氯化鎂，1mM TPP，50μM FAD，50mM磷酸鹽，pH7.4。
反應(yīng)程序：將含有不同影響因素反應(yīng)體系的離心管置于37℃反應(yīng)1小時(shí)；20μl30％硫酸終止反應(yīng)。60℃反應(yīng)0.5小時(shí)；加入250μl 1.7％α-萘酚，0.17％肌酸，60℃顯色0.5小時(shí)。從離心管中取出200μl，檢測含有不同影響因素的溶液在525nm吸光度值。
檢測結(jié)果：以除草劑濃度為0(影響因素溶液為水對照)的野生型蛋白質(zhì)WA1WS處理的525nm吸光度值為100％活性，計(jì)算野生型和突變體蛋白質(zhì)在不同影響因素條件下的活性比例，繪制曲線圖，結(jié)果參見圖2-圖5。
由圖2-圖5可見，隨著咪唑啉酮類、磺酰脲類或者嘧啶羧酸類等多類型除草劑的增加，WA1WS、WA2WS、WA3WS活性降低至0；而WA1M5S、WA2M5S、WA3M5S活性在高濃度除草劑中依然保持接近100％活性。因此，WA1M5S、WA2M5S、WA3M5S對咪唑啉酮類、磺酰脲類或者嘧啶羧酸類等多類型除草劑具有抗性。
實(shí)施例3小麥ahas突變體基因在植物中的轉(zhuǎn)化及表達(dá)
為了在單子葉及雙子葉植物中表達(dá)AHAS突變體蛋白質(zhì)，以pCambia 1300載體(簡稱1300)為載體，用辣椒斑駁病毒35S(簡稱35S)啟動(dòng)子和終止子構(gòu)建AHAS表達(dá)元件，35S啟動(dòng)子和終止子DNA序列見http://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/plant_vectors/pCAMBIA1300/，具體步驟如下：
(1)以實(shí)施例1中獲得的刪除Trp551氨基酸的突變體克隆T-WA1M5為模板，使用引物6AL BamF和TA A1Sac(引物系列如實(shí)施例1所示)，通過PCR和BamH1/Sac1雙酶切，獲得ahas突變體片段WA1M5T。
(2)以1300載體為模板，使用引物35S-Hind和35S-Bam，通過PCR和BamH1/Hind3雙酶切，獲得啟動(dòng)子片段35S；
其中，引物序列為：
35S-Hind：5’gcgaagcttcatggagtcaaagattcaaa；
35S-Bam：5’gtgggatccagtcccccgtgttctctccaaatgaa。
(3)以1300載體為模板，使用引物ter-Sac和ter-Kpn，通過PCR和BamH1/Hind3雙酶切，獲得終止子片段ter；
其中，引物序列為：
ter-Sac：5’gtggagctcagtagatgccgaccggatctgt；
ter-Kpn：5’cagggtacccgccgaattaattcggggga。
(4)將1300進(jìn)行HindIII/SacI雙酶切，獲得片段1300HS，與35S和WA1M5T進(jìn)行連接、克隆，獲得1300-35S-WA1M5。
(5)將1300-35S-WA1M5進(jìn)行SacI/KpnI雙酶切，與ter連接、克隆，獲得表達(dá)AHAS突變體的載體1300-WA1M5。
用與上述步驟(1)-(5)同樣的方法，以刪除Trp550氨基酸的突變體克隆T-WA2M5為模板，獲得表達(dá)AHAS突變體的載體1300-WA2M5。其中，步驟(1)中使用的引物為6BL BamF和TA A1Sac(引物系列如實(shí)施例1所示)。
用與上述步驟(1)-(5)同樣的方法，以刪除Trp548氨基酸的突變體克隆T-WA3M5為模板，獲得表達(dá)AHAS突變體的載體1300-WA3M5，其中，步驟(1)中使用的引物與步驟(1)相同，為6AL BamF和TA A1Sac。
(6)將表達(dá)AHAS突變體的載體1300-WA1M5、1300-WA2M5和1300-WA3M5分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4044中，獲得表達(dá)AHAS突變體蛋白質(zhì)的植物轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。
2.獲得表達(dá)AHAS突變體蛋白質(zhì)的植物
轉(zhuǎn)基因植物的獲得方法為現(xiàn)有成熟技術(shù)，轉(zhuǎn)基因植物制備委托上海博祈生物科技有限公司進(jìn)行。
使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將載體1300-WA1M5、1300-WA2M5、1300-WA3M5分別轉(zhuǎn)入小麥、玉米和棉花中，獲得轉(zhuǎn)基因小麥W-WA1M5、W-WA2M5、W-WA3M5，轉(zhuǎn)基因玉米M-WA1M5、M-WA2M5、M-WA3M5、轉(zhuǎn)基因棉花C-WA1M5、C-WA2M5、C-WA3M5。
在獲得的轉(zhuǎn)基因植物：轉(zhuǎn)基因小麥W-WA1M5、W-WA2M5、W-WA3M5，轉(zhuǎn)基因玉米M-WA1M5、M-WA2M5、M-WA3M5、轉(zhuǎn)基因棉花C-WA1M5、C-WA2M5、C-WA3M5和對應(yīng)野生型植物的苗期噴除草劑，十天后，統(tǒng)計(jì)死亡率，結(jié)果參見表1。
表1
由表1可知，野生型植物植株全部死亡，而轉(zhuǎn)基因植物全部存活，說明表達(dá)本發(fā)明AHAS突變體蛋白質(zhì)的植物具有抗咪唑啉酮類、磺酰脲類或者嘧啶羧酸類等多類型除草劑活性。
<110> 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
<120> 具有抗除草劑活性的小麥蛋白質(zhì)、其編碼基因及應(yīng)用
<130> 1711035
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> SEQ ID NO.1
<211> 646
<212> PRT
<213> 小麥（Triticum aestivum）
<400> 1
Met Ala Ala Ala Thr Ser Pro Ala Val Ala Phe Ser Gly Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Met Pro Lys Pro Ala Arg Gln Pro Leu Pro Arg His
20 25 30
Gln Pro Ala Ser Arg Arg Ala Leu Pro Ala Arg Val Val Arg Cys Cys
35 40 45
Ala Ala Pro Pro Ala Ala Ala Thr Ser Ala Ala Pro Pro Ala Thr Ala
50 55 60
Leu Arg Pro Trp Gly Pro Ser Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu
65 70 75 80
Val Glu Ala Leu Glu Arg Cys Gly Ile Val Asp Val Phe Ala Tyr Pro
85 90 95
Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val
100 105 110
Ile Thr Asn His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala
115 120 125
Ser Gly Tyr Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr
130 135 140
Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu
145 150 155 160
Leu Asp Ser Ile Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg
165 170 175
Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr
180 185 190
Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile
195 200 205
Pro Arg Val Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro
210 215 220
Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala
225 230 235 240
Val Pro Ile Trp Asp Thr Pro Met Ser Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg
245 250 255
Leu Pro Lys Pro Pro Ser Thr Glu Ser Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu
260 265 270
Val Gly Glu Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ala
275 280 285
Ala Ser Gly Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro
290 295 300
Val Thr Thr Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro
305 310 315 320
Leu Ser Leu Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr
325 330 335
Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp
340 345 350
Asp Arg Val Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ser Lys Ile
355 360 365
Val His Ile Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro
370 375 380
His Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn
385 390 395 400
Ala Leu Leu Asn Gly Ser Lys Ala Gln Gln Gly Leu Asp Phe Gly Pro
405 410 415
Trp His Lys Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Phe
420 425 430
Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu
435 440 445
Asp Glu Leu Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln
450 455 460
His Gln Met Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln
465 470 475 480
Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala
485 490 495
Ala Ala Gly Ala Ala Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile
500 505 510
Asp Gly Asp Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile
515 520 525
Arg Ile Glu Asn Leu Pro Val Lys Val Met Ile Leu Asn Asn Gln His
530 535 540
Leu Gly Met Val Val Gln Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala
545 550 555 560
His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Asn Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp
565 570 575
Phe Val Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Val Pro Ala Val Arg Val Thr
580 585 590
Lys Lys Ser Glu Val Thr Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro
595 600 605
Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu
610 615 620
Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Met Glu Gly
625 630 635 640
Asp Gly Arg Thr Ser Tyr
645
<210> SEQ ID NO.2
<211> 645
<212> PRT
<213> 小麥（Triticum aestivum）
<400> 2
Met Ala Ala Ala Thr Ser Pro Ala Val Ala Phe Ser Gly Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Ile Pro Lys Pro Ala Arg Gln Pro Leu Pro Arg His
20 25 30
Gln Pro Ala Ser Arg Arg Ala Leu Pro Ala Arg Ile Val Arg Cys Cys
35 40 45
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Thr Ser Val Ala Pro Pro Ala Thr Ala Leu
50 55 60
Arg Pro Trp Gly Pro Ser Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val
65 70 75 80
Glu Ala Leu Glu Arg Cys Gly Ile Val Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly
85 90 95
Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile
100 105 110
Thr Asn His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser
115 120 125
Gly Tyr Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser
130 135 140
Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu
145 150 155 160
Asp Ser Ile Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met
165 170 175
Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg
180 185 190
Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro
195 200 205
Arg Val Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly
210 215 220
Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val
225 230 235 240
Pro Val Trp Asp Thr Pro Met Ser Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu
245 250 255
Pro Lys Pro Pro Ser Thr Glu Ser Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val
260 265 270
Gly Glu Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ala Ala
275 280 285
Ser Gly Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val
290 295 300
Thr Thr Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu
305 310 315 320
Ser Leu Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala
325 330 335
Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp
340 345 350
Arg Val Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ser Lys Ile Val
355 360 365
His Ile Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His
370 375 380
Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala
385 390 395 400
Leu Leu Asn Gly Ser Lys Ala Gln Gln Gly Leu Asp Phe Gly Pro Trp
405 410 415
His Lys Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Phe Lys
420 425 430
Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp
435 440 445
Glu Leu Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His
450 455 460
Gln Met Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp
465 470 475 480
Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala
485 490 495
Ala Gly Ala Ala Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp
500 505 510
Gly Asp Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg
515 520 525
Ile Glu Asn Leu Pro Val Lys Val Met Ile Leu Asn Asn Gln His Leu
530 535 540
Gly Met Val Val Gln Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His
545 550 555 560
Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Asn Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe
565 570 575
Val Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Val Pro Ala Val Arg Val Thr Lys
580 585 590
Lys Ser Glu Val Thr Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly
595 600 605
Pro Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro
610 615 620
Met Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Met Glu Gly Asp
625 630 635 640
Gly Arg Thr Ser Tyr
645
<210> SEQ ID NO.3
<211> 643
<212> PRT
<213> 小麥（Triticum aestivum）
<400> 3
Met Ala Ala Ala Thr Ser Pro Ala Val Ala Phe Ser Gly Ala Thr Ala
1 5 10 15
Ala Ala Met Pro Lys Pro Ala Arg His Pro Leu Pro Arg His Gln Pro
20 25 30
Val Ser Arg Arg Ala Leu Pro Ala Arg Val Val Arg Cys Cys Ala Ala
35 40 45
Ser Pro Ala Ala Thr Ser Ala Ala Pro Pro Ala Thr Ala Leu Arg Pro
50 55 60
Trp Gly Pro Ser Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala
65 70 75 80
Leu Glu Arg Cys Gly Ile Val Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala
85 90 95
Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn
100 105 110
His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr
115 120 125
Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro
130 135 140
Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser
145 150 155 160
Ile Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly
165 170 175
Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile
180 185 190
Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val
195 200 205
Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val
210 215 220
Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val
225 230 235 240
Trp Asp Thr Pro Met Ser Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys
245 250 255
Pro Pro Ser Thr Glu Ser Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu
260 265 270
Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ser Gly
275 280 285
Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr
290 295 300
Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu
305 310 315 320
Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp
325 330 335
Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val
340 345 350
Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ser Lys Ile Val His Ile
355 360 365
Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser
370 375 380
Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Asp Leu Leu
385 390 395 400
Asn Gly Ser Lys Ala Gln Gln Gly Leu Asp Phe Gly Pro Trp His Lys
405 410 415
Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Phe Lys Thr Phe
420 425 430
Gly Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu
435 440 445
Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met
450 455 460
Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser
465 470 475 480
Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly
485 490 495
Ala Ala Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp
500 505 510
Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu
515 520 525
Asn Leu Pro Val Lys Val Met Ile Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met
530 535 540
Val Val Gln Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr
545 550 555 560
Leu Gly Asn Pro Glu Asn Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val Thr
565 570 575
Ile Ala Lys Gly Phe Asn Val Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys Ser
580 585 590
Glu Val Thr Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro Tyr
595 600 605
Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile
610 615 620
Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Met Glu Gly Asp Gly Arg
625 630 635 640
Thr Ser Tyr
<210> SEQ ID NO.4
<211> 1941
<212> DNA
<213> 小麥（Triticum aestivum）
<400> 4
atggccgccg ccacctcccc cgccgtcgca ttctccggcg ccgccgccgc cgccgccgcc 60
atgcccaagc ccgcccgcca gcctctcccg cgccaccagc ccgcctcgcg ccgcgcgctc 120
cccgcccgcg tcgtcaggtg ctgcgccgcg ccccccgctg ctgccacctc cgccgcgccc 180
cccgccaccg cgctccggcc ctggggcccg tccgagcccc gcaagggcgc cgacatcctc 240
gtcgaggcgc tcgagcgctg cggcatcgtc gacgtattcg cctaccccgg cggcgcgtcc 300
atggagatcc accaggcgct gacgcgctcg cccgtcatca ccaaccacct cttccgccac 360
gagcaggggg aggcgttcgc ggcgtccggc tacgcccgcg cgtccggccg cgtcggcgtc 420
tgcgtcgcca cctccggccc gggggccacc aacctcgtct ccgcgctcgc tgacgccctc 480
ctcgactcca tccccatggt cgccatcacg ggccaggtcc cccgccgcat gatcggcacg 540
gacgcgttcc aggagacgcc catagtggag gtcacgcgct ccatcaccaa gcacaactac 600
ctggtccttg acgtggagga tatcccccgc gtcatccagg aagccttctt cctcgcgtcc 660
tctggccgcc cggggccggt gctggttgat atccccaagg atatccagca gcagatggcc 720
gtgcctatct gggacacgcc gatgagtttg ccagggtaca tcgcccgcct gcccaagcca 780
ccatctactg aatcgcttga gcaggtcctg cgtctggttg gcgagtcacg gcgcccaatt 840
ctgtatgttg gtggtggctg cgctgcatct ggcgaggagt tgcgccgctt tgttgagctc 900
actgggattc cagttacaac tactcttatg ggccttggca acttccccag cgacgaccca 960
ctgtctctgc gcatgcttgg gatgcatggc actgtgtatg caaattatgc agtcgataag 1020
gctgacctgt tgcttgcatt tggtgtgcgg tttgatgatc gtgtgactgg gaaaatcgag 1080
gcttttgcaa gcaggtccaa gattgtgcac attgacattg acccagctga gattggcaag 1140
aacaagcagc cacatgtctc catttgtgca gatgttaagc ttgctttaca ggggttgaat 1200
gctctattaa atgggagcaa agcacaacag ggtctggatt ttggtccatg gcacaaggag 1260
ttggatcagc agaagaggga gtttcctcta ggattcaaga cttttggcga ggccatcccg 1320
ccgcaatatg ctatccaggt actggatgag ctgacaaaag gggaggcgat cattgctacc 1380
ggtgttgggc agcaccagat gtgggcggct cagtattaca cttacaagcg gccacggcag 1440
tggctgtctt cgtctggttt gggggcaatg ggatttgggt taccagctgc agctggcgct 1500
gctgtggcca acccaggtgt tacagttgtt gacattgatg gagacggtag tttcctcatg 1560
aacattcagg agttggcatt gatccgtatt gagaacctcc ctgtgaaggt gatgatattg 1620
aacaaccagc atctgggaat ggtggtgcaa gaggataggt tttacaaggc caatcgggcg 1680
cacacatacc ttggcaaccc agaaaatgag agtgagatat atccagattt tgtgacgatt 1740
gctaaaggat tcaacgttcc ggcagttcgt gtgacgaaga agagcgaagt cactgcagca 1800
atcaagaaga tgcttgagac cccagggcca tacttgttgg atatcatcgt cccgcatcag 1860
gagcacgtgc tgcctatgat cccaagcggt ggtgctttca aggacatgat catggagggt 1920
gatggcagga cctcgtactg a 1941
<210> SEQ ID NO.5
<211> 1938
<212> DNA
<213> 小麥（Triticum aestivum）
<400> 5
atggccgcag ccacctcccc cgccgtcgca ttctcgggcg ccgccgccgc cgccgccgcc 60
atacccaaac ccgcccgcca gcctctcccg cgccaccagc ccgcctcgcg ccgcgcgctc 120
cccgcccgca tcgtcaggtg ctgcgccgcg tcccccgccg ccacctccgt cgcgcctccc 180
gccaccgcgc tccggccgtg gggcccctcc gagccccgca agggcgccga catcctcgtc 240
gaggcgctgg agcgctgcgg catcgtcgac gtcttcgcct accctggcgg cgcgtccatg 300
gagatccacc aggcgctgac gcgctcgcca gtcatcacca accacctctt ccgccacgag 360
cagggggagg cgttcgcggc gtccgggtac gcccgcgcgt ccggccgcgt cggcgtctgc 420
gtcgccacct ccggcccggg ggccaccaac ctcgtctccg cgctcgccga cgctctcctc 480
gactccatcc ccatggtcgc catcacgggc caggtccccc gccgcatgat cggcacggat 540
gcgttccagg agacgcccat cgtggaggtc acgcgctcca tcaccaagca caactacctg 600
gtccttgacg tggaggatat cccccgcgtc atccaggaag ccttcttcct cgcatcctct 660
ggccgcccgg ggccggtgct ggttgatatc cccaaggaca tccagcagca gatggctgtg 720
cctgtctggg acacgccgat gagtttgcca gggtacatcg cccgcctgcc caagccacca 780
tctactgaat cgcttgagca ggtcctgcgt ctggttggcg agtcacggcg cccaattctg 840
tatgttggtg gtggctgcgc tgcatctggt gaggagttgc gccgctttgt tgagctcact 900
gggattccag ttacaactac tcttatgggc cttggcaact tccccagtga cgacccactg 960
tctctgcgca tgctggggat gcatggcact gtgtatgcaa attatgcagt agataaggct 1020
gacctgttgc ttgcatttgg tgtgcggttt gatgatcgtg tgaccgggaa aatcgaggct 1080
tttgcaagca ggtccaagat tgtgcacatt gacattgacc cagctgagat tggcaagaac 1140
aagcagccac atgtctccat ttgtgcagat gttaagcttg ctttacaggg gttgaatgct 1200
ctattaaatg ggagcaaagc acaacagggt ctggattttg gtccatggca caaggagttg 1260
gatcagcaga agagggagtt tcctctagga ttcaagactt ttggtgaggc catcccgccg 1320
caatatgcta tccaggtact ggatgagctg acaaaagggg aggcgatcat tgccaccggt 1380
gttgggcagc atcagatgtg ggcggctcag tattacactt acaagcggcc acggcagtgg 1440
ctgtcttcgt ccggtttggg tgcaatggga tttgggttgc cagctgcagc tggcgctgct 1500
gtggccaacc caggtgttac agttgttgac attgatgggg acggtagttt cctcatgaac 1560
attcaggagt tggcgttgat ccgtattgag aacctcccag tgaaggtgat gatattgaac 1620
aaccagcatc tgggaatggt ggtgcaggag gataggtttt acaaggccaa ccgggcgcac 1680
acataccttg gcaacccaga aaatgagagt gagatatatc cagattttgt gacgattgct 1740
aaaggattca acgttccggc agttcgtgtg acgaagaaga gcgaagtcac tgcagcaatc 1800
aagaagatgc ttgagacccc agggccatac ttgttggata tcattgtccc gcatcaggag 1860
cacgtgctgc ctatgatccc aagcggtggt gcttttaagg acatgatcat ggagggtgat 1920
ggcaggacct cgtactga 1938
<210> SEQ ID NO.6
<211> 1932
<212> DNA
<213> 小麥（Triticum aestivum）
<400> 6
atggccgccg ccacctcccc cgccgtcgca ttctcgggcg ccaccgccgc cgccatgccc 60
aaacccgccc gccatcctct cccgcgccac cagcccgtct cgcgccgcgc gctccccgcc 120
cgcgtcgtca ggtgttgcgc cgcgtccccc gccgccacct ccgccgcgcc tcccgcaacc 180
gcgctccggc cctggggccc gtccgagccc cgcaagggcg ccgacatcct cgtcgaggcg 240
ctcgagcgct gcggcatcgt cgacgtcttc gcctaccccg gcggcgcctc catggagatc 300
caccaggcgc tgacgcgctc gcccgtcatc accaaccacc tcttccgcca cgagcagggg 360
gaggcgttcg cggcgtccgg ctacgcccgc gcgtccggcc gcgtcggcgt ctgcgtcgcc 420
acctccggcc cgggggccac caacctcgtc tccgcgctcg ccgacgccct cctcgactcc 480
atccccatgg tcgccatcac gggccaggtc ccccgccgca tgatcggcac ggacgcgttc 540
caggagacgc ccatagtgga ggtcacgcgc tccatcacca agcacaacta cctggtcctt 600
gacgtggagg atatcccccg cgtcatccag gaagccttct tccttgcatc ctctggccgc 660
ccggggccgg tgctagttga tatccccaag gacatccagc agcagatggc tgtgcccgtc 720
tgggacactc caatgagttt gccagggtac atcgcccgcc tgcccaagcc accatctact 780
gaatcgcttg agcaggtcct gcgtctggtt ggcgagtcac ggcgcccaat tctgtatgtt 840
ggtggtggct gcgctgcatc tggcgaggag ttgcgccgct ttgttgagct cactgggatt 900
ccagttacaa ctactcttat gggccttggc aacttcccca gtgacgaccc actgtctctg 960
cgcatgctgg ggatgcatgg cactgtgtat gcaaattatg cagtcgataa ggctgacctg 1020
ttgcttgcat ttggtgtgcg gtttgatgat cgtgtgactg ggaaaatcga ggcttttgca 1080
agcaggtcca agattgtgca cattgacatt gacccagctg agattggcaa gaacaagcag 1140
ccacatgtct ccatttgtgc agatgttaag cttgctttac aggggttgaa tgatctatta 1200
aatgggagca aagcacaaca gggtctggat tttggtccat ggcacaagga gttggatcag 1260
cagaagaggg agtttcctct aggattcaag acttttggcg aggccatccc gccgcaatat 1320
gctatccagg tactggatga gctgacaaaa ggggaggcga tcattgccac cggtgttggg 1380
cagcaccaga tgtgggcggc tcagtattac acttacaagc ggccacggca gtggctgtct 1440
tcgtctggtt tgggggcaat gggatttggg ttaccagctg cagctggcgc tgctgtggcc 1500
aacccaggtg ttacagttgt tgacattgat ggagacggta gtttcctcat gaacattcag 1560
gagttggcat tgatccgtat tgagaacctc ccagtgaagg tgatgatatt gaacaaccag 1620
catctgggaa tggtggtgca ggaggatagg ttttacaagg ccaatcgggc gcacacatac 1680
cttggcaacc cagaaaatga gagtgagata tatccagatt ttgtgacgat tgctaaagga 1740
ttcaacgttc cagcagttcg agtgacgaag aagagcgaag tcactgcagc aatcaagaag 1800
atgcttgaga ccccagggcc atacttgttg gatatcatag tcccgcatca ggagcacgtg 1860
ctgcctatga tcccaagcgg tggtgctttc aaggacatga tcatggaggg tgatggcagg 1920
acctcgtact ga 1932
<210> SEQ ID NO.7
<211> 582
<212> PRT
<213> 小麥（Triticum aestivum）
<400> 7
Leu Arg Pro Trp Gly Pro Ser Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Ala Leu Glu Arg Cys Gly Ile Val Asp Val Phe Ala Tyr Pro
20 25 30
Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val
35 40 45
Ile Thr Asn His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala
50 55 60
Ser Gly Tyr Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr
65 70 75 80
Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu
85 90 95
Leu Asp Ser Ile Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg
100 105 110
Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr
115 120 125
Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile
130 135 140
Pro Arg Val Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro
145 150 155 160
Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala
165 170 175
Val Pro Ile Trp Asp Thr Pro Met Ser Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg
180 185 190
Leu Pro Lys Pro Pro Ser Thr Glu Ser Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu
195 200 205
Val Gly Glu Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ala
210 215 220
Ala Ser Gly Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro
225 230 235 240
Val Thr Thr Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro
245 250 255
Leu Ser Leu Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr
260 265 270
Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp
275 280 285
Asp Arg Val Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ser Lys Ile
290 295 300
Val His Ile Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro
305 310 315 320
His Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn
325 330 335
Ala Leu Leu Asn Gly Ser Lys Ala Gln Gln Gly Leu Asp Phe Gly Pro
340 345 350
Trp His Lys Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Phe
355 360 365
Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu
370 375 380
Asp Glu Leu Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln
385 390 395 400
His Gln Met Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln
405 410 415
Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala
420 425 430
Ala Ala Gly Ala Ala Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile
435 440 445
Asp Gly Asp Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile
450 455 460
Arg Ile Glu Asn Leu Pro Val Lys Val Met Ile Leu Asn Asn Gln His
465 470 475 480
Leu Gly Met Val Val Gln Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala
485 490 495
His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Asn Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp
500 505 510
Phe Val Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Val Pro Ala Val Arg Val Thr
515 520 525
Lys Lys Ser Glu Val Thr Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro
530 535 540
Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu
545 550 555 560
Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Met Glu Gly
565 570 575
Asp Gly Arg Thr Ser Tyr
580
<210> SEQ ID NO.8
<211> 582
<212> PRT
<213> 小麥（Triticum aestivum）
<400> 8
Leu Arg Pro Trp Gly Pro Ser Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Ala Leu Glu Arg Cys Gly Ile Val Asp Val Phe Ala Tyr Pro
20 25 30
Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val
35 40 45
Ile Thr Asn His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala
50 55 60
Ser Gly Tyr Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr
65 70 75 80
Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu
85 90 95
Leu Asp Ser Ile Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg
100 105 110
Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr
115 120 125
Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile
130 135 140
Pro Arg Val Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro
145 150 155 160
Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala
165 170 175
Val Pro Val Trp Asp Thr Pro Met Ser Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg
180 185 190
Leu Pro Lys Pro Pro Ser Thr Glu Ser Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu
195 200 205
Val Gly Glu Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ala
210 215 220
Ala Ser Gly Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro
225 230 235 240
Val Thr Thr Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro
245 250 255
Leu Ser Leu Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr
260 265 270
Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp
275 280 285
Asp Arg Val Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ser Lys Ile
290 295 300
Val His Ile Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro
305 310 315 320
His Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn
325 330 335
Ala Leu Leu Asn Gly Ser Lys Ala Gln Gln Gly Leu Asp Phe Gly Pro
340 345 350
Trp His Lys Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Phe
355 360 365
Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu
370 375 380
Asp Glu Leu Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln
385 390 395 400
His Gln Met Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln
405 410 415
Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala
420 425 430
Ala Ala Gly Ala Ala Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile
435 440 445
Asp Gly Asp Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile
450 455 460
Arg Ile Glu Asn Leu Pro Val Lys Val Met Ile Leu Asn Asn Gln His
465 470 475 480
Leu Gly Met Val Val Gln Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala
485 490 495
His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Asn Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp
500 505 510
Phe Val Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Val Pro Ala Val Arg Val Thr
515 520 525
Lys Lys Ser Glu Val Thr Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro
530 535 540
Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu
545 550 555 560
Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Met Glu Gly
565 570 575
Asp Gly Arg Thr Ser Tyr
580
<210> SEQ ID NO.9
<211> 582
<212> PRT
<213> 小麥（Triticum aestivum）
<400> 9
Leu Arg Pro Trp Gly Pro Ser Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Ala Leu Glu Arg Cys Gly Ile Val Asp Val Phe Ala Tyr Pro
20 25 30
Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val
35 40 45
Ile Thr Asn His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala
50 55 60
Ser Gly Tyr Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr
65 70 75 80
Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu
85 90 95
Leu Asp Ser Ile Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg
100 105 110
Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr
115 120 125
Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile
130 135 140
Pro Arg Val Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro
145 150 155 160
Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala
165 170 175
Val Pro Val Trp Asp Thr Pro Met Ser Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg
180 185 190
Leu Pro Lys Pro Pro Ser Thr Glu Ser Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu
195 200 205
Val Gly Glu Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ala
210 215 220
Ala Ser Gly Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro
225 230 235 240
Val Thr Thr Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro
245 250 255
Leu Ser Leu Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr
260 265 270
Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp
275 280 285
Asp Arg Val Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ser Lys Ile
290 295 300
Val His Ile Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro
305 310 315 320
His Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn
325 330 335
Asp Leu Leu Asn Gly Ser Lys Ala Gln Gln Gly Leu Asp Phe Gly Pro
340 345 350
Trp His Lys Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Phe
355 360 365
Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu
370 375 380
Asp Glu Leu Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln
385 390 395 400
His Gln Met Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln
405 410 415
Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala
420 425 430
Ala Ala Gly Ala Ala Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile
435 440 445
Asp Gly Asp Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile
450 455 460
Arg Ile Glu Asn Leu Pro Val Lys Val Met Ile Leu Asn Asn Gln His
465 470 475 480
Leu Gly Met Val Val Gln Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala
485 490 495
His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Asn Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp
500 505 510
Phe Val Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Val Pro Ala Val Arg Val Thr
515 520 525
Lys Lys Ser Glu Val Thr Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro
530 535 540
Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu
545 550 555 560
Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Met Glu Gly
565 570 575
Asp Gly Arg Thr Ser Tyr
580
<210> SEQ ID NO.10
<211> 1749
<212> DNA
<213> 小麥（Triticum aestivum）
<400> 10
ctccggccct ggggcccgtc cgagccccgc aagggcgccg acatcctcgt cgaggcgctc 60
gagcgctgcg gcatcgtcga cgtattcgcc taccccggcg gcgcgtccat ggagatccac 120
caggcgctga cgcgctcgcc cgtcatcacc aaccacctct tccgccacga gcagggggag 180
gcgttcgcgg cgtccggcta cgcccgcgcg tccggccgcg tcggcgtctg cgtcgccacc 240
tccggcccgg gggccaccaa cctcgtctcc gcgctcgctg acgccctcct cgactccatc 300
cccatggtcg ccatcacggg ccaggtcccc cgccgcatga tcggcacgga cgcgttccag 360
gagacgccca tagtggaggt cacgcgctcc atcaccaagc acaactacct ggtccttgac 420
gtggaggata tcccccgcgt catccaggaa gccttcttcc tcgcgtcctc tggccgcccg 480
gggccggtgc tggttgatat ccccaaggat atccagcagc agatggccgt gcctatctgg 540
gacacgccga tgagtttgcc agggtacatc gcccgcctgc ccaagccacc atctactgaa 600
tcgcttgagc aggtcctgcg tctggttggc gagtcacggc gcccaattct gtatgttggt 660
ggtggctgcg ctgcatctgg cgaggagttg cgccgctttg ttgagctcac tgggattcca 720
gttacaacta ctcttatggg ccttggcaac ttccccagcg acgacccact gtctctgcgc 780
atgcttggga tgcatggcac tgtgtatgca aattatgcag tcgataaggc tgacctgttg 840
cttgcatttg gtgtgcggtt tgatgatcgt gtgactggga aaatcgaggc ttttgcaagc 900
aggtccaaga ttgtgcacat tgacattgac ccagctgaga ttggcaagaa caagcagcca 960
catgtctcca tttgtgcaga tgttaagctt gctttacagg ggttgaatgc tctattaaat 1020
gggagcaaag cacaacaggg tctggatttt ggtccatggc acaaggagtt ggatcagcag 1080
aagagggagt ttcctctagg attcaagact tttggcgagg ccatcccgcc gcaatatgct 1140
atccaggtac tggatgagct gacaaaaggg gaggcgatca ttgctaccgg tgttgggcag 1200
caccagatgt gggcggctca gtattacact tacaagcggc cacggcagtg gctgtcttcg 1260
tctggtttgg gggcaatggg atttgggtta ccagctgcag ctggcgctgc tgtggccaac 1320
ccaggtgtta cagttgttga cattgatgga gacggtagtt tcctcatgaa cattcaggag 1380
ttggcattga tccgtattga gaacctccct gtgaaggtga tgatattgaa caaccagcat 1440
ctgggaatgg tggtgcaaga ggataggttt tacaaggcca atcgggcgca cacatacctt 1500
ggcaacccag aaaatgagag tgagatatat ccagattttg tgacgattgc taaaggattc 1560
aacgttccgg cagttcgtgt gacgaagaag agcgaagtca ctgcagcaat caagaagatg 1620
cttgagaccc cagggccata cttgttggat atcatcgtcc cgcatcagga gcacgtgctg 1680
cctatgatcc caagcggtgg tgctttcaag gacatgatca tggagggtga tggcaggacc 1740
tcgtactga 1749
<210> SEQ ID NO.11
<211> 1749
<212> DNA
<213> 小麥（Triticum aestivum）
<400> 11
ctccggccgt ggggcccctc cgagccccgc aagggcgccg acatcctcgt cgaggcgctg 60
gagcgctgcg gcatcgtcga cgtcttcgcc taccctggcg gcgcgtccat ggagatccac 120
caggcgctga cgcgctcgcc agtcatcacc aaccacctct tccgccacga gcagggggag 180
gcgttcgcgg cgtccgggta cgcccgcgcg tccggccgcg tcggcgtctg cgtcgccacc 240
tccggcccgg gggccaccaa cctcgtctcc gcgctcgccg acgctctcct cgactccatc 300
cccatggtcg ccatcacggg ccaggtcccc cgccgcatga tcggcacgga tgcgttccag 360
gagacgccca tcgtggaggt cacgcgctcc atcaccaagc acaactacct ggtccttgac 420
gtggaggata tcccccgcgt catccaggaa gccttcttcc tcgcatcctc tggccgcccg 480
gggccggtgc tggttgatat ccccaaggac atccagcagc agatggctgt gcctgtctgg 540
gacacgccga tgagtttgcc agggtacatc gcccgcctgc ccaagccacc atctactgaa 600
tcgcttgagc aggtcctgcg tctggttggc gagtcacggc gcccaattct gtatgttggt 660
ggtggctgcg ctgcatctgg tgaggagttg cgccgctttg ttgagctcac tgggattcca 720
gttacaacta ctcttatggg ccttggcaac ttccccagtg acgacccact gtctctgcgc 780
atgctgggga tgcatggcac tgtgtatgca aattatgcag tagataaggc tgacctgttg 840
cttgcatttg gtgtgcggtt tgatgatcgt gtgaccggga aaatcgaggc ttttgcaagc 900
aggtccaaga ttgtgcacat tgacattgac ccagctgaga ttggcaagaa caagcagcca 960
catgtctcca tttgtgcaga tgttaagctt gctttacagg ggttgaatgc tctattaaat 1020
gggagcaaag cacaacaggg tctggatttt ggtccatggc acaaggagtt ggatcagcag 1080
aagagggagt ttcctctagg attcaagact tttggtgagg ccatcccgcc gcaatatgct 1140
atccaggtac tggatgagct gacaaaaggg gaggcgatca ttgccaccgg tgttgggcag 1200
catcagatgt gggcggctca gtattacact tacaagcggc cacggcagtg gctgtcttcg 1260
tccggtttgg gtgcaatggg atttgggttg ccagctgcag ctggcgctgc tgtggccaac 1320
ccaggtgtta cagttgttga cattgatggg gacggtagtt tcctcatgaa cattcaggag 1380
ttggcgttga tccgtattga gaacctccca gtgaaggtga tgatattgaa caaccagcat 1440
ctgggaatgg tggtgcagga ggataggttt tacaaggcca accgggcgca cacatacctt 1500
ggcaacccag aaaatgagag tgagatatat ccagattttg tgacgattgc taaaggattc 1560
aacgttccgg cagttcgtgt gacgaagaag agcgaagtca ctgcagcaat caagaagatg 1620
cttgagaccc cagggccata cttgttggat atcattgtcc cgcatcagga gcacgtgctg 1680
cctatgatcc caagcggtgg tgcttttaag gacatgatca tggagggtga tggcaggacc 1740
tcgtactga 1749
<210> SEQ ID NO.12
<211> 1749
<212> DNA
<213> 小麥（Triticum aestivum）
<400> 12
ctccggccct ggggcccgtc cgagccccgc aagggcgccg acatcctcgt cgaggcgctc 60
gagcgctgcg gcatcgtcga cgtcttcgcc taccccggcg gcgcctccat ggagatccac 120
caggcgctga cgcgctcgcc cgtcatcacc aaccacctct tccgccacga gcagggggag 180
gcgttcgcgg cgtccggcta cgcccgcgcg tccggccgcg tcggcgtctg cgtcgccacc 240
tccggcccgg gggccaccaa cctcgtctcc gcgctcgccg acgccctcct cgactccatc 300
cccatggtcg ccatcacggg ccaggtcccc cgccgcatga tcggcacgga cgcgttccag 360
gagacgccca tagtggaggt cacgcgctcc atcaccaagc acaactacct ggtccttgac 420
gtggaggata tcccccgcgt catccaggaa gccttcttcc ttgcatcctc tggccgcccg 480
gggccggtgc tagttgatat ccccaaggac atccagcagc agatggctgt gcccgtctgg 540
gacactccaa tgagtttgcc agggtacatc gcccgcctgc ccaagccacc atctactgaa 600
tcgcttgagc aggtcctgcg tctggttggc gagtcacggc gcccaattct gtatgttggt 660
ggtggctgcg ctgcatctgg cgaggagttg cgccgctttg ttgagctcac tgggattcca 720
gttacaacta ctcttatggg ccttggcaac ttccccagtg acgacccact gtctctgcgc 780
atgctgggga tgcatggcac tgtgtatgca aattatgcag tcgataaggc tgacctgttg 840
cttgcatttg gtgtgcggtt tgatgatcgt gtgactggga aaatcgaggc ttttgcaagc 900
aggtccaaga ttgtgcacat tgacattgac ccagctgaga ttggcaagaa caagcagcca 960
catgtctcca tttgtgcaga tgttaagctt gctttacagg ggttgaatga tctattaaat 1020
gggagcaaag cacaacaggg tctggatttt ggtccatggc acaaggagtt ggatcagcag 1080
aagagggagt ttcctctagg attcaagact tttggcgagg ccatcccgcc gcaatatgct 1140
atccaggtac tggatgagct gacaaaaggg gaggcgatca ttgccaccgg tgttgggcag 1200
caccagatgt gggcggctca gtattacact tacaagcggc cacggcagtg gctgtcttcg 1260
tctggtttgg gggcaatggg atttgggtta ccagctgcag ctggcgctgc tgtggccaac 1320
ccaggtgtta cagttgttga cattgatgga gacggtagtt tcctcatgaa cattcaggag 1380
ttggcattga tccgtattga gaacctccca gtgaaggtga tgatattgaa caaccagcat 1440
ctgggaatgg tggtgcagga ggataggttt tacaaggcca atcgggcgca cacatacctt 1500
ggcaacccag aaaatgagag tgagatatat ccagattttg tgacgattgc taaaggattc 1560
aacgttccag cagttcgagt gacgaagaag agcgaagtca ctgcagcaat caagaagatg 1620
cttgagaccc cagggccata cttgttggat atcatagtcc cgcatcagga gcacgtgctg 1680
cctatgatcc caagcggtgg tgctttcaag gacatgatca tggagggtga tggcaggacc 1740
tcgtactga 1749
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