本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種多肽化合物分子，及該化合物的制備方法與其在制備用于抑制腫瘤生長(zhǎng)、提升免疫功能、及抑制血管新生的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：生物體的遺傳基因被存儲(chǔ)在多聚脫氧核苷酸鏈上，遺傳基因編碼著執(zhí)行生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)多種多樣，它們行使著各種生物學(xué)功能維持生命活動(dòng)。蛋白質(zhì)的種類(lèi)雖然多不勝舉，但它們基本上都是由20個(gè)自然界存在的天然氨基酸組成。由于氨基酸的組成和排列順序的差異導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的千差萬(wàn)別。一般來(lái)說(shuō)，含有50個(gè)以上氨基酸的分子被稱(chēng)為蛋白質(zhì)，一般超過(guò)10個(gè)氨基酸的肽鏈被稱(chēng)為多肽，少于10個(gè)氨基酸的肽鏈被稱(chēng)做寡肽。目前發(fā)現(xiàn)最小的功能小肽只有2個(gè)氨基酸，通常較為常見(jiàn)的是4個(gè)以上氨基酸的功能小肽。由于人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成和人類(lèi)蛋白組計(jì)劃的開(kāi)展，將會(huì)有越來(lái)越多的蛋白質(zhì)功能片段被發(fā)現(xiàn)并被作為藥物應(yīng)用到生物醫(yī)藥領(lǐng)域中來(lái)。蛋白質(zhì)的功能片段通常是指被發(fā)現(xiàn)具備某種特定生物學(xué)功能的直鏈多肽片段，它們通常是幾十個(gè)至兩個(gè)氨基酸組成的肽類(lèi)片段，被鑒定和發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)功能片段可通過(guò)人工合成的途徑制備。現(xiàn)已開(kāi)發(fā)并在臨床上得到應(yīng)用的多肽藥物有“催產(chǎn)素”、“胸腺肽α1”、“胸腺五肽”等，有在天然肽鏈的基礎(chǔ)上進(jìn)行人工改構(gòu)制備成為用于治療消化道出血和肢端肥大癥的多肽藥物“奧曲肽”和抗凝血作用的“水蛭肽”等。蛋白質(zhì)中的功能片段常常能篩選到含有幾十個(gè)或小到只有二個(gè)氨基酸組成的多肽片段，它們?yōu)槿斯ず铣啥嚯墓δ芷尾⑺鼈兺度霊?yīng)用奠定了基礎(chǔ)。在蛋白質(zhì)、多肽或寡肽中，單一氨基酸的缺失、增加或被替換；氨基端(N端)或羧基端(C端)被封閉；序列中或游離端被添加化學(xué)基團(tuán)都會(huì)使得蛋白質(zhì)、多肽或寡肽原有的生物活性發(fā)生改變。設(shè)計(jì)、篩選和發(fā)現(xiàn)具有新的功能肽段或?qū)ふ腋咝щ亩问撬幬镩_(kāi)發(fā)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，一方面，提供一種多拷貝的多肽化合物，其結(jié)構(gòu)式為：A-(A-K)n-Y，n為自然數(shù)；其中，A為具有生物活性的短肽片段；K為含有兩個(gè)活性氨基的賴(lài)氨酸Fmoc-Lys(Dde)-OH，n為K的數(shù)目，Y為空或任意一個(gè)或多個(gè)氨基酸或化學(xué)基團(tuán)；當(dāng)n＝1時(shí)，多肽化合物當(dāng)A為結(jié)構(gòu)式為A-(A-K)-Y；當(dāng)n＝2時(shí)，多肽化合物當(dāng)A為結(jié)構(gòu)式為A-(A-K)2-Y；當(dāng)n＝3時(shí)，多肽化合物當(dāng)A為結(jié)構(gòu)式為A-(A-K)3-Y；……；A優(yōu)選短肽片段XAXBXCXD-X；當(dāng)A為XAXBXCXD-X時(shí)，多肽化合物結(jié)構(gòu)式為XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)n-Y；其中，XA和XB為脂肪族氨基酸中的一種或兩種，XC和XD選自脂肪族氨基酸和芳香雜環(huán)氨基酸中的一種或兩種，X為空或任意一個(gè)或多個(gè)氨基酸或化學(xué)基團(tuán)。當(dāng)n＝2時(shí)，A為XAXBXCXD-X時(shí)，多肽化合物結(jié)構(gòu)式為XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)2-Y，見(jiàn)式3：當(dāng)n＝4時(shí)，A為XAXBXCXD-X時(shí)，多肽化合物結(jié)構(gòu)式為XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4-Y，見(jiàn)式4：X或Y為空、或任意一種氨基酸，或任意個(gè)氨基酸組成的肽片段，或能將氨基酸或肽片段連接起來(lái)的化學(xué)基團(tuán)，X和Y可相同，可不同；例如X為空，Y為甘氨酸(Gly，G)。XA和XB為脂肪族氨基酸分子，包括：苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、賴(lài)氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)和谷氨酰胺(Gln，Q)中的任意一種，可相同或不同。XC和XD選自苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、賴(lài)氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)、谷氨酰胺(Gln，Q)、色氨酸(Trp,W)、組氨酸(His,H)和脯氨酸(Pro,P)中的任意一種，可相同或不同。還包括所述多肽化合物與有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸形成的鹽類(lèi)化合物。所述的多肽化合物所帶有的羥基可形成但不限于所形成的醚、酯、苷或甙等的化合物。所述的多肽化合物所帶有的巰基可形成但不限于所形成的硫醚、硫苷，或與半胱氨酸或含半胱氨酸的肽所形成的含有二硫鍵的化合物。所述的多肽化合物所帶有的氨基可形成但不限于所形成的?；铩N化物、與糖類(lèi)物質(zhì)所形成的苷類(lèi)物質(zhì)等。所述的多肽化合物所帶有的羧基可形成但不限于所形成的酯、酰胺類(lèi)化合物等。所述的多肽化合物所帶有的亞氨基可形成但不限于所形成的苷、酰化物、烴化物等。所述的多肽化合物所帶有的酚羥基可形成但不限于所形成的酯、醚、苷、甙類(lèi)化合物，與有機(jī)堿或無(wú)機(jī)堿所形成的鹽類(lèi)化合物。所述的多肽化合物與金屬離子所形成的配合物、絡(luò)和物或螯合物。所述的多肽化合物所形成的水合物或溶劑物。第二方面，提供一種藥物組合物，其含有上述的多肽化合物、其幾何異構(gòu)體、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化合物以及可藥用載體或賦形劑的藥物組合物。第三方面，提供制備上述多肽化合物的方法，A-(A-K)n-Y的合成路線見(jiàn)式5，A優(yōu)選短肽片段XAXBXCXD-X；當(dāng)A為XAXBXCXD-X時(shí)，多肽化合物結(jié)構(gòu)式為XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)n-Y；其中，XA和XB為脂肪族氨基酸中的一種或兩種，XC和XD選自脂肪族氨基酸和芳香雜環(huán)氨基酸中的一種或兩種，X為空或任意一個(gè)或多個(gè)氨基酸或化學(xué)基團(tuán)；先把Y固定在固相樹(shù)脂上，得到Y(jié)-固相樹(shù)脂，對(duì)Y-固相樹(shù)脂進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)，逐一縮合n個(gè)Fmoc-Lys(Dde)-OH，完成Kn-Y-固相樹(shù)脂肽骨架的制備；再對(duì)Kn-Y-固相樹(shù)脂肽骨架進(jìn)行側(cè)鏈氨基Dde及Fmoc脫保護(hù)，在Kn-Y-固相樹(shù)脂自由氨基上同步進(jìn)行A片段的延伸引入，獲得A-(A-K)nY-固相樹(shù)脂；將合成完畢的A-(A-K)nY從固相樹(shù)脂上裂解下來(lái)得到肽粗品，經(jīng)過(guò)高效液相色譜純化得到多肽化合物A-(A-K)nY。根據(jù)肽產(chǎn)物羧基端特點(diǎn)選擇相應(yīng)的制備樹(shù)脂，如肽產(chǎn)物的羧基端為自由羧基，則選用“WANG樹(shù)脂”；如合成肽的羧基端為酰胺，則選用“Rink樹(shù)脂”，如肽產(chǎn)物的羧基端為Cys、Pro、His，則選用“CTC樹(shù)脂”。所述多肽化合物采用多肽固相合成的方法制備，具體步驟為：步驟一：制備Y-固相樹(shù)脂：當(dāng)Y為單一氨基酸，可直接購(gòu)買(mǎi)Y-固相樹(shù)脂；當(dāng)Y為含有多個(gè)氨基酸的短肽，采用固相Fmoc/tBu法，以Fmoc-aa1-Wang樹(shù)脂為起始原料，從C端向N端方向合成，脫去N端Fmoc保護(hù)基成為自由氨基，與樹(shù)脂進(jìn)行縮合，直至得到Y(jié)-固相樹(shù)脂；即：如Y為單一氨基酸aa，可直接購(gòu)買(mǎi)“aa1-固相樹(shù)脂”。若Y由含有多個(gè)氨基酸的短肽構(gòu)成，采用固相Fmoc/tBu法，以Fmoc-aa1-Wang樹(shù)脂(取代值為0.40mmol/g)為起始原料，從C端向N端方向合成，使用20％Piperidine/DMF(V/V)脫去N端Fmoc保護(hù)基成為自由氨基(2次，每次10分鐘)，用3倍當(dāng)量Fmoc-aa-OH/HOBt/DIC與樹(shù)脂進(jìn)行縮合，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)1小時(shí)。以上每步反應(yīng)后都用DMF洗滌樹(shù)脂6次以上，再用KaiserTest檢測(cè)反應(yīng)程度，發(fā)現(xiàn)縮合反應(yīng)不完全需再重復(fù)縮合一次。按次序引入Fmoc-aa2-OH、Fmoc-aa3-OH……重復(fù)縮合反應(yīng)直至完成“Y-固相樹(shù)脂”。步驟二：制備Kn-Y-固相樹(shù)脂肽骨架：對(duì)Y-固相樹(shù)脂進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)露出自由氨基，采用Fmoc-Lys(Dde)-OH進(jìn)行縮合(縮合方式同步驟一)；反復(fù)縮合上n個(gè)Fmoc-Lys(Dde)-OH(記為“循環(huán)1”)，完成Kn-Y-固相樹(shù)脂肽骨架的制備；即進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)露出自由氨基，采用Fmoc-Lys(Dde)-OH進(jìn)行縮合(縮合方式見(jiàn)步驟一)。反復(fù)縮合上n個(gè)Fmoc-Lys(Dde)-OH(“循環(huán)1”)，完成“Kn-Y-固相樹(shù)脂”肽骨架的制備。步驟三：Kn-Y-固相樹(shù)脂進(jìn)行氨基脫保護(hù)：脫去Kn-Y-固相樹(shù)脂肽骨架中Lys側(cè)鏈Dde及Fmoc保護(hù)基，獲得釋放出側(cè)鏈自由氨基的Kn-Y-固相樹(shù)脂；即采用2％肼/DMF(V/V)脫去“Kn-Y-固相樹(shù)脂”肽鏈中Lys側(cè)鏈Dde及Fmoc保護(hù)基(2次，每次15分鐘)，得到釋放出側(cè)鏈自由氨基的Kn-Y-固相樹(shù)脂。步驟四：在Kn-Y-固相樹(shù)脂的自由氨基上同步合成A片段：采用步驟一的方式逐一縮合氨基酸，直至完成A片段獲得A-(A-K)nY-固相樹(shù)脂(記為“循環(huán)2”)；即采用步驟一方式逐一縮合Fmoc-aa1-OH，F(xiàn)moc-aa2-OH，……直至完成A片段獲得“A-(A-K)nY-固相樹(shù)脂”(循環(huán)2)。步驟五：將合成完畢的A-(A-K)nY從固相樹(shù)脂上裂解下來(lái)并除去側(cè)鏈保護(hù)基，得到A-(A-K)nY粗品；即采用95％TFA/H2O將合成完畢的A-(A-K)nY從固相樹(shù)脂上裂解下來(lái)并除去側(cè)鏈保護(hù)基(30℃下切割3小時(shí))；收集含有A-(A-K)nY洗脫液，加入大量冷的無(wú)水乙醚使A-(A-K)nY沉淀析出，離心。用乙醚洗滌數(shù)次后干燥，即得到A-(A-K)nY粗品。步驟六：純化精品：采用高效液相色譜(HPLC)純化粗肽，獲得純度>98％的多肽化合物A-(A-K)nY。即采用高效液相色譜(HPLC)柱(型號(hào)為DaisoC18，10μm,50x250mm)純化A-(A-K)nY粗品，流動(dòng)相A為(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流動(dòng)相B為90％乙腈/水，流速為每分鐘25毫升，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220納米，收集流出峰溶液，再經(jīng)過(guò)冷凍干燥，獲得純度>98％的呈白色絮狀的多肽化合物A-(A-K)nY。步驟七：存儲(chǔ)：經(jīng)冷凍干燥得到呈白色絮狀物的多肽化合物A-(A-K)nY置于避光低溫環(huán)境下保存。每引入縮合一個(gè)氨基酸，及在“循環(huán)1”和“循環(huán)2”之間，每一次引入縮合一個(gè)氨基酸后進(jìn)行“KaiserTest”檢測(cè)游離氨基含量，對(duì)縮合率不高的反應(yīng)再次進(jìn)行縮合。第四方面，提供上述多肽化合物或上述方法制備得到的多肽化合物在制備人或動(dòng)物用抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。所述腫瘤為人體惡性實(shí)體瘤(或術(shù)后殘瘤)或非實(shí)體瘤，如血液病腫瘤(包括白血病及淋巴瘤)。所述腫瘤包括但不限于肉瘤、肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌。第五方面，提供上述多肽化合物或上述方法制備得到的多肽化合物在制備人或動(dòng)物用免疫藥物或增強(qiáng)免疫功能藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所闡述的多肽化合物有望成為多種藥物的有效成分，在制備預(yù)防、治療多種病癥的藥物用都會(huì)有所應(yīng)用，特別是在制備增強(qiáng)免疫能力、抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中會(huì)廣泛應(yīng)用。具體實(shí)施方式以往公開(kāi)的多拷貝功能片段肽分子采用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH制備方式獲得，得到的多拷貝肽分子含有的活性肽片段的拷貝數(shù)呈2n(n＝1，2，3，……)的方式遞增，如形成二拷貝肽分子、或四拷貝肽分子、或八拷貝肽分子、或十六拷貝、……等功能片段的多肽化合物分子。以該方式制備的多肽化合物隨著活性片段拷貝數(shù)的級(jí)數(shù)遞增，其分子量也同樣以級(jí)數(shù)遞增的方式增加。由于不同級(jí)數(shù)拷貝數(shù)之間的分子量差別很大，可能超出了實(shí)際應(yīng)用最佳范圍。在實(shí)際應(yīng)用中通常需要顧及肽分子大小及免疫原性之間的相互關(guān)系、肽分子與靶分子反應(yīng)之間關(guān)系、肽分子合成的投入產(chǎn)出比效益等諸多因素，綜合評(píng)價(jià)后確定實(shí)際應(yīng)用的最佳肽分子形式。本發(fā)明充分考慮了上述肽分子存在的問(wèn)題，提出了一種更為實(shí)用、且可具有任意拷貝數(shù)的多肽分子及其制備方法，克服了目前只能以級(jí)數(shù)增加的方式制備得到的多拷貝多肽分子存在的諸多缺陷。本發(fā)明設(shè)計(jì)和制備出一種含有任意拷貝A片段的分支狀多肽分子A-(A-K)n-Y，其中，A為具有特定生物功能的活性肽片段；K為含有兩個(gè)活性氨基的賴(lài)氨酸Fmoc-Lys(Dde)-OH，n為K的數(shù)目，Y為空或任意一個(gè)或多個(gè)氨基酸或化學(xué)基團(tuán)。結(jié)構(gòu)式A-(A-K)n-Y的表述如下：當(dāng)多肽化合物結(jié)構(gòu)式為A-(A-K)-Y時(shí)，n＝1，多肽化合物中生物活性短肽片段A的拷貝總數(shù)為n+1為2；當(dāng)結(jié)構(gòu)式為A-(A-K)2-Y時(shí)，n＝2，多肽化合物中A的拷貝總數(shù)為3；以此類(lèi)推……。本發(fā)明以A代表泛指具有特定生物功能的活性肽片段，為便于闡述本發(fā)明的意圖，具體實(shí)施方式中特以A為XAXBXCXD-X時(shí)加以說(shuō)明。其中，XA和XB為脂肪族氨基酸分子，包括：苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、賴(lài)氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)和谷氨酰胺(Gln，Q)中的任意一種，可相同或不同。XC和XD可選自以上脂肪族氨基酸分子中的任意一種，可相同或不同；也可以選自雜環(huán)氨基酸，包括：色氨酸(Trp,W)、組氨酸(His,H)和脯氨酸(Pro,P)中的任意一種，可相同或不同；X為空或任意一個(gè)氨基酸或任意多個(gè)氨基酸組成的肽片段或能將氨基酸、肽片段連接起來(lái)的化學(xué)基團(tuán)。本發(fā)明的多肽化合物通過(guò)變化XA、XB、XC、XD的種類(lèi)用于抑制腫瘤的生長(zhǎng)、提高機(jī)體的免疫應(yīng)答能力從而可開(kāi)發(fā)一種可在臨床應(yīng)用(人用或動(dòng)物用)的增強(qiáng)免疫功能和/或抗腫瘤的藥物。1963年美國(guó)科學(xué)家R.B.Merrifield發(fā)明創(chuàng)立了將目的肽的氨基酸的羧基端(C端)固定在不溶性樹(shù)脂上，樹(shù)脂上結(jié)合的氨基酸的氨基端(N端)與有待連接的氨基酸的羧基端進(jìn)行縮合反應(yīng)達(dá)到延長(zhǎng)肽鏈的固相合成法。也就是從多肽的羧基端(C端)開(kāi)始逐個(gè)氨基酸縮合并向多肽段的氨基端(N端)方向不斷延伸。因此，在進(jìn)行氨基酸的縮合反應(yīng)時(shí)，要將有待連接的氨基酸上的氨基及側(cè)鏈基團(tuán)保護(hù)起來(lái)避免發(fā)生反應(yīng)。目前常用的有叔丁氧羰基(Boc)保護(hù)法、芴甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)法和水合肼(Dde)保護(hù)法，因此每連接上一個(gè)氨基酸就要經(jīng)歷一次脫保護(hù)-縮合的循環(huán)過(guò)程(即固相載體上的氨基先脫保護(hù)，再同過(guò)量的有待連接的下一個(gè)目標(biāo)氨基酸的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)以延長(zhǎng)肽鏈)。每經(jīng)歷一個(gè)循環(huán)，即：氨基酸縮合→洗滌→脫保護(hù)→中和→洗滌，接上一個(gè)目標(biāo)氨基酸，直至達(dá)到所需要合成的目標(biāo)肽鏈長(zhǎng)度。本發(fā)明先采用帶有2個(gè)活性氨基的賴(lài)氨酸(Lys，K)Fmoc-Lys(Dde)-OH依次發(fā)生縮合反應(yīng)至想要的拷貝數(shù)(想要的拷貝數(shù)減1是需要縮合的Fmoc-Lys(Dde)-OH數(shù)目n)，合成得到由-Lys(Dde)-組成的固定在固相樹(shù)脂上的Kn-Y分子骨架。將“Kn-Y-固相樹(shù)脂”上的賴(lài)氨酸(Lys，K)脫去側(cè)鏈氨基的Dde及Fmoc保護(hù)露出自由氨基，啟動(dòng)Fmoc-aa-OH氨基酸縮合反應(yīng)循環(huán)，直至完成A片段的合成，獲得“A-(A-K)nY-固相樹(shù)脂”。采用95％TFA/H2O將A-(A-K)nY從固相樹(shù)脂上裂解下來(lái)進(jìn)行純化，即得到精品A-(A-K)nY。n的數(shù)量決定了最終得到的多肽分子含有的生物活性片段的拷貝數(shù)(n+1)，即，若n＝2，得到的是含三拷貝A片段的三拷貝A-(A-K)2-Y肽分子；若n＝4，得到的是含五拷貝A片段的五拷貝A-(A-K)4-Y肽分子；以此類(lèi)推，可以得到含有四拷貝、六拷貝、七拷貝、……A片段的多拷貝肽分子。使用WANG樹(shù)脂合成完成后，采用TFA法將肽鏈從固相樹(shù)脂上裂解下來(lái)得到的兩拷貝、三拷貝、四拷貝、五拷貝、六拷貝、七拷貝、八拷貝、……的A-(A-K)nY分子。本發(fā)明所闡述的是一種多拷貝多肽化合物分子的結(jié)構(gòu)及制備方法，采用其它方式合成具備此分子骨架A-(A-K)4-Y的肽化合物理所當(dāng)然地包含在本發(fā)明之中；與其結(jié)構(gòu)特征相關(guān)聯(lián)的分子骨架(A-K)n-Y或在K之間插入氨基酸或化學(xué)基團(tuán)等方式形成的分子也理所當(dāng)然地包含在本發(fā)明之中。(A-K)n-Y即在完成肽分子末端縮合Fmoc-Lys(Dde)-OH后，分子的N端Fmoc被Boc酸酐封端，然后采用2％肼/DMF進(jìn)行Dde脫保護(hù)，再實(shí)施A片段的縮合連接，使肽化合物骨架上相比A-(A-K)n-Y減少了一個(gè)A片段的拷貝成為(A-K)n-Y，此方式為A-(A-K)n-Y的變通方式。采用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH替代多拷貝A片段中的n數(shù)目也屬于本發(fā)明A-(A-K)n-Y的變通方式，如在“Kn-Y-固相樹(shù)脂”的末端以Fmoc-Lys(Fmoc)-OH替代Fmoc-Lys(Dde)-OH，獲得相同的產(chǎn)物A-(A-K)n-Y。在多拷貝A片段A-(A-K)n-Y分子制備中，以Fmoc-Lys(Fmoc)-OH替代1至多個(gè)Fmoc-Lys(Dde)-OH，所形成的3拷貝A片段A2K-(A-K)-Y分子、5拷貝A片段(A2K)2K-(A-K)-Y分子、9拷貝A片段〔(A2K)2K〕2K-(A-K)-Y分子，它們所形成的變通結(jié)構(gòu)包含了制備任意拷貝數(shù)A片段的特征，理所當(dāng)然地屬于本發(fā)明之中。為便于更加具體地說(shuō)明本
發(fā)明內(nèi)容，列舉以下具體實(shí)施例對(duì)本案發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但這些實(shí)施例絕非對(duì)本發(fā)明有任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說(shuō)明書(shū)的啟示下對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中所作的任何變動(dòng)和衍生都將屬于本發(fā)明。實(shí)施例1：拷貝肽片段的合成本發(fā)明的多肽化合物不論是兩拷貝、還是三拷貝、五拷貝、……，都具有相同的拷貝肽A片段，A為具有生物活性的短肽片段XAXBXCXD-X片段；其中，XA和XB為脂肪族氨基酸分子，包括：苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、賴(lài)氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)和谷氨酰胺(Gln，Q)中的任意一種，可相同或不同；XC和XD可選自以上脂肪族氨基酸分子中的任意一種，可相同或不同；也可選自雜環(huán)氨基酸，包括：色氨酸(Trp,W)、組氨酸(His,H)和脯氨酸(Pro,P)中的任意一種，可相同或不同。K為含有兩個(gè)活性氨基的賴(lài)氨酸Fmoc-Lys(Dde)-OH，X或Y為空或任意一個(gè)氨基酸或任意多個(gè)氨基酸組成的肽片段或能將氨基酸、肽片段連接起來(lái)的化學(xué)基團(tuán)，組合方式見(jiàn)表2，但不限于此。本實(shí)施例以自由羧基端肽片段的合成為說(shuō)明，但實(shí)際應(yīng)用時(shí)采用的肽其羧基端可附加其它化學(xué)修飾，如酰胺化等。采用固相Fmoc/tBu人工合成法，也可采用多肽自動(dòng)合成儀(ABI433A型)合成法，具體操作如下：取用Fmoc-aax-WANG樹(shù)脂(取代值為0.40mmol/g)為起始原料，從C端向N端方向合成，使用20％Piperidine/DMF(V/V)脫去樹(shù)脂上起始氨基酸N端Fmoc保護(hù)基使其成為自由氨基(2次，每次10分鐘)，用3倍當(dāng)量Fmoc-aaD-OH/HOBt/DIC與樹(shù)脂進(jìn)行縮合，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)1小時(shí)。以上每步反應(yīng)后都用DMF洗滌樹(shù)脂6次以上，再用KaiserTest檢測(cè)縮合反應(yīng)程度，發(fā)現(xiàn)縮合反應(yīng)不完全需再重復(fù)縮合一次。依據(jù)A片段的序列XAXBXCXD-X，依次縮合Fmoc-aaD-OH、Fmoc-aaC-OH、Fmoc-aaB-OH、Fmoc-aaA-OH(Fmoc-aaD-OH、Fmoc-aaC-OH、Fmoc-aaB-OH、Fmoc-aaA-OH分別代表氨基被Fmoc保護(hù)起來(lái)的氨基酸XD、XC、XB、XA),每縮合一個(gè)氨基酸都重復(fù)一次反應(yīng)循環(huán)，直至把A片段合成完畢。合成完畢后采用95％TFA/H2O法將A片段從固相樹(shù)脂上裂解下來(lái)并除去側(cè)鏈保護(hù)基(30℃下切割3小時(shí))。含有切割下來(lái)的A片段收集液加入大量冷的無(wú)水乙醚中使肽沉淀析出，經(jīng)離心去除上清，沉淀用乙醚洗滌數(shù)次后干燥，即得到A片段粗品。采用高效液相色譜(HPLC)柱(型號(hào)為DaisoC18，10μm,50×250mm)純化A片段粗品。色譜操作流動(dòng)相A為(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流動(dòng)相B為90％乙腈/水，流速為每分鐘25毫升，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220納米。收集流出峰溶液，反純度>98％的A片段肽產(chǎn)物。經(jīng)冷凍干燥得到呈白色絮狀A(yù)片段肽產(chǎn)物，經(jīng)密封包裝置于避光低溫環(huán)境中存儲(chǔ)。XA、XB、XC、XD相應(yīng)的氨基酸合成原料Fmoc-aa-OH均可通過(guò)商業(yè)途經(jīng)采購(gòu)獲得。在制備本發(fā)明闡述的肽化合物A片段時(shí)，也可直接外購(gòu)XD-WANG樹(shù)脂或X-WANG樹(shù)脂為原料，按照上述方法得到本發(fā)明的拷貝肽A片段，表1中列出部分合成得到的拷貝肽A片段，并測(cè)得其質(zhì)譜分子量。表1單拷貝肽片段XAXBXCXD-X的各基團(tuán)列表本發(fā)明合成得到的表1中的A片段的質(zhì)譜分子量與理論值的檢測(cè)誤差值要求在0.01％范圍之內(nèi)，說(shuō)明該A片段確證為對(duì)應(yīng)實(shí)施例的A片段。此實(shí)施例的表1是為了舉例說(shuō)明A片段的部分內(nèi)容，但并不局限于所列出的片段，實(shí)際合成方式可按以下實(shí)施例中的說(shuō)明進(jìn)行，但可不拘泥于此方式。實(shí)施例2：分別合成三拷貝A-(A-K)2-Y肽分子，五拷貝A-(A-K)4-Y肽分子本發(fā)明以制備自由羧基端的肽分子為例進(jìn)行合成說(shuō)明，實(shí)際應(yīng)用中合成的肽分子其羧基端可不受此限制，并將根據(jù)需要選取相應(yīng)的固相樹(shù)脂進(jìn)行合成。三拷貝肽類(lèi)分子A-(A-K)2-Y即為三拷貝XAXBXCXD-X多肽化合物XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)2-Y，其結(jié)構(gòu)與合成線路見(jiàn)式1，其中，XA和XB為脂肪族氨基酸分子，包括：苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、賴(lài)氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)和谷氨酰胺(Gln，Q)中的任意一種，可相同或不同；XC和XD可選自以上脂肪族氨基酸分子中的任意一種，可相同或不同；也可選自雜環(huán)氨基酸，包括：色氨酸(Trp,W)、組氨酸(His,H)和脯氨酸(Pro,P)中的任意一種，可相同或不同。K為含有兩個(gè)活性氨基的賴(lài)氨酸Fmoc-Lys(Dde)-OH，X或Y為空或任意一個(gè)氨基酸或任意多個(gè)氨基酸組成的肽片段或能將氨基酸、肽片段連接起來(lái)的化學(xué)基團(tuán)。制備三拷貝A肽分子的方法為：Y-固相樹(shù)脂→進(jìn)入縮合Fmoc-Lys(Dde)-OH的“循環(huán)1”→完成2個(gè)“循環(huán)1”→Fmoc-Lys(Dde)-Lys(Dde)-Y-固相樹(shù)脂→Dde及Fmoc脫保護(hù)→H2N-Lys(H2N)-Lys(H2N)-Y-固相樹(shù)脂→合成A片段，進(jìn)入縮合Fmoc-aa-OH“循環(huán)2”→A-Lys(A)-Lys(A)-Y-固相樹(shù)脂→合成完畢→脫去側(cè)鏈保護(hù)基并把肽從樹(shù)脂上裂解下來(lái)得到A-Lys(A)-Lys(A)-Y粗品→純化→肽精品→低溫存儲(chǔ)。本實(shí)施例采用多肽固相合成法，具體操作如下：本實(shí)施例中多肽是通過(guò)手工合成，自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐個(gè)氨基酸縮合延伸，合成完成后采用TFA法將多肽從固相樹(shù)脂上裂解下來(lái)。先把Y固定在固相樹(shù)脂上，再通過(guò)逐個(gè)縮合2個(gè)帶有兩個(gè)活性氨基的賴(lài)氨酸Fmoc-Lys(Dde)-OH，獲得K2-Y-樹(shù)脂。由于其末端的賴(lài)氨酸具有一個(gè)活化的氨基，與另外一個(gè)帶有一個(gè)活性氨基的賴(lài)氨酸(Lys,K)發(fā)生反應(yīng)，就會(huì)得到直鏈延伸的K2Y-WANG樹(shù)脂；然后在末端賴(lài)氨酸的活性氨基位置與A片段(XAXBXCXD-X)反應(yīng)，得到直鏈延伸的XAXBXCXD-X-K2Y-WANG固相樹(shù)脂；采用2％肼/DMF(V/V)對(duì)K2Y-WANG樹(shù)脂中賴(lài)氨酸被保護(hù)的側(cè)鏈氨基進(jìn)行Dde及Fmoc脫保護(hù),然后在其側(cè)鏈自由氨基上同時(shí)進(jìn)行A片段XAXBXCXD-X氨基酸X、XD、XC、XB、XA的逐一縮合。得到三拷貝A片段XAXBXCXD-X合成物XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)2-Y-WANG樹(shù)脂，或A-(A-K)2-Y-WANG樹(shù)脂。此步驟中，合成時(shí)可以按照實(shí)施例1先合成好XAXBXCXD-X片段，再與K2-Y-WANG樹(shù)脂縮合；或者，在K2-Y-WANG樹(shù)脂的自由氨基上同時(shí)依次引入縮合組成A片段的氨基酸X、XD、XC、XB、XA，得到A-Lys(A)-Lys(A)-Y-WANG樹(shù)脂。最后采用95％TFA/H2O法將A-Lys(A)-Lys(A)-Y從WANG樹(shù)脂上裂解下來(lái)，就得到了A-Lys(A)-Lys(A)-Y，或A-(A-K)2-Y多肽化合物粗品。純化XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)2-Y肽化合物：采用色譜柱(型號(hào)為DaisoC18，10μm,50×250mm)，色譜操作流動(dòng)相A為(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流動(dòng)相B為90％乙腈/水，流速為每分鐘25毫升，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220納米。收集流出峰溶液，再經(jīng)過(guò)冷凍干燥。得到呈白色絮狀的XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)2Y多肽化合物，經(jīng)密封包裝后放入冰箱保存待用；其純度可＞99％。XA、XB、XC、XD相應(yīng)的氨基酸合成原料Fmoc-aa-OH均可通過(guò)商業(yè)途經(jīng)采購(gòu)獲得。在制備本發(fā)明的多肽化合物時(shí)，也可直接外購(gòu)獲得Y-WANG樹(shù)脂原料，按照上述方法得到本發(fā)明闡述的多肽化合物。按照本實(shí)施例舉例的方法分別合成三拷貝A片段肽分子X(jué)AXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)2-Y，及五拷貝A片段肽分子X(jué)AXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4-Y，它們的具體基團(tuán)的選擇分別見(jiàn)表2及表3。表2.三拷貝A片段肽分子X(jué)AXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)2-Y的各基團(tuán)列表本發(fā)明合成得到的表2中的三拷貝A片段肽分子的質(zhì)譜分子量與理論值的檢測(cè)誤差值要求在0.01％范圍之內(nèi)，說(shuō)明該三拷貝A片段肽分子確證為對(duì)應(yīng)實(shí)施例的肽分子。此實(shí)施例部分是為了舉例說(shuō)明A片段及形成的分子結(jié)構(gòu)形式，但并不局限于所列出的片段。以上內(nèi)容并不是對(duì)本發(fā)明的限制，實(shí)際合成方式可按以下實(shí)施例中的說(shuō)明進(jìn)行，但可不拘泥于此方式。實(shí)施例3：五拷貝肽類(lèi)分子X(jué)AXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4-Y的合成本發(fā)明提供的五拷貝肽類(lèi)分子A-(A-K)4-Y即為五拷貝XAXBXCXD-X多肽化合物XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4-Y，其結(jié)構(gòu)與合成線路見(jiàn)式2，其中，XA和XB為脂肪族氨基酸分子，包括：苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、賴(lài)氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)和谷氨酰胺(Gln，Q)中的任意一種，可相同或不同；XC和XD可選自以上脂肪族氨基酸分子中的任意一種，可相同或不同；也可選自雜環(huán)氨基酸，包括：色氨酸(Trp,W)、組氨酸(His,H)和脯氨酸(Pro,P)中的任意一種，可相同或不同。K為含有兩個(gè)活性氨基的賴(lài)氨酸Fmoc-Lys(Dde)-OH，X或Y為空或任意一個(gè)氨基酸或任意多個(gè)氨基酸組成的肽片段或能將氨基酸、肽片段連接起來(lái)的化學(xué)基團(tuán):制備五拷貝A肽分子的方法：Y-固相樹(shù)脂→進(jìn)入縮合Fmoc-Lys(Dde)-OH的“循環(huán)1”→完成4個(gè)“循環(huán)1”→Fmoc-Lys(Dde)-Lys(Dde)-Lys(Dde)-Lys(Dde)-Y-固相樹(shù)脂→側(cè)鏈氨基Dde及Fmoc脫保護(hù)→H2N-Lys(H2N)-Lys(H2N)-Lys(H2N)-Lys(H2N)-Y-固相樹(shù)脂→合成A片段，進(jìn)入縮合Fmoc-aa-OH“循環(huán)2”→A-Lys(A)-Lys(A)-Lys(A)-Lys(A)-Y-固相樹(shù)脂→合成完畢→脫去側(cè)鏈保護(hù)基并把肽從樹(shù)脂上裂解下來(lái)得到A-Lys(A)-Lys(A)-Lys(A)-Lys(A)-Y粗品→純化→肽精品→低溫存儲(chǔ)。本實(shí)施例采用多肽固相合成方法，具體操作如下：合成XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4-Y多肽化合物:本實(shí)施例中的多肽采用手工合成方式，自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐個(gè)氨基酸縮合延伸，合成完成后采用TFA法將多肽從固相樹(shù)脂上裂解下來(lái)。先把Y固定在固相樹(shù)脂上，再通過(guò)逐個(gè)縮合4個(gè)帶有兩個(gè)活性氨基的賴(lài)氨酸Fmoc-Lys(Dde)-OH，獲得K4-Y-樹(shù)脂。由于其末端的賴(lài)氨酸具有一個(gè)活化的氨基，與另外一個(gè)帶有一個(gè)活性氨基的賴(lài)氨酸(Lys,K)發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而再與第三個(gè)、第四個(gè)帶有一個(gè)活性氨基的賴(lài)氨酸(Lys,K)發(fā)生反應(yīng)，就會(huì)得到直鏈延伸的K4Y-WANG樹(shù)脂；然后在末端賴(lài)氨酸的活性氨基位置與A片段(XAXBXCXD-X)反應(yīng)，得到直鏈延伸的XAXBXCXD-X-K4-Y-WANG樹(shù)脂；使用2％肼/DMF(V/V)對(duì)K4Y-WANG樹(shù)脂中賴(lài)氨酸側(cè)鏈氨基進(jìn)行Dde及Fmoc脫保護(hù)；然后對(duì)K4Y-WANG樹(shù)脂上的自由氨基同時(shí)進(jìn)行A片段的氨基酸X、XD、XC、XB、XA引入縮合反應(yīng)，即在賴(lài)氨酸(Lys,K)脫保護(hù)后的自由氨基上縮合A片段(XAXBXCXD-X)，得到五拷貝A片段XAXBXCXD-X合成物XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4-Y-WANG樹(shù)脂,或A-(A-K)4-Y-WANG樹(shù)脂。最后采用95％TFA/H2O法將A-(A-K)4-Y肽化合物從WANG樹(shù)脂上裂解下來(lái)，就得到了XAXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4Y或A-(A-K)4-Y粗品。純化A-(A-K)4-Y多肽化合物：采用色譜柱(型號(hào)為DaisoC18，10μm,50×250mm)，色譜操作流動(dòng)相A為(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流動(dòng)相B為90％乙腈/水，流速為每分鐘25毫升，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220納米。收集流出峰溶液，再經(jīng)過(guò)冷凍干燥。得到呈白色絮狀的A-(A-K)4-Y多肽化合物，經(jīng)密封包裝后放入冰箱保存待用；其純度可＞99％。合成A片段的氨基酸原料XA、XB、XC、XD均可通過(guò)商業(yè)途經(jīng)采購(gòu)獲得。在制備本發(fā)明的多肽化合物時(shí)，可直接外購(gòu)Y-WANG樹(shù)脂作為起始合成的原料，按照上述方法在Y的氨基末端引入縮合氨基酸，得到本發(fā)明的多肽化合物。按照本實(shí)施例方法合成一系列五拷貝肽類(lèi)分子X(jué)AXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4-Y，具體基團(tuán)的選擇見(jiàn)表3。表3.五拷貝A片段肽分子X(jué)AXBXCXD-X-(XAXBXCXD-X-K)4-Y的各基團(tuán)列表本發(fā)明合成得到的表3中的五拷貝A片段肽分子的質(zhì)譜分子量與理論值的檢測(cè)誤差值要求在0.01％范圍之內(nèi)，說(shuō)明該五拷貝A片段肽分子確證為對(duì)應(yīng)實(shí)施例的肽分子。此實(shí)施例部分是為了舉例說(shuō)明A片段及形成的分子結(jié)構(gòu)形式，但并不局限于所列出的片段。以上內(nèi)容并不是對(duì)本發(fā)明的限制，實(shí)際合成方式可按以下實(shí)施例中的說(shuō)明進(jìn)行，但可不拘泥于此方式。按照本發(fā)明闡述的方式可制備任意拷貝生物活性肽片段的肽分子，實(shí)施例中刻意挑選具有代表性的三拷貝及五拷貝生物活性肽片段(A片段)的肽分子加以制備說(shuō)明及試驗(yàn)檢驗(yàn)，證實(shí)本發(fā)明闡述的肽分子A-(A-K)n-Y涵蓋的制備可行性及有效性。本發(fā)明涉及制備含有多拷貝生物活性肽片段的化合物，分子式A-(A-K)n-Y中A即代表生物活性肽片段，為便于說(shuō)明將實(shí)施例中采用的部分生物活性片段羅列于表格中，但在實(shí)際應(yīng)用中A代表所有具備生物活性的肽片段，涉及的生物功能不僅僅局限于本實(shí)施例所陳述的舉列說(shuō)明的有限功能范圍的活性肽片段。按照本實(shí)施例公布的生物功能片段，以及在此基礎(chǔ)上通過(guò)對(duì)已知活性肽片段A所做的增減氨基酸、氨基酸替換、氨基酸末端修飾、氨基酸側(cè)鏈修飾衍生而出的肽化合物分子，按照A-(A-K)n-Y肽分子結(jié)構(gòu)制備的分子都涵蓋在本專(zhuān)利的范圍之內(nèi)。下面通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)例來(lái)對(duì)本發(fā)明提供的多肽化合物的生物活性及其功效進(jìn)行闡述。實(shí)驗(yàn)例一：本發(fā)明多肽化合物在禽類(lèi)動(dòng)物(雞)中的免疫效果實(shí)驗(yàn)含有血凝素(Hemagglutinin，HA)的病毒能凝集人或動(dòng)物紅細(xì)胞，稱(chēng)為血凝現(xiàn)象。這種血凝現(xiàn)象能被特異性免疫血清或特異性抗體所抑制，被稱(chēng)為“血凝抑制試驗(yàn)”(HemagglutinationInhibitionTest，HI)。新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus,NDV)能夠與雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象，雞免疫新城疫病毒疫苗后，可以通過(guò)檢測(cè)雞血清的血凝抑制試驗(yàn)(HI)鑒定抗體水平。檢測(cè)所用的抗血清稀釋的最高倍數(shù)即是抗體的滴度?？贵w的滴度越高，說(shuō)明免疫的效果越好。HI方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.敏感性強(qiáng)，可以檢測(cè)到微量的抗體，結(jié)果也較為準(zhǔn)確，是較敏感的血清學(xué)檢測(cè)反應(yīng)之一；2.特異性強(qiáng)，病毒凝集紅細(xì)胞只能被特異性的抗體所抑制；3.檢測(cè)速度快，1次HI試驗(yàn)只需2小時(shí)左右即可判定結(jié)果；4.HI試驗(yàn)對(duì)環(huán)境要求不高，操作簡(jiǎn)單快捷，一次可檢測(cè)大量的樣品。本實(shí)驗(yàn)例采用表2中3拷貝的不同片段進(jìn)行檢測(cè)，考察多拷貝生物活性肽分子與疫苗聯(lián)用對(duì)機(jī)體產(chǎn)生抗體的影響。實(shí)驗(yàn)方法為：選取10日齡無(wú)特定病原(SpecificPathogenFree)雞(簡(jiǎn)稱(chēng)為SPF雛雞)。將SPF雛雞分為12組，每組10只。在SPF雛雞的翅膀腋部皮下按以下組別接種。然后各組同時(shí)飼養(yǎng)在隔離器內(nèi)。接種后第10天翅下靜脈采血約1ml，分離血清進(jìn)行HI檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4(僅列出部分多肽化合物的檢測(cè)結(jié)果)。具體操作參見(jiàn)由郭鑫主編，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社2007年出版的《動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》?？瞻捉M：注射0.3ml生理鹽水；對(duì)照組：接種0.3ml雞新城疫活疫苗(簡(jiǎn)寫(xiě)為“疫苗”，CS2株，成都天邦生物制品有限公司出品)；實(shí)驗(yàn)組：接種混合有0.2μg本發(fā)明多肽化合物的疫苗0.3ml。實(shí)驗(yàn)期間各組SPF雛雞按照常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致，飲食活動(dòng)未見(jiàn)異常，未見(jiàn)不良反應(yīng)，未發(fā)生SPF雛雞死亡，表明本發(fā)明的多肽化合物使用安全。表4結(jié)果表明雞疫苗中添加了本發(fā)明闡述的多肽化合物后，HI的抗體滴度均值比空白組和對(duì)照組(僅有疫苗)均有所提高，說(shuō)明本發(fā)明多肽化合物與疫苗聯(lián)用具有良好的免疫增強(qiáng)效果。表4SPF雛雞免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果組別接種物質(zhì)平均抗體滴度組別接種物質(zhì)平均抗體滴度空白組生理鹽水陰性對(duì)照組疫苗8.2log2實(shí)驗(yàn)組8疫苗+#8-39.0log2實(shí)驗(yàn)組1疫苗+#1-38.9log2實(shí)驗(yàn)組9疫苗+#9-39.2log2實(shí)驗(yàn)組2疫苗+#2-39.0log2實(shí)驗(yàn)組10疫苗+#10-39.1log2實(shí)驗(yàn)組3疫苗+#3-39.2log2實(shí)驗(yàn)組11疫苗+#11-39.1log2實(shí)驗(yàn)組4疫苗+#4-39.2log2實(shí)驗(yàn)組12疫苗+#12-38.8log2實(shí)驗(yàn)組5疫苗+#5-39.1log2實(shí)驗(yàn)組13疫苗+#13-39.2log2實(shí)驗(yàn)組6疫苗+#6-39.2log2實(shí)驗(yàn)組14疫苗+#14-39.1log2實(shí)驗(yàn)組7疫苗+#7-38.8log2實(shí)驗(yàn)組15疫苗+#15-39.1log2注：陰性是指HI的抗體滴度為零。實(shí)驗(yàn)例二：比較含有不同拷貝數(shù)的生物活性片段的肽分子對(duì)免疫效果的影響實(shí)驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)例一中隨機(jī)選取一種生物活性肽分子、含有3拷貝活性肽分子、5拷貝活性肽分子檢測(cè)不同拷貝數(shù)活性肽片段分子對(duì)免疫效果的影響，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。實(shí)驗(yàn)分組為：空白組：注射0.3ml生理鹽水；對(duì)照組：按照疫苗生產(chǎn)廠商提供的說(shuō)明書(shū)，每只雞給予接種0.3ml新城疫活疫苗(簡(jiǎn)寫(xiě)為“疫苗”，CS2株)；實(shí)驗(yàn)組：按照疫苗生產(chǎn)廠商提供的說(shuō)明書(shū)，每只雞給予接種混有0.2μg編號(hào)肽及疫苗0.3ml；表5SPF雛雞免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果注：陰性是指HI的抗體滴度為零。實(shí)驗(yàn)期間各組SPF雛雞飲食活動(dòng)未見(jiàn)異常，未見(jiàn)不良反應(yīng)，未發(fā)生SPF雛雞死亡，表明本發(fā)明的多肽化合物使用安全。表5結(jié)果表明隨著肽片段拷貝數(shù)量的增加，免疫增強(qiáng)效果得到進(jìn)一步提升，意味著生物學(xué)效果與肽片段拷貝數(shù)量呈正相關(guān)的作用機(jī)制。實(shí)施例三：不同拷貝數(shù)的肽化合物抑制實(shí)體瘤的效果實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簷z測(cè)不同拷貝數(shù)的合成肽樣品對(duì)小鼠實(shí)體瘤的抑制效果。受試樣品：合成肽樣品#6-1、#6-3、#6-5、均為凍干品，規(guī)格：5mg/瓶，純度>98.5％，置于-20℃冰箱中保存，采用注射用水現(xiàn)用現(xiàn)配制為2mg/ml，在小鼠的頸背處進(jìn)行皮下注射給藥，每次注射后的剩余樣品丟棄。陽(yáng)性對(duì)照樣品：5-氟尿嘧啶(簡(jiǎn)寫(xiě)：5-FU),購(gòu)自金耀氨基酸，規(guī)格：250mg/10ml/瓶，批號(hào)：1600108，對(duì)小鼠的腹腔實(shí)施注射給藥，每次注射后的剩余藥品丟棄。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：MusMusculusBalb/c雌性小鼠，6-8周，體重：23+2g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由北京華阜康生物科技有限公司提供。小鼠在SPF級(jí)22+3℃/40-80％保持恒溫恒濕的層流動(dòng)物房?jī)?nèi)5只小鼠/籠飼養(yǎng)，自由攝取清潔級(jí)鼠料塊及自由飲用過(guò)濾滅菌水，按照動(dòng)物房小鼠飼養(yǎng)規(guī)程管理。實(shí)驗(yàn)方法：采用體外培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠肝癌H22腫瘤細(xì)胞用于接種，使用PBS緩沖液稀釋?xiě)腋∧[瘤細(xì)胞至濃度1×106個(gè)/0.1ml并將它們接種到小鼠右側(cè)肩胛皮下。密切觀察小鼠出瘤情況，待小鼠皮下的腫塊長(zhǎng)到約50-80mm3時(shí)進(jìn)行分組給藥。實(shí)驗(yàn)終止：每?jī)商焓褂糜螛?biāo)尺對(duì)各組小鼠的瘤體積進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，當(dāng)對(duì)照組的瘤體積均值達(dá)到約2000mm3時(shí)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部實(shí)施頸部脫臼處死，剝離腫瘤組織并稱(chēng)重、記錄各組各個(gè)腫瘤的重量及各組平均瘤重。根據(jù)各組平均瘤重計(jì)算抑瘤率(％)＝(1-樣品組瘤重平均值/空白組瘤重平均值)×100％。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行one-wayANOVA檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6。表6小鼠肝癌H22模型實(shí)體瘤抑制試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)樣品組間的平均瘤重與空白組平均瘤重進(jìn)行比較，結(jié)果表明隨著活性肽拷貝數(shù)的增加，抑瘤效果得到增強(qiáng)。實(shí)施例四：檢測(cè)含有5個(gè)拷貝生物活性肽化合物的抑瘤實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模弘S機(jī)選取3種含有5個(gè)拷貝生物活性肽化合物，檢測(cè)它們對(duì)小鼠肝癌H22實(shí)體瘤模型的抑制效果。受試樣品：合成肽樣品#4-5、#9-5、#14-5、均為凍干品，規(guī)格：5mg/瓶，純度>98.5％，置于-20℃冰箱中保存，采用注射用水現(xiàn)用現(xiàn)配制為2mg/ml，在小鼠的頸背處進(jìn)行皮下注射給藥，每次注射后的剩余樣品丟棄。陽(yáng)性對(duì)照樣品：5-氟尿嘧啶(簡(jiǎn)寫(xiě)：5-FU),購(gòu)自金耀氨基酸規(guī)格：250mg/10ml/瓶，批號(hào)：1600108，對(duì)小鼠的腹腔實(shí)施注射給藥，每次注射后的剩余藥品丟棄。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：MusMusculusBalb/c雌性小鼠，6-8周，體重：23+1g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由北京華阜康生物科技有限公司提供。小鼠在SPF級(jí)22+3℃/40-80％保持恒溫恒濕的層流動(dòng)物房?jī)?nèi)5只小鼠/籠飼養(yǎng)，自由攝取清潔級(jí)鼠料塊及自由飲用過(guò)濾滅菌水，按照動(dòng)物房小鼠飼養(yǎng)規(guī)程管理。實(shí)驗(yàn)方法：采用體外培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠肝癌H22腫瘤細(xì)胞用于接種，使用PBS緩沖液稀釋?xiě)腋∧[瘤細(xì)胞至濃度1x106個(gè)/0.1ml并將它們接種到小鼠右側(cè)肩胛皮下。密切觀察小鼠出瘤情況，待小鼠皮下的腫塊長(zhǎng)到約50-80mm3時(shí)進(jìn)行分組給藥。實(shí)驗(yàn)終止：每?jī)商焓褂糜螛?biāo)尺對(duì)各組小鼠的瘤體積進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，當(dāng)對(duì)照組的瘤體積均值達(dá)到約2000mm3時(shí)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部實(shí)施頸部脫臼處死，剝離腫瘤組織并稱(chēng)重、記錄各組各個(gè)腫瘤的重量及各組平均瘤重。根據(jù)各組平均瘤重計(jì)算抑瘤率(％)＝(1-樣品組瘤重平均值/空白組瘤重平均值)x100％。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行one-wayANOVA檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表7。表7小鼠肝癌H22模型實(shí)體瘤抑制試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果分析：各實(shí)驗(yàn)樣品組間的平均瘤重與空白組平均瘤重進(jìn)行比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P<0.05表明實(shí)驗(yàn)樣品#4-5、#9-5、#14-5對(duì)抑制小鼠肝癌H22模型的抑瘤效果顯示有顯著性差異。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3