本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及鹽生植物溝葉結(jié)縷草中一個(gè)新的耐鹽基因ZmUBP及其植物表達(dá)載體和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

土壤鹽漬化已經(jīng)成為影響植物生長發(fā)育及產(chǎn)量的關(guān)鍵脅迫因子，耐鹽植物的培育利用是解決鹽脅迫下植物生長的最有利途徑。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷完善，通過基因工程手段結(jié)合分子設(shè)計(jì)理念來提高植物抗逆性已成為目前研究的熱點(diǎn)方向，由此，挖掘耐鹽基因并加以利用顯得至關(guān)重要。

FOX 捕捉系統(tǒng)通過在模式植物擬南芥中過量表達(dá)目標(biāo)植物全長cDNA文庫，獲得含有不同cDNA插入的轉(zhuǎn)基因擬南芥庫，根據(jù)這些表達(dá)的全長cDNA導(dǎo)致的顯著突變表型，獲得目標(biāo)植物的cDNA基因功能 (Ichikawa et al. 2006)。本課題組將FOX 捕捉系統(tǒng)應(yīng)用在鹽生植物溝葉結(jié)縷草中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)耐鹽性顯著增強(qiáng)的擬南芥表型，通過測(cè)序驗(yàn)證獲得了一個(gè)溝葉結(jié)縷草耐鹽候選基因ZmUBP，通過生物信息學(xué)分析，ZmUBP編碼一個(gè)包含U-box 結(jié)構(gòu)域蛋白，分別與水稻中的OsUBP39（XP_015651212）和擬南芥中的AtUBP38（AT5G65200）的同源性達(dá)到70.52%和32.5%，然而OsUBP39和AtUBP38的耐鹽功能尚無報(bào)道。由此，我們獲得的ZmUBP是一個(gè)新的耐鹽候選基因。本發(fā)明的動(dòng)因就是：將溝葉結(jié)縷草ZmUBP構(gòu)建到植物表達(dá)載體中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得具有耐鹽特性的新種質(zhì)。本專利對(duì)于優(yōu)良作物新品種的培育及在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)背景技術(shù)提出的培育耐鹽新種質(zhì)的問題，本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)新的鹽生植物溝葉結(jié)縷草耐鹽基因ZmUBP。

本發(fā)明的另一目的在于該耐鹽基因ZmUBP的植物表達(dá)載體。

本發(fā)明所構(gòu)建的植物表達(dá)載體可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制耐鹽新種質(zhì)，可用于植物品種改良。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

溝葉結(jié)縷草耐鹽基因ZmUBP，該基因的序列為SEQ ID NO. 1；

含有本發(fā)明所述的溝葉結(jié)縷草耐鹽基因ZmUBP的植物表達(dá)載體，由所述的溝葉結(jié)縷草耐鹽基因ZmUBP與植物表達(dá)載體構(gòu)成；

所述的含有溝葉結(jié)縷草耐鹽基因ZmUBP的植物表達(dá)載體，優(yōu)選為BamHⅠ和Not I 雙酶切ZmUBP后插入到gateway入門載體pENTR1A后與pEarleyGate103表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行重組反應(yīng)得到。

本發(fā)明所述的含有溝葉結(jié)縷草耐鹽基因ZmUBP的植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟。

（1）ZmUBP基因全長的克隆：設(shè)計(jì)引物ZmUBP-F: SEQ ID NO.2和ZmUBP-R: SEQ ID NO.3，以溝葉結(jié)縷草cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒并測(cè)序獲得基因全長序列為SEQ ID NO. 1。

（2）pENTR1A-ZmUBP質(zhì)粒構(gòu)建：設(shè)計(jì)引物ZmUBP-BamHⅠ-F: SEQ ID NO.4和ZmUBP-NotⅠ-R: SEQ ID NO.5，以步驟（1）中的陽性測(cè)序質(zhì)粒為模板，用高保真酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得在上游和下游分別引入BamHⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)的ZmUBP基因，PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒pMD19-T Simple-ZmUBP；BamHⅠ和NotⅠ分別對(duì)陽性質(zhì)粒pMD19-T Simple-ZmUBP和pENTR1A進(jìn)行雙酶切，取酶切后的ZmUBP片段與BamHⅠ和NotⅠ雙酶切的pENTR1A連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞。37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pENTR1A-ZmUBP。

（3）提取的陽性質(zhì)粒pENTR1A-ZmUBP經(jīng)PvuⅠ單酶切線性化后與pEarleyGate103載體質(zhì)粒進(jìn)行LR重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)化，提取陽性質(zhì)粒，電泳檢測(cè)并測(cè)序驗(yàn)證為SEQ ID NO.1，植物表達(dá)載體pEarleyGate103-ZmUBP構(gòu)建成功。

本發(fā)明所述的溝葉結(jié)縷草耐鹽基因ZmUBP在創(chuàng)建耐鹽新種質(zhì)中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的植物表達(dá)載體在創(chuàng)建耐鹽新種質(zhì)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

1．本發(fā)明提供的溝葉結(jié)縷草ZmUBP是一個(gè)新的耐鹽基因，該基因可提高植物耐鹽性；

2．本發(fā)明構(gòu)建的溝葉結(jié)縷草ZmUBP植物表達(dá)載體為首次報(bào)道，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)造耐鹽新種質(zhì)，提高植物的耐鹽性，可進(jìn)行植物品種改良。

附圖說明

圖1 ZmUBP瓊脂糖凝膠電泳分析

M：DNA Marker

1：ZmUBP；

2：pMD19-T Simple-ZmUBP 質(zhì)粒BamH和Not I雙酶切

3：pEarleyGate103-ZmUBP 表達(dá)載體電泳檢測(cè)圖

圖2 植物表達(dá)載體pEarleyGate103-ZmUBP構(gòu)建流程圖

圖3 野生型（WT）與轉(zhuǎn)基因擬南芥（ZmUBP）PCR鑒定

圖4 野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性評(píng)價(jià)

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 溝葉結(jié)縷草ZmUBP的克?。▓D1）。

選用溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）作為材料，選取健康的草皮塊，置于裝滿石英砂的杯中，于1/2 Hongland營養(yǎng)液水培20天后，轉(zhuǎn)入到含300mM NaCl的1/2 Hongland營養(yǎng)液中處理7d，取0.1g幼嫩葉片，參照Trizol RNA提取試劑盒（TaKaRa）說明書方法，提取葉片總RNA，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）取1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNase消化cDNA產(chǎn)物，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ZmUBP；

上游引物ZmUBP-F: 5′-ATGCCAAAGGACAGGAGC-3′（SEQ ID NO.2）；

下游引物ZmUBP-R: 5′-TTGTGCAGGGTCACCGTC-3′（SEQ ID NO.3）。

以提取的葉片cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，20 μL反應(yīng)體系：2×LA RCR Mix 10μL，ZmUBP-F、ZmUBP-R引物各1.0μL（10μmol·L^-1），cDNA模板 1 μL，ddH₂O 7 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃解鏈30 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸2 min，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min；PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒（AXYGEN）回收純化，用T₄DNA連接酶（TaKaRa）連接到pMD19-T Simple載體（TaKaRa），轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒并測(cè)序?yàn)镾EQ ID NO.1。

實(shí)施例2. 植物表達(dá)載體pEarleyGate103-ZmUBP的構(gòu)建（圖1，圖2）。

設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，在目的基因ZmUBP的上游和下游分別引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和NotⅠ，PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒，BamHⅠ和NotⅠ雙酶切的ZmUBP片段與BamHⅠ和NotⅠ雙酶切的pENTR1A連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取的陽性質(zhì)粒經(jīng)NsiⅠ單酶切線性化后與pEarleyGate103載體質(zhì)粒進(jìn)行LR重組反應(yīng)（Invitrogen），轉(zhuǎn)化，提取陽性質(zhì)粒，電泳檢測(cè)并測(cè)序驗(yàn)證為SEQ ID NO.1；

上游引物ZmUBP-BamHⅠ-F：5′-GGATCCGGATGCCAAAGGACAGGAGC-3′（SEQ ID NO.4）；

下游引物ZmUBP-NotⅠ-R：5′-GCGGCCGCGATTGTGCAGGGTCACCGTC-3′（SEQ ID NO.5）。

①以實(shí)施例1中提取的陽性測(cè)序質(zhì)粒作為模板，用高保真酶（PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase，TaKaRa）進(jìn)行PCR反應(yīng)，25μL反應(yīng)體系：10×HS RCR Buffer 2.5μL，ZmUBP-BamHⅠ-F、ZmUBP-NotⅠ-R引物各1.0 μL (10 μmol·L^-1)，dNTP mix 2.0 μL (2.5 mmol·L^-1)，PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase 0.2 μL，cDNA模板 1 μL，ddH₂O 17.3μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃解鏈30 sec，60 ℃退火30 sec，72 ℃延伸2min，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min；PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒（AXYGEN, USA）回收，連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒pMD19-T Simple-ZmUBP并測(cè)序驗(yàn)證。

②取gateway入門載體pENTR1A (Invitrogen) 和pMD19-T Simple-ZmUBP用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，雙酶切體系（40 μL）：10×K Buffer 2 μL，0.1% BSA 4 μL，質(zhì)粒pENTR1A或pMD19-T Simple-ZmUBP15 μL，BamHⅠ2 μL，NotⅠ2 μL，ddH₂O 15 μL；37 ℃反應(yīng)2 h；雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠回收試劑盒（AXYGEN）回收質(zhì)粒pENTR1A大片段和pMD19-T Simple-ZmUBP小片段。用TaKaRa連接體系連接兩個(gè)回收的產(chǎn)物，反應(yīng)體系（5 μL）：SolutionⅠ2.5 μL，pENTR1A大片段0.5 μL，pMD19-T Simple-ZmUBP小片段2 μL；16 ℃連接2h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞。37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pENTR1A-ZmUBP。

③取質(zhì)粒pENTR1A-ZmUBP用PvuⅠ單酶切，酶切體系（40 μL）：10×K Buffer 4 μL，質(zhì)粒pENTR1A-ZmUBP 15 μL，PvuⅠ2 μL，ddH₂O 19 μL；37 ℃反應(yīng)2 h，用凝膠回收試劑盒（AXYGEN）回收質(zhì)粒pENTR1A-PvuⅠ片段。將回收的片段與pEarleyGate103載體質(zhì)粒進(jìn)行LR重組反應(yīng)，反應(yīng)體系（5 μL）：pENTR1A-ZmUBP大片段3 μL，pEarleyGate103質(zhì)粒1 μL，LR Clonase^TMⅡ enzyme mix 1 μL；25 ℃反應(yīng)1 h，加入1 μL Proteinase K，37 ℃反應(yīng)10 min；重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pEarleyGate103-ZmUBP，電泳和測(cè)序驗(yàn)證為SEQ ID NO.1。植物表達(dá)載體pEarleyGate103-ZmUBP的構(gòu)建成功。

實(shí)施例3 植物表達(dá)載體pEarleyGate103-ZmUBP遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥及其耐鹽性鑒定（圖3，圖4）。

①農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)制備及凍融法轉(zhuǎn)化：從YEB（50 μg/mL 利福平）平板上挑取EHA105單菌落，接種于50 mL 含50 μg/mL 利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，220 rpm，28℃培養(yǎng)至OD值0.6，而后冰浴菌液30 min，離心收集菌體，懸浮于2 mL預(yù)冷的100mM CaCl₂（20%甘油）溶液中，200 μL/管分裝，待用。取5 μL pEarleyGate103-ZmUBP載體質(zhì)粒，加入100 μL 感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30 min，液氮冷凍5 min，37℃ 5 min，加入800 μL YEB 液體培養(yǎng)基，28℃ 200 rpm預(yù)培養(yǎng)3 h，菌液涂板于YEB（50 μg/mL 利福平 + 50 μg/mL卡那霉素）固體培養(yǎng)基上，28℃ 暗培養(yǎng)2天，挑取單克隆檢測(cè)，選取陽性克隆搖菌，用于擬南芥花序轉(zhuǎn)化。

②擬南芥花序浸染及種子采收：將陽性單克隆接到50 mL 的YEB（50 μg/mL 利福平 + 50 μg/mL卡那霉素）液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)36小時(shí)，5000 rpm離心20分鐘，然后用轉(zhuǎn)化液（5%蔗糖+500uL/L的Silwet L-77）劇烈懸浮沉淀至完全懸起。將擬南芥地上部分直接浸泡于上述懸浮液中1分鐘，然后用保鮮膜完全包裹植株以保濕，放回培養(yǎng)室培養(yǎng)24小時(shí)，打開保鮮膜，待種子成熟時(shí)采收。

③種子消毒于播種：將種子放入5mL的離心管中，加入50%巴斯消毒液，添加0.1%的Triton X-100搖晃15分鐘，然后在超凈臺(tái)中用無菌水洗5次，而后直接把種子倒在滅菌過的濾紙上，吹干種子（放置1小時(shí)），輕輕敲擊濾紙將干種子均勻撒播到篩選培養(yǎng)基（1/2MS + 20mg/L 草胺磷 + 25mg/L氨芐青霉素）篩選培養(yǎng)10天，然后將抗性苗移栽到土中，用透明的蓋子覆蓋幼苗1周以保濕。待抗性苗7～8片葉，提取擬南芥葉片DNA，PCR（引物ZmUBP-F和ZmUBP-R）鑒定（圖3）。

④耐鹽評(píng)價(jià)：經(jīng)PCR鑒定的T1代轉(zhuǎn)基因苗繼續(xù)生長，采收T2代種子。對(duì)野生型和T2代抗性轉(zhuǎn)基因擬南芥置于鹽處理（0mM和120mM NaCl+MS培養(yǎng)基）生長14天，發(fā)現(xiàn)3個(gè)轉(zhuǎn)ZmUBP基因擬南芥的生長明顯優(yōu)于野生型擬南芥（圖4），耐鹽性顯著提高。

綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建了含有耐鹽基因的植物表達(dá)載體pEarleyGate103-ZmUBP，其中ZmUBP首次報(bào)道。所構(gòu)建的載體可導(dǎo)入植物中，提高植物的耐鹽特性。

<110> 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所

<120> 一個(gè)新的植物耐鹽基因ZmUBP及其表達(dá)載體和應(yīng)用

<160> 5

<210> 1

<211> 1704

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草耐鹽基因ZmUBP核苷酸序列

<400> 1

atgggtgcggccggtccgcgacgcagctggaagctgccgttccaccgcagctggaccagc 60

agcagcagcagcgcaccgtcctcgccgtcgccggtcagcaagtcctcagcggcggcgccc 120

tgctcgccggcgcggtcggcggcgtgggccgaggagcgggcgcgggacgaggccgtgccg 180

ccggagtttgtctgcccgatctccggcgacatgatggcggacccggtcatcctgccgtcg 240

gggcggacgtacgagcgcgcgtgcctcagggcctgcgcgcagctcgcgttcttgccgccc 300

ggcgtggagtctggggctgccgacacgatgattccgaacacggcgctcaaggcggctata 360

ggatcttggtgcgctcgtactggccgggacctgccggctcggccgtccgtcgacgcggcg 420

cgggagaccgtgctaagggtgatgcgaccggcggaggtggcggcgaagtctgcgcggacg 480

aatagggcgcgggcgagctcgtcgaactcctcgtactcggcgtcaacgacgtcgtacggt 540

tcatcctcggaaatcgccgcggcagaggatcatgagaggggcggaagaatacccgtcaag 600

gagacgacggtacaggtggaggcggcggcggctgtcgacccgctggaggacgaggttgtg 660

gcgaaggtgatggaggcggacgacgaggaggtggtgacgtcagttatggcgacgctccgt 720

gacgccacgcggcagagcgcggagcggcggcgctcgctgtgcacgccgcggctgctgggc 780

gcgctgcgccgcgtcctgctgctccaccggcacgcgccggcgcgggtggacgcggcggcg 840

gcgctcgtcaacctgtccctcgagccgggcaacaaggtccgcatcgtgcgggccggcgcg 900

gtgccggcgctcgtcgagacgctccgctcggggagctcggcgccggaggcgcgggagcac 960

gcggcgggcgcgctgttcgggctggcgctgaacgaggacaaccgcgcggccatcggcgtg 1020

ctcggagcggtgcctccgctcctcgacctcctcgcctcccccgagcagccggcccgcgcg 1080

cgccgcgacgccgggatggcgctgtaccacctctcgctggccgccgtcaaccagtccaag 1140

atcgcgcggttccccggcgcgcccaaggcgctgctcagcgtcgcgtcctgtgattccgag 1200

cctgcccccatccgcaggctcgcgctcatggtcacctgcaacgtctgcgcctgcgccgag 1260

ggccgcgccgcgctgatggacgcgggcgcggtcgcgtccgtctccggcatcctctcctct 1320

tcaccaacaacaccccacgacgccgacgacgccaccgggagcagcagccgcgtggacctc 1380

gaggagtggtgcgtggcggcgctgtacgcgatgagccgcggcagcctccggttccgcggc 1440

ctcgcgcgcgccgccggagccgacaaagcgctccgtcgcgtggccgaggagggcggcggc 1500

gtccggcgcgaaatggcgaagaagactctccgcgccatgcgcggcgacctggacgaggat 1560

gagaaggacgacctgacaggcagcagcctcgagtgcggcgacggcgaggactgcggcggc 1620

agcatcgtctcggacggcctcatgtcgttccggcgccggcagcgggagctcggcgtgaat 1680

tcttgcggcgacaccgccgagttc 1704

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> PCR反應(yīng)擴(kuò)增ZmUBP基因用上游引物ZmUBP-F

<400> 2

atgggtgcgg ccggtccgcg a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> PCR反應(yīng)擴(kuò)增ZmUBP基因用下游引物ZmUBP-R

<400> 3

gaactcggcg gtgtcgccgc a 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> PCR反應(yīng)擴(kuò)增ZmUBP基因引入BamH I酶切位點(diǎn)用上游引物ZmUBP-BamH I-F

<400> 4

ggatccggat gggtgcggcc ggt 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> PCR反應(yīng)擴(kuò)增ZmUBP基因引入Not I酶切位點(diǎn)用下游引物ZmUBP- Not I-R

<400> 5

gcggccgcga gaactcggcg gtgtc 25