專利名稱：日本結縷草高頻基因槍轉化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程領域，具體地，涉及日本結縷草基因槍轉化方法。
背景技術：
日本結縷草(Zoysia japonica Steud.)是禾本科優(yōu)質暖季型草坪草，在現(xiàn)代城市綠化和運動場建設及水土保持中，都占有重要地位，但日本結縷草也有苗期生長緩慢、對某些生物及非生物脅迫抵御能力差等缺點，而綠期短則已經成為限制其大量應用的瓶頸。全世界草坪草育種學家多年來一直致力于日本結縷草新品種的培育，但多采用傳統(tǒng)育種方法，由于日本結縷草離體培養(yǎng)困難，轉基因相關研究很少，也不系統(tǒng)，缺乏對轉化過程中各個參數(shù)的研究，轉化的也多為報告基因，抗旱、耐寒、耐鹽等抗性功能基因轉化尚屬空白?；驑屴D化法是目前較為常用的一種轉化方法，避開了原生質體再培養(yǎng)的困難，克服了農桿菌的宿主限制，受體材料來源廣泛，加之其方法操作簡單，在草坪草遺傳轉化過程中應用廣泛。本發(fā)明對基因槍轉化日本結縷草的具體的轉化參數(shù)進行系統(tǒng)研究，并且把能綜合提高植物抗旱、耐鹽耐寒的DREB1A基因轉入日本結縷草胚性愈傷組織中，得到了轉基因植株。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供日本結縷草高頻基因槍轉化方法，以提高結縷草的轉化效率。
本發(fā)明方法選擇日本結縷草胚性愈傷組織為轉化受體；以單因素試驗和正交試驗設計對基因槍轉化日本結縷草的具體因素進行篩選與優(yōu)化，確定基因槍轉化法的具體參數(shù)；并進一步確定了轉化子篩選方案。
本發(fā)明結縷草基因槍轉化法，選用直徑1μm的金粉、每槍250μg金粉+0.5μg DNA、5cm的轟擊距離、轟擊3次。轟擊壓力為1100psi。
轉化受體可以為結縷草成熟種子或者其他外植體誘導形成的胚性愈傷組織，選擇誘導4個月、繼代培養(yǎng)25d左右的胚性愈傷組織作為靶材料進行基因槍轟擊，靶材料在轟擊前4h至轟擊后12h間，培養(yǎng)于含有甘露醇及山梨醇各0.2M的高滲培養(yǎng)基上。
愈傷組織經轟擊后采用延遲篩選的方式，根據(jù)選擇標記確定篩選方案。
進一步地，本發(fā)明確立了日本結縷草的潮霉素篩選方案。具體地說，將含有潮霉素抗性標記的表達載體轉入植物受體后，恢復培養(yǎng)5d，然后轉入含有50mg/L潮霉素的愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2個月，每月繼代一次，轉入潮霉素濃度為30mg/L的抗性植株再生培養(yǎng)基中。
本發(fā)明對日本結縷草基因槍轉化方法進行了系統(tǒng)的研究，獲得較高的轉化效率。具體包括1)基因槍轉化過程中，在轟擊壓力一定的情況下，基因槍轉化受多個因素的綜合影響，本專利運用單因素試驗設計研究了金粉直徑、受體處理、受體狀態(tài)等因素的影響，并且以正交試驗設計綜合考察了金粉與DNA用量、轟擊高度、轟擊次數(shù)綜合效果。找到了最佳的基因槍轟擊參數(shù)，建立了高效的轉化體系。
2)將含有潮霉素抗性標記的表達載體轉入植物受體后，要對轉化子進行抗生素篩選，本發(fā)明對潮霉素濃度進行篩選，確立了日本結縷草的潮霉素篩選方案，可應用于含有潮霉素抗性標記的表達載體轉入日本結縷草后，進行轉化體的初步篩選鑒定。
3)將DREB1A-GUS雙基因表達載體成功轉入日本結縷草培訓愈傷組織中，證明了這種方法的可靠性與實用性。


附圖1 DREB1A-GUS雙基因表達載體結構圖；附圖2愈傷組織中GUS瞬時表達；附圖3潮霉素抗性愈傷中GUS的穩(wěn)定表達；附圖4篩選培養(yǎng)基中抗性愈傷組織的生長；附圖5潮霉素抗性植株再生；附圖6 GUS在轉基因植株根中的表達；附圖7移栽后的轉基因植株；附圖8轉DREB1A植株PCR分析，圖中1～5為轉化植株；6為未轉化植株；7為質粒；8為分子量標準DL2000；附圖9轉DREB1A基因抗性植株PCR-Southern雜交結果，圖中1為陽性對照；2為未轉化植株；3～12為抗性植株；附圖10轉DREB1A基因抗性植株的Southern雜交結果，圖中1為轉化植株；2為未轉化植株；3為質粒；4為分子量標準DL2000。
具體實施例方式1材料和方法1.1植物材料日本結縷草品種‘Zenith’、‘Liaoning’、‘Qingdao’(Zenith’種子購自美國TMI公司(Turf Merchants，Inc)，‘Liaoning’、‘Qingdao’品種種子購自北京市種子公司)成熟種子以次氯酸鈉溶液(北京化工廠生產，＞5％活性氯，加入1滴吐溫20)在磁力攪拌器上消毒1小時，以無菌水沖洗3～5次，4℃下浸泡3d，再以次氯酸鈉溶液消毒20min，無菌水沖洗3次后，用無菌濾紙吸干多余水分，接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，黑暗狀態(tài)下28℃誘導愈傷。愈傷組織每月繼代一次，繼代時挑選白或黃色、顆粒狀愈傷組織轉接到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，作為基因轉化的受體材料。
1.2表達載體結構圖見附圖1，雙基因表達載體pCAMBIA1301(CAMBIA)，包含DREB1A和gus基因，分別由ubi及CaMV35S啟動子驅動，篩選基因為hph，由CaMV35S啟動子調控。該表達載體北京林業(yè)大學草坪草實驗室構建并保存。
1.3基因槍轉化因素的確定采用美國Bio-Rad公司的PDS-1000/He型基因槍，具體操作方法參照說明書進行。通過統(tǒng)計抗性愈傷率、GUS染色率為指標對金粉粒徑、金粉與DNA用量、轟擊高度、轟擊次數(shù)、滲透處理、受體狀態(tài)等因素進行探討，獲得最佳的轟擊方法。
1.4篩選壓的確定將狀態(tài)相同的日本結縷草胚性愈傷組織轉入含不同濃度潮霉素的愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，并測量愈傷初重，30d后測量愈傷終重，用未加潮霉素的處理作對照，觀察愈傷組織生長狀況。以愈傷增重率繪制潮霉素對愈傷組織生長影響曲線(killing curves)，確定愈傷組織篩選培養(yǎng)基中的篩選壓。將‘Zenith’品種的胚性愈傷組織接種于含不同濃度潮霉素的植株再生培養(yǎng)基上，1個月后統(tǒng)計植株再生率，以未加潮霉素的處理作對照，觀察潮霉素對愈傷組織分化的影響，確定抗性植株再生培養(yǎng)基中的潮霉素濃度。
1.5轉化植株的篩選再生轉化后16h，將轟擊過的愈傷組織轉至無滲透壓的愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，恢復培養(yǎng)5d后(考察延遲篩選對轉化效率影響的實驗中，直接轉入篩選培養(yǎng)基)，轉入愈傷組織篩選培養(yǎng)基，每月挑選生長旺盛的愈傷組織繼代到相同的培養(yǎng)基上。2個月后，將潮霉素抗性愈傷組織轉到抗性愈傷再生培養(yǎng)基上，誘導體胚發(fā)生和植株再生。約1個月后，待小植株出現(xiàn)，將其轉入不含潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基中壯苗。根系強壯后，煉苗3d，然后小心洗去植株根部瓊脂，移栽入由砂(0.25～0.5mm)與草炭土混合基質中，混合比例9∶1。
1.6 GuS表達的檢測轉化后40h，對轉化的受體進行組織化學染色，觀測愈傷組織中GUS基因的瞬時表達，在Olympus體視顯微鏡下觀察染色情況；2個月后，對潮霉素抗性愈傷組織進行組織化學染色，觀測GUS基因的穩(wěn)定表達。染色方法參考Jefferson方法(Jefferson Richard A，Tony A.Kanvanagh and Michael W.Bevan.Gus fusionsβ-glucuronidaseand a sensitive and versatile gene[J].The EMBO Journal，1987，6(13)3901-3907)，以未轉化愈傷組織作對照。
1.7轉化植株的分子檢測采用SDS法提取抗性植株的植物組DNA，后進行PCR擴增分析及Southern印跡雜交。
DREB1A引物序列引物F5’＞AAA GGA TCC TTA CCC GGG TTC TGA TCA ATGAAC TCA TTT TCT G＜3’，引物R5’＞AAA GGT ACC AAT CCC GGG GTT TTA ATA ACTCCA TAA CGA TAC G＜3’反應體系采用25μl反應體系，具體如下10×Taq buffer 2.5μLdNTP 2.0μL引物F+R2×1.0μLTaq酶 0.5μL模板(質粒和代測植物)DNA1μLddH2O 17μL總體積 25μL反應條件

2結果與分析2.1篩選壓的確定將日本結縷草的愈傷組織接種于含不同濃度潮霉素(30、50、70和90mg/L)的培養(yǎng)基上，稱量初重，5周后稱量愈傷組織終重，計算愈傷增重率，以未添加潮霉素的處理作對照，測定潮霉素對愈傷組織生長的影響。將胚性愈傷組織接種于含不同濃度潮霉素的植株再生培養(yǎng)基中，以不含潮霉素的處理作對照，測定潮霉素對植株再生的影響。
表1 潮霉素對愈傷組織生長與植株再生的影響

結果可見，對于日本結縷草的基因槍轉化，在愈傷組織篩選階段選用50mg/L的潮霉素濃度，植株再生培養(yǎng)基中降至30mg/L，效果較好。
2.2基因槍轉化參數(shù)的多因素正交實驗在1100psi的轟擊壓力下，設計不同的基因槍轉化處理，轟擊后40h觀測愈傷組織中GUS基因的瞬時表達，統(tǒng)計并計算瞬時表達率。試驗設計及結果見表2。
表2 基因槍轉化參數(shù)試驗設計及結果


可見，金粉和DNA用量分別為250μg和0.5μg、轟擊距離5cm、轟擊次數(shù)3次的組合，GUS瞬時表達率最高，說明該組合最適于日本結縷草基因槍轉化。
2.3金粉直徑對轉化效率的影響分別以直徑為0.6μm及1μm的金粉包被DNA，以1100psi的轟擊壓力、5cm的轟擊距離和轟擊3次的基因槍轉化參數(shù)轉化受體材料，轟擊后40h進行組織染色，觀察GUS的瞬時表達，以愈傷組織染色率考察金粉直徑對轉化效果的影響。
表3 金粉直徑對基因槍轉化GUS瞬時表達的影響

由表3可見，使用直徑為0.6μm的金粉，愈傷組織的GUS瞬時表達率僅為21.23％，遠遠低于使用直徑1μm金粉的處理(75.04％)。數(shù)據(jù)經反正弦變換后進行方差分析，結果表明兩種直徑的金粉處理差異顯著(P＜0.05)。因此，在日本結縷草基因槍轉化中選用直徑為1μm的金粉。
2.4滲透處理對轉化效率的影響基因槍轟擊前4h，將日本結縷草愈傷組織轉至高滲透壓培養(yǎng)基上(含山梨醇、甘露醇各0.2M)，轉化后16h，再將愈傷轉移至無滲透壓及篩選壓的愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，恢復培養(yǎng)5d后再進行潮霉素選擇培養(yǎng)，以篩選1個月后的抗性愈傷率作為考察指標，每處理3個重復，以未經過滲透處理的愈傷以同樣方法轉化作對照。
表4 滲透處理對基因槍轉化抗性愈傷率的影響Tab.3-4 Effect of Osmotic Treatment on Calli Survival Rates following Biolistic Bombardment

表中數(shù)據(jù)經反正弦變換后進行方差分析，結果顯示滲透處理與非滲透處理間在0.05水平上有顯著差異。從均值來看，經過滲透處理抗性愈傷率(32.52％)高于非滲透處理(24.24％)。
2.5受體狀態(tài)對轉化效率的影響在日本結縷草胚性愈傷組織不同生長時期內，分別以250μg+0.5μg的金粉和DNA用量、5cm轟擊距離、每皿轟擊3次的參數(shù)做轉化，統(tǒng)計抗性愈傷率及抗性植株率，結果如表5所示。
表5 愈傷生長時期對基因槍轉化抗性愈傷率的影響


注a.抗性愈傷率＝抗性愈傷數(shù)/靶組織塊數(shù)×100％；b.抗性植株獲得率＝抗性株系數(shù)/靶組織塊數(shù)×100％可見，在生長時期分別為4、6、8和12個月的愈傷組織的基因槍轉化中，生長時期為4個月的愈傷組織所得到的抗性愈傷率和抗性植株率最大，分別為28.4％和5.6％，隨著愈傷組織繼代時期的增加，抗性愈傷率和抗性植株率總體呈下降的趨勢，至愈傷生長12個月時，沒能獲得抗性植株。
3.結論3.1建立了日本結縷草抗性愈傷組織的篩選方案。對于基因槍法，采用延遲篩選的方式，愈傷組織轟擊后恢復培養(yǎng)5d，然后轉入含有50mg/L潮霉素的愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2個月，每月繼代一次，轉入潮霉素濃度為30mg/L抗性植株再生培養(yǎng)基中。
3.2建立了高效的日本結縷草基因槍轉化體系。其技術要點為選用直徑為1μm的金粉、每槍250μg金粉+0.5μg DNA、5cm的轟擊距離、轟擊3次的基因槍轉化參數(shù)，選擇誘導4個月、繼代培養(yǎng)25d左右的胚性愈傷組織進行基因槍轟擊，靶材料在轟擊前4h至轟擊后12h間，培養(yǎng)于含有0.2M的甘露醇及0.2M的山梨醇高滲培養(yǎng)基上。
3.3運用已經建立的遺傳轉化體系進行日本結縷草的遺傳轉化，獲得了轉入DREB1A基因的日本結縷草轉基因植株，是一次成功的運用實例。
權利要求
1.日本結縷草高頻基因槍轉化方法，其特征在于，選擇胚性愈傷組織作為轉化受體進行基因槍轉化，轉化采用直徑為0.6-1μm的金粉、每槍250μg金粉+0.5μg DNA、5cm的轟擊距離、轟擊1-3次的基因槍轉化參數(shù)。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，基因槍轉化采用直徑為1μm的金粉，5cm的轟擊距離轟擊3次。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，選擇誘導4個月、繼代培養(yǎng)23～27天的胚性愈傷組織進行基因槍轟擊，靶材料在轟擊前4h至轟擊后12h間，培養(yǎng)于含有0.2M的甘露醇及0.2M的山梨醇高滲培養(yǎng)基上。
4.一種制備轉基因日本結縷草的方法，其特征在于，該包括如下步驟1)采用權利要求1～3所述的方法進行基因槍轉化；2)篩選轉化子。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述轉化使用含有潮霉素抗性標記的表達載體。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，篩選轉化子的方法是轉化后16h，轟擊后的愈傷組織繼續(xù)在高滲培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h，然后應用延遲篩選方案，轉入不含篩選壓的愈傷組織繼代培養(yǎng)基上恢復培養(yǎng)5d，再轉移至含有50mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上篩選2個月，每月繼代一次；將獲得的抗性愈傷組織轉入潮霉素濃度降至30mg/L的抗性植株再生培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明提供了結縷草高頻基因槍轉化方法，建立了一套完整、高效的遺傳轉化體系。本發(fā)明基因槍法轉化的具體參數(shù)是選用直徑為1μm的金粉、每槍250μg金粉+0.5μg DNA、5cm的轟擊距離、轟擊3次的基因槍轉化參數(shù)，選擇誘導4個月、繼代培養(yǎng)25d左右的胚性愈傷組織進行基因槍轟擊，靶材料在轟擊前4h至轟擊后12h間，培養(yǎng)于含有0.2M的甘露醇及0.2M的山梨醇高滲培養(yǎng)基上。本發(fā)明還進一步將可綜合提高植物抗旱、耐寒、耐鹽性的DREB1A基因轉入日本結縷草胚性愈傷組織中，獲得了轉基因植株。并且確立了結縷草轉化子的潮霉素篩選方案。
文檔編號C12N15/82GK101045935SQ200710064240
公開日2007年10月3日 申請日期2007年3月7日 優(yōu)先權日2007年3月7日
發(fā)明者韓烈保, 齊春輝, 梁小紅, 劉君, 王維飛, 曾會明 申請人:北京林業(yè)大學, 韓烈保, 齊春輝