一種先天性Axenfeld–Rieger綜合征基因檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種先天性Axenfeld–Rieger綜合征基因檢測試劑盒，一個(gè)與先天性Axenfeld–Rieger綜合征密切相關(guān)的PITX2基因的全新位點(diǎn)，即c.77delA的改變，缺失腺嘌呤堿基的為先天Axenfeld–Rieger綜合征易感人群。本發(fā)明利用該位點(diǎn)檢測先天性Axenfeld–Rieger綜合征試劑盒為先天性Axenfeld–Rieger綜合征疾病的基因診斷工作帶來了顯著的便利。本發(fā)明有助于快速檢測出先天性Axenfeld–Rieger綜合征，同時(shí)也為Axenfeld–Rieger綜合征家系成員提供基因診斷、基因治療以及產(chǎn)前診斷的基因位點(diǎn)。
【專利說明】—種先天性Axenfeld - Rieger綜合征基因檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基因檢測試劑盒,具體涉及一種先天性Axenfeld - Rieger綜合征基因檢測試劑盒，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]Axenfeld-Rieger綜合征(ARS)是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，發(fā)病率為1:200000。其主要臨床癥狀為:
[0003]角膜
[0004]典型的改變?yōu)榻悄ず笈咛キh(huán)，即Schwalbe線增殖突出和前移，從角膜前面或用裂隙燈顯微鏡可見靠近角膜緣的角膜后面有一條白色的線或環(huán)，局限在某一部位(顳側(cè)最常見)或呈360°角膜后胚胎環(huán)在一般人群中有8%~15%可見。也有少數(shù)患者無角膜后胚胎環(huán)但有本綜合征的其他眼部和全身異常者?；颊叱悄ぶ苓叢扛淖兺馄渌课痪该?，偶有大角膜或小角膜少數(shù)患者可見到角膜中央部有先天性混濁。如患者長期患青光眼，年齡較大特別是做過內(nèi)眼手術(shù)者，角膜內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)目、形態(tài)和大小可呈輕-中度改變。
[0005]虹膜角膜角
[0006]用前房角鏡檢查可見典型的突出的Schwalbe線，有條帶自虹膜周邊部跨越房角附于其上。條帶的顏色和質(zhì)地與虹膜組織類似，粗細(xì)不一，有的呈斷裂狀。一端附于角膜另一端附于虹膜。每個(gè)象限可有I~2條或幾條組織條帶，而有些則整個(gè)環(huán)周小梁網(wǎng)均被組織條帶遮蓋。此種組織條帶的多少與房水滲出通道受阻有無直接關(guān)系尚無結(jié)論。在組織條帶的稍遠(yuǎn)處房角開放，可以看見小梁網(wǎng)，但因周邊虹膜附著高位看不清鞏膜突，虹膜終止于小梁網(wǎng)后部。
[0007]虹膜
[0008]除了周邊虹膜的異常外A-R綜合征中有些眼的虹膜正常(傳統(tǒng)分類中屬于Axenfeld異常)。其他病例虹膜的缺損從輕度的基質(zhì)變薄到明顯的虹膜萎縮，并有孔洞形成瞳孔異位，色素膜外翻(傳統(tǒng)分類中屬于Rieger異常)等。當(dāng)有瞳孔異位時(shí)在裂隙燈顯微鏡下可見瞳孔向一個(gè)明顯的周邊組織條帶處移位，虹膜萎縮和孔洞形成則在遠(yuǎn)離瞳孔異位方向的象限少數(shù)患者虹膜異位改變會(huì)逐漸發(fā)展，包括瞳孔異位或變形，虹膜變薄或裂孔形成，周邊虹膜組織條帶變粗等。
[0009]青光眼
[0010]約有半數(shù)A-R綜合征患者發(fā)展為青光眼，可在嬰兒期顯示，但更多見于兒童或青年。多發(fā)生在有虹膜組織條帶的患者，但組織條帶的多少與發(fā)生青光眼是否呈正比尚未得到證實(shí)。并發(fā)癥:
[0011]A-R綜合征可以出現(xiàn)非特征性的一些眼部改變，如:斜視、角膜緣皮樣瘤、白內(nèi)障、視網(wǎng)膜脫離、黃斑變性、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜缺損、脈絡(luò)膜發(fā)育不良及視盤發(fā)育不良等。
[0012]全身異常
[0013]ARS患者全身的異常，最典型的是牙齒和面額部的發(fā)育異常、臍周贅皮，另外亦可伴有聽力障礙，尿道下裂，身材短小，腦垂體異常等。
[0014]目前對(duì)于先天性Axenfeld - Rieger綜合征的檢測國際上尚無統(tǒng)一的檢測方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明的目的在于提供一種先天性Axenfeld - Rieger綜合征基因檢測試劑盒。本發(fā)明克服了現(xiàn)有基因檢測技術(shù)中的缺點(diǎn)，利用c.77delA位點(diǎn)(指PITX2基因cDNA的第77個(gè)腺嘌呤堿基的缺失)提供了一種可以迅速的檢測先天性Axenfeld - Rieger綜合征,為先天性Axenfeld - Rieger綜合征的基因診斷工作帶來了顯著的便利。為預(yù)防下一代發(fā)病并提高全社會(huì)人口質(zhì)量作出巨大貢獻(xiàn)，對(duì)于社會(huì)發(fā)展有更深遠(yuǎn)的意義。
[0016]—種先天性Axenfeld - Rieger綜合征基因檢測試劑盒,其特征在于,所述的檢測試劑盒中包括PITX2基因的一對(duì)特異性引物，所述引物的核苷酸序列為SEQ ID.1和SEQID.2。
[0017]上述先天性Axenfeld - Rieger綜合征基因檢測試劑盒還包括以下PCR反應(yīng)體系所需的成分:
[0018]10 X PCR 緩沖液；
[0019]dNTP 混合物；
[0020]5U/ul Taq plus DNAase ；
[0021]ddH20。
[0022]進(jìn)一步的，上述先天性Axenfeld - Rieger綜合征基因檢測試劑盒還包括以下成分: [0023]細(xì)胞裂解液；
[0024]蛋白酶K;
[0025]飽和NaCL ；
[0026]體積比為25:24:1的酚、氯仿和異戊純的混合物；
[0027]冷無水乙醇；
[0028]I.0%的瓊脂糖凝膠。
[0029]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0030]由于先天性Axenfeld - Rieger綜合征目前尚無有效的快速檢測方法，本發(fā)明利用c.77delA可以對(duì)ARS高風(fēng)險(xiǎn)胎兒進(jìn)行準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷，利用該突變作為潛在的候選靶位，對(duì)先天性Axenfeld - Rieger綜合征做出快速檢測。在知情者同意的原則下對(duì)患病胎兒選擇性終止妊娠是幫助ARS家系成員生育健康后代的可行辦法。本發(fā)明可以非常迅速的進(jìn)行先天性Axenfeld - Rieger綜合征的檢測,操作簡單，結(jié)果直接、準(zhǔn)確，成本低，特別適合臨床推廣應(yīng)用，為臨床和科研工作提供了一種非常有價(jià)值的檢測方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為先天性Axenfeld - Rieger綜合征患者測序峰圖與正常對(duì)照組測序峰圖?！揪唧w實(shí)施方式】
0032]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0033]實(shí)施例1本發(fā)明先天性Axenfeld - Rieger綜合征基因檢測試劑盒
[0034]1、DNA 的提取
[0035](I)向500 μ I抗凝血中加入Iml細(xì)胞裂解液,混勻，3000rpm離心5min ；
[0036](2)重復(fù)步驟(1)至紅細(xì)胞全部破碎，取細(xì)胞沉淀備用；
[0037](3)向細(xì)胞沉淀中分別加入STE300y 1，20% SDS20 μ 1，混勻，振蕩后，加入蛋白酶Κ15μ KlOmg / ml)，置 50°C 水浴過夜(12-16 小時(shí))；
[0038](4)從水浴中取出樣品，加入100 μ I飽和NaCL(6mol / L)，振蕩，可見白色沉淀析出，5000rpm 離心 5min ；
[0039](5)將上清移至另一干凈的離心管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(酚、氯仿、異戊醇的體積比為25:24:1)后，振蕩，5000rpm離心8min ;取上清后加入3倍體積的冷無水乙醇，輕輕倒轉(zhuǎn)晃動(dòng)；
[0040](6)將離心管8000rpm離心lOmin，倒出冷乙醇，將離心管倒置于濾紙上，利用離心濃縮儀去除水分；
[0041](7)加入200 μ I超純水，4°C儲(chǔ)存；如果短期不用，將DNA分裝，于20°C凍存；
[0042](8)取提取的基因組，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定含量。(另外取已溶解的基因組，上樣于1.0 %的瓊脂糖凝膠，進(jìn)行電泳)
[0043]2、用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增PITX2基因的編碼區(qū)
[0044]將提取的基因組150ng以PITX2基因特異性引物進(jìn)行PCR，所述特異性引物的核苷酸序列為SEQ ID.1和SEQ ID.2 ；PCR結(jié)束后，取5 μ IPCR產(chǎn)物于I %的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。
[0045]PCR反應(yīng)體系:
[0046]DNA 模板 150ng ；
[0047]IOXPCR 緩沖液 5 μ I ;
[0048]dNTP 混合物(ΙΟμπιοΙ / Leach) 4 μ I ；
[0049]特異性引物(上游引物和下游引物)(均為10 μ mol / L)各I μ I ;
[0050]Taq PlusI DNAase (5U / ul) 0.5 μ I ；
[0051](1(1!120補(bǔ)至50口1。
[0052]依次加入以上各反應(yīng)物，混勻后輕微離心，于基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR。PCR條件為95°C預(yù)變性5min ；35個(gè)循環(huán)反應(yīng)，每一個(gè)循環(huán)反應(yīng)為94°C預(yù)變性30s，60°C退火反應(yīng)30s，72°C延伸反應(yīng)45s ;最后72°C延伸反應(yīng)lOmin。`
[0053]3、將所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，測序圖譜分析軟件聯(lián)合NCBI基因庫序列分析查突變位置，如圖1所示，對(duì)患者進(jìn)行PITX2基因正反方向測序(圖1A、圖1B)，結(jié)果在黑色標(biāo)記處出現(xiàn)了雙峰，將正反方向測序正確的峰圖拼接與正常人測序峰圖(圖1C)比對(duì)可見在黑色標(biāo)記處缺失了一個(gè)堿基A，先天性Axenfeld - Rieger綜合征患者的PITX2基因cDNA序列(c.77delA)為 SEQ N0.3。
【權(quán)利要求】
1.一種先天性Axenfeld - Rieger綜合征基因檢測試劑盒,其特征在于，所述的檢測試劑盒中包括PITX2基因的一對(duì)特異性引物，所述引物的核苷酸序列為SEQ ID.1和SEQID.2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的檢測試劑盒還包括以下成分: 10 X PCR緩沖液； dNTP混合物；
5U/ul Taq plus DNAase ；
ddH20。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的檢測試劑盒還包括以下成分: 細(xì)胞裂解液； 蛋白酶K ; 飽和NaCL ； 體積比為25:24:1的酚、氯仿和異戊純的混合物； 冷無水乙醇； .1.0%的瓊脂糖凝膠。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103834731SQ201410057930
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月20日
【發(fā)明者】原慧萍, 胡瑩 申請(qǐng)人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)