本發(fā)明屬于棉花分子育種
技術(shù)領(lǐng)域：
：，涉及到一種棉花多基因聚合育種材料的分子檢測(cè)方法，是一種快速棉花育種材料的分子檢測(cè)方法，主要用于轉(zhuǎn)高產(chǎn)（高衣分FBP：：IaaM）和抗蟲等重要基因棉花品系聚合育種過程中棉花材料的分子檢測(cè)。
背景技術(shù)：
：：棉花是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的重要戰(zhàn)略物資，是僅次于糧食的第二大農(nóng)作物，涉及到農(nóng)業(yè)和紡織工業(yè)兩大產(chǎn)業(yè)，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中起著重要作用。近年來，在國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）、高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）和轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)等項(xiàng)目的支持下，以改良品質(zhì)、提高產(chǎn)量、增強(qiáng)抗逆性等為特征的在第二代轉(zhuǎn)基因技術(shù)在棉花遺傳改良中取得了突破性進(jìn)展，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所、西南大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)等單位在轉(zhuǎn)基因高衣分棉花材料（轉(zhuǎn)FBP：：IaaM基因）（ZhangM.etal.Spatiotemporalmanipulationofauxinbiosynthesisincottonovuleepidermalcellsenhancesfiberyieldandquality,NatureBiotechnology,2011,29(5):453-458.）、轉(zhuǎn)基因大鈴優(yōu)質(zhì)棉花材料（轉(zhuǎn)RRM基因）（SunF,LiuC,ZhangC.etal.AconservedRNArecognitionmotif(RRM)domainofBrassicanapusFCAimprovescottonfiberqualityandyieldbyregulatingcellsize.MolecularBreeding,2011,30(1),93-101）、海島棉優(yōu)質(zhì)漸滲系（蘭孟焦，楊澤茂，石玉真等，陸海BC4F2和BC4F3代換系的評(píng)價(jià)及纖維產(chǎn)量與品質(zhì)相關(guān)QTL的檢測(cè)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011,44(15):3086-3097.）和棉花優(yōu)質(zhì)纖維品種培育(袁有祿,石玉真,李俊文等.轉(zhuǎn)基因抗蟲優(yōu)質(zhì)雜交棉-中棉所70，中國(guó)棉花，2009，2，17.)等方面取得了了突破性進(jìn)展，要將將上述新材料快速應(yīng)用于棉花育種實(shí)踐，亟需發(fā)明一種簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確性高的分子檢測(cè)方法。首先，在棉花育種實(shí)踐中，要將第二代高衣分等轉(zhuǎn)基因新材料快速應(yīng)用于棉花育種，并與常規(guī)育種有機(jī)結(jié)合起來，形成在棉花分子育種技術(shù)體系，亟需發(fā)展一系列簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確性高的分子檢測(cè)技術(shù)，以提高選擇效率、縮短育種周期；其次，隨著轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉大面積推廣，國(guó)內(nèi)棉花育種單位普遍采用卡那霉素鑒定的方法進(jìn)行材料抗蟲性的早期篩選，但由于棉花遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用的標(biāo)記基因以NptII基因?yàn)橹鳎虼?，卡那霉素抗性鑒定在轉(zhuǎn)基因高衣分、轉(zhuǎn)基因大鈴優(yōu)質(zhì)等材料與抗蟲品系等育種群體的選擇中，難以實(shí)現(xiàn)FBP：：IaaM、RRM基因與Bt基因的同步選擇，因此，，需要對(duì)以卡那霉素鑒定為代表的轉(zhuǎn)基因鑒定方法進(jìn)行改良，發(fā)展一些快速、簡(jiǎn)便等分子檢測(cè)方法，為開展棉花分子聚合育種，提高選擇效率奠定良好的技術(shù)基礎(chǔ)。有鑒于此，本發(fā)明將卡那霉素抗性鑒定、簡(jiǎn)化棉花總DNA提取、多重PCR擴(kuò)增和非變性聚丙烯核酸電泳等技術(shù)進(jìn)行組裝，發(fā)明了棉花高衣分和抗蟲等多基因聚合育種的快速檢測(cè)方法，可以從多基因聚合育種群體中快速的鑒定出含有FBP：：IaaM基因與抗蟲基因的個(gè)體，這對(duì)于快速利用轉(zhuǎn)FBP：：IaaM基因棉花新材料，實(shí)現(xiàn)高衣分、抗蟲等重要基因的有效聚合，提高育種效率等均具有重要意義，同時(shí)，該方法還可應(yīng)用于攜帶有上述基因棉花材料的定性檢測(cè)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)FBP：：IaaM親本及其與轉(zhuǎn)Bt抗蟲棉花材料雜交、回交等不同世代材料的FBP：：IaaM與Bt基因的分子檢測(cè)方法，可以從多基因聚合育種群體中快速的鑒定出含有FBP：：IaaM基因與抗蟲基因的個(gè)體，技術(shù)可靠、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、成本低等有優(yōu)點(diǎn)，可有效提高選擇效率，縮短育種周期。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種快速實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)FBP：：IaaM親本及其與轉(zhuǎn)Bt抗蟲棉花材料雜交、回交不同世代材料的FBP：：IaaM與Bt基因的分子檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟：（1）采用噴霧加涂抹的方法對(duì)棉花抗性進(jìn)行卡那霉素鑒定；（2）提取提取含有目的基因棉花基因組DNA；（3）以第（2）步中提取的基因組DNA為模板，將FBP：：IaaM轉(zhuǎn)基因系基因檢測(cè)特異性引物（P1）、Bt毒蛋白基因（B1）和內(nèi)標(biāo)基因Sad1基因引物S1，分別進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增和多重PCR擴(kuò)增，其中，2個(gè)SSR特征引物堿基序列為：引物B1：Cry-F：5’-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3’；Cry-R：5’-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3’；引物P1：G-P1：5’-ttttggtgaaattctggtctgc-3’G-P2：5’-aaaacagggcttggattag-3’（4）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳；（5）對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析：卡那霉素抗性的植株初步認(rèn)定為攜帶有Bt基因或/和轉(zhuǎn)FBP：：IaaM基因材料，進(jìn)入下一步試驗(yàn)；分別使用引物P1、引物B1和S1的目的片段與該三對(duì)引物的多重PCR目的片段的大小一致，說明該方法結(jié)果可靠；使用引物組合B1/P1，以FBP：：IaaM基因純系與轉(zhuǎn)基因抗蟲棉F1代植株、非轉(zhuǎn)基因純系為模板時(shí)，在F1的5個(gè)單株中，均可以擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶，而非轉(zhuǎn)基因系則未見有擴(kuò)增產(chǎn)物，說明B1/P1的引物組合可以同時(shí)檢測(cè)FBP：：IaaM基因和Bt基因；使用B1/S1引物組合，分別以轉(zhuǎn)基因抗蟲棉純系和非轉(zhuǎn)基因純系為模板，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉純系的不同單株均可以檢測(cè)到Bt和Sad基因，而非轉(zhuǎn)基因純系只能檢測(cè)到Sad基因，說明B1/S1的引物組合可以區(qū)分抗蟲棉和非抗蟲棉系。本發(fā)明所述的分子檢測(cè)方法，第（2）步中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：反應(yīng)體系為20μ1，其中各試劑終濃度為，10×Buffer為1×，dNTPs0.50nM，引物P10.2μM、引物B10.1μM、引物S10.01μM，模板DNA3.00ng，TaqDNA聚合酶0.20U/μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，；94℃變性40s，58℃退火40s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存待用。本發(fā)明方法中，卡那霉素鑒定采用噴霧加涂抹的方法進(jìn)行，棉花發(fā)育時(shí)期為三葉一心，卡那霉素（KanamycinSulphate）濃度為2500mg·kg-1，每畝用量為15.0kg，第一次鑒定采用噴霧法，對(duì)棉苗心葉噴霧，有黃化斑的轉(zhuǎn)基因棉花苗即為陰性植株，轉(zhuǎn)基因棉花子葉上沒有黃化斑的綠苗即為陽(yáng)性植株；第二次鑒定采用涂抹法，對(duì)部分不抗卡那霉素的植株采用涂抹的方法進(jìn)行鑒定，有黃化斑的轉(zhuǎn)基因棉花苗即為陰性植株，轉(zhuǎn)基因棉花子葉上沒有黃化斑的綠苗即為陽(yáng)性植株。這些方法具有：（1）時(shí)期早，三葉一心，便于及時(shí)拔除非卡那霉素抗性植株；（2）簡(jiǎn)單易操作，第一次鑒定可使用噴霧器等簡(jiǎn)單農(nóng)具進(jìn)行，第二次對(duì)部分卡那霉素反應(yīng)植株進(jìn)行涂抹的方法進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便，可在田間大面積鑒定材料；（3）鑒定時(shí)間短，晴好天氣4天可見效果，7天之內(nèi)可以獲得最終結(jié)果。本發(fā)明簡(jiǎn)化CTAB法提取棉花總DNA：將棉花基因組DNA提取方法（CTAB法，PattersonAH,BrubakerCLandWendelJF.Arapidmethodforextractionofcotton(Gossypiumssp)genomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis.PlantMolecularBiologyReporter,1993,11:122-127.）進(jìn)行了簡(jiǎn)化，對(duì)其裂解液配方和提取步驟（裂解液配方和提取步驟見本發(fā)明實(shí)施例部分）進(jìn)行了優(yōu)化，縮短了DNA提取時(shí)間，提高了工作效率，且可以得到了較高質(zhì)量DNA。多重PCR：將FBP：：IaaM轉(zhuǎn)基因系基因檢測(cè)特異性引物（P1）、Bt毒蛋白基因（B1）和內(nèi)標(biāo)基因Sad1基因（Sad1，Stearoyl-acylcarrierproteindesaturase；GenbankNo.AJ132636，來源于陸地棉，與海島棉、小麥、玉米、大麥、煙草、西紅柿、油菜、水稻、向日葵等植物同源基因的序列相似性很低）引物S1，利用一次PCR擴(kuò)增即可檢測(cè)Bt毒蛋白、FBP：：IaaM等兩個(gè)基因目的片段，同時(shí)利用內(nèi)標(biāo)基因Sad1監(jiān)控反應(yīng)體系；本發(fā)明對(duì)上述引物的擴(kuò)增條件和引物濃度進(jìn)行了優(yōu)化，得到了最適引物濃度組合和擴(kuò)增條件（反應(yīng)體系見本發(fā)明具體實(shí)施方式）。非變性聚丙烯核酸電泳：主要用于多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，凝膠濃度為8.0%，由于該方法具備無電滲作用、樣品用量少(1.2-2.0μl)、分辨率高(1-100ng)、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可以有效提高檢測(cè)效率，并適用于較小體積（≤10μl）PCR體系擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，降低檢測(cè)成本；由于該凝膠電泳具備較高的分辨率，通過與對(duì)照比較，可減少引物二聚體、非特異性擴(kuò)增等陽(yáng)性DNA片段的檢測(cè)，可提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，與瓊脂糖電泳比較，由于該方法點(diǎn)樣量較小，較小體積（≤10μl）PCR體系可以進(jìn)行多次電泳檢測(cè)，便于不同批次間樣品的比較。與現(xiàn)有方法比較，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明用于棉花高衣分與抗蟲等基因分子聚合育種過程中材料的分子檢測(cè)，本發(fā)明將卡那霉素抗性、簡(jiǎn)化CTAB法提取棉花總DNA、多重PCR和非變性聚丙烯酰胺DNA凝膠電泳等技術(shù)進(jìn)行有效組合，可快速實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)FBP：：IaaM親本及其與轉(zhuǎn)Bt抗蟲棉花材料雜交、回交等不同世代材料的FBP：：IaaM與Bt基因的分子檢測(cè)，并從中快速鑒定出含有FBP：：IaaM和Bt基因的個(gè)體，為高衣分、抗蟲等基因的分子聚合育種提供了簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確性高的分子檢測(cè)方法。本方法能夠彌補(bǔ)已有卡那霉素抗性鑒定技術(shù)的不足，可用于轉(zhuǎn)FBP：：IaaM基因棉花新材料與轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉品系育種群體后代材料的分子檢測(cè)和帶有上述基因棉花材料的定性檢測(cè)，與傳統(tǒng)方法比較，具有技術(shù)可靠、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、成本低等有優(yōu)點(diǎn)，可有效提高選擇效率，縮短育種周期。附圖說明圖1為樣品DNA完整性檢測(cè)圖。圖2為單一PCR擴(kuò)增和多重PCR擴(kuò)增對(duì)比圖。圖3為B1/P1的引物組合擴(kuò)增結(jié)果圖。圖4為B1/S1的引物組合擴(kuò)增結(jié)果圖。圖5為利用三對(duì)引物對(duì)FBP：：IaaM基因純系與轉(zhuǎn)基因抗蟲棉聚合育種群體部分單株進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。具體實(shí)施方式該發(fā)明方法可用于FBP：：IaaM與Bt基因聚合育種及攜帶有FBP：：IaaM和Bt基因棉花材料的定性鑒定。實(shí)施例11.對(duì)棉花抗性進(jìn)行卡那霉素鑒定：在棉花苗期（三葉一心）用2500mg/L的卡那霉素溶液噴霧，4-7天后觀察葉片顏色，對(duì)于葉片出現(xiàn)黃斑的植株，用相同濃度的卡那霉素溶液涂抹倒二葉，4-7天進(jìn)行確認(rèn)，如果仍然出現(xiàn)黃斑，則認(rèn)為分離出來的非轉(zhuǎn)基因雜株，直接淘汰?？敲顾乜剐缘闹仓瓿醪秸J(rèn)定為攜帶有Bt基因或（和）轉(zhuǎn)FBP：：IaaM基因材料，進(jìn)入下一步試驗(yàn)。提取提取含有目的基因棉花基因組DNA：取卡那霉素抗性單株的幼葉100.0mg，提取DNA，DNA提取方法如下。棉花總DNA采用簡(jiǎn)化CTAB法提取，具體步驟如下：1)取單株幼葉一片（約50-100mg），置于2.0mL離心管中，液氮速凍，使用RetschMM400將樣品研磨成粉末，加入約0.6mL裂解緩沖液（氯化鈉1.4M、EDTA0.02M、Tris-HCl0.1M、2%十六烷基三甲基溴化銨、3%PVP(K40)、0.3%抗壞血酸、pH8.0)搖勻，65℃水浴30min，每10min搖一次。2)加等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提液，冷卻后，搖勻至乳濁液，離心10min（13000g，16℃）。3)吸取上清，轉(zhuǎn)入新的1.5mL離心管，加入0.6倍體積的冰凍異丙醇，緩慢搖勻至沉淀析出。4)鉤出沉淀，轉(zhuǎn)入滅菌1.5mL離心管，70％酒精浸泡30min；換無水乙醇洗一遍，倒干凈乙醇，風(fēng)干，在DNA沉淀仍有些潮濕的時(shí)候，用適量體積的TE溶解。隨機(jī)取部分DNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性（每100mL瓊脂糖溶液中加入5μL溴化乙錠溶液），利用凝膠成像儀進(jìn)行DNA檢測(cè)，DNA濃度及純度用ThermoScientificNaNoDrop2000cSpectrophotometer檢測(cè)，上述的DNA提取方法可以得到質(zhì)量較好的棉花總基因組DNA，其電泳條帶邊緣較為清晰，基本無降解較，RNA殘留較少（圖1），通過檢測(cè)DNA樣品的230、260和280nm的吸光值可以發(fā)現(xiàn)，260/280和260/230比值在2.0附近（表一），DNA純度較好，濃度平均值為590.36ng/ul，濃度較高，可以用于下一步試驗(yàn)。表一：DNA濃度編號(hào)A260A280260/230260/280濃度（ng/ul）11.020.4661.792.2511.1021.020.4771.642.15512.2131.250.5991.82.10629.6241.040.5271.51.98522.9050.900.4131.722.18451.8161.220.5551.992.21613.9371.330.6231.902.14666.8081.230.5731.792.15616.9091.570.7462.002.11788.00平均值1.180.551.792.14590.363.進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增和多重PCR擴(kuò)增：用于證明的多重PCR體系的可靠性，選擇FBP：：IaaM基因純系與轉(zhuǎn)基因抗蟲棉F1代的7個(gè)單株用于多重PCR體系可靠性的驗(yàn)證工作，分別用表四中的4個(gè)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行目標(biāo)基因的擴(kuò)增，多重PCR擴(kuò)增體系如下：選用Bt毒蛋白基因通用引物（Cry1Ac基因、Cry1Ab基因、以及Cry1Ac與Cry1Ab融合基因）、FBP：：IaaM轉(zhuǎn)基因系基因特異性引物和內(nèi)標(biāo)基因（Sad1基因），利用一次PCR擴(kuò)增Cry1ac、FBP：：IaaM和sad基因等片段，本發(fā)明引物序列如下：Bt毒蛋白基因序列通用引物B1（cry1Ac基因、cry1Ab基因、以及cry1Ac與cry1Ab融合基因）,擴(kuò)增片段大小為340bp，用于檢測(cè)Bt蛋白基因（王奕海，謝家建，張永軍等.一種檢測(cè)抗蟲棉中不同Bt基因表達(dá)盒結(jié)構(gòu)的PCR方法,農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)2009,17(5):914-919）。Cry-F：5’-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3’；Cry-R：5’-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3’；轉(zhuǎn)FBP：：IaaM基因高衣分棉花材料檢測(cè)引物P1,擴(kuò)增片段大小為660bp，用于檢測(cè)FBP：：IaaM基因：G-P1：5’-ttttggtgaaattctggtctgc-3’G-P2：5’-aaaacagggcttggattag-3’Sad1基因（Sad1，Stearoyl-acylcarrierproteindesaturase；GenbankNo.AJ132636，來源于陸地棉，與海島棉、小麥、玉米、大麥、煙草、西紅柿、油菜、水稻、向日葵等植物同源基因的序列相似性很低）擴(kuò)增引物S1，產(chǎn)物大小為108bp，主要用于檢測(cè)PCR擴(kuò)增體系(YangL,PanA,ZhangK.etal.,QualitativeandquantitativePCRmethodsforeventspecificdetectionofgeneticallymodifiedcottonMon1445andMon531,2005,14(6):817-831)：s-F:5’-CCAAAGGAGGTGCCTGTTCA-3’s-R:5’-TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC-3’經(jīng)過對(duì)PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化，引物P1、B1和S1的最佳組合濃度組合為（P1：B1：S1=0.2：0.1：0.01），其中，20μL反應(yīng)體系見表二和表三：表二引物組合120μ1體積的擴(kuò)增反應(yīng)體系表三：PCR的反應(yīng)體系PCR程序如下：P1、B1和S1等引物組合反應(yīng)程序：（1）94℃預(yù)變性4min；（2）94℃變性40s，58℃退火40s，72℃延伸1min，循環(huán)數(shù)為30，（3）72℃延伸10.0min。目標(biāo)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠銀染分析，具體方法如下：多重PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物利用8%非變性聚丙稀酰胺凝膠電泳檢測(cè)（配方見表四），凝膠大小180×120mm，厚度1.0mm，電泳緩沖液為1×TBE（Tirs-硼酸緩沖液），電泳電壓180V，電泳時(shí)間為50-60min。電泳結(jié)束后，按照張軍（張軍,武耀廷,郭旺珍,張?zhí)煺?棉花微衛(wèi)星標(biāo)記的PAGE/銀染快速檢測(cè).棉花學(xué)報(bào),2000,12(5):267-269.）的方法進(jìn)行銀染，并稍作修改。1)固定：將取下的凝膠置于盛有固定液(340mL無離子水+40mL95%酒精＋20mL10％乙酸)的盒子中，并于搖床上輕搖，固定至少5~6min，用純水沖洗一次凝膠。2)滲透：加入300mL滲透液(0.6gAgNO3＋300mL無離子水)，在搖床上滲透12min，用純水漂洗兩遍，每次約30s。3)顯色：加入400mL顯色液(6gNaOH＋4mLCH2O＋4mL0.2%Na2S2O3＋400mL無離子水)，搖動(dòng)至條帶清晰地顯出，倒去顯色液，然后用純水洗兩遍。4)終止：加入400mL終止液(3gNa2CO3＋400mL無離子水)，暫時(shí)保存，分析結(jié)果。表四：凝膠配制（8％）結(jié)果顯示，分別使用P1（圖2中D）、B1（圖2中C）和S1（圖2中B）的目的片段與多重PCR（三對(duì)引物，圖2中A）目的片段的大小一致，證明該方法結(jié)果可靠（請(qǐng)參見圖2）。實(shí)施例2該實(shí)施例用于證明的引物組合B1/P1、以及B1/S1引物組合的可靠性，分別選擇轉(zhuǎn)FBP：：IaaM基因純系與轉(zhuǎn)基因抗蟲棉F1代植株、轉(zhuǎn)基因抗蟲棉純系和非轉(zhuǎn)基因純系進(jìn)行。PCR擴(kuò)增體系分別用表五中所述的兩個(gè)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行（PCR程序同實(shí)施例1），目標(biāo)基因擴(kuò)增產(chǎn)物的分析方法與實(shí)施例1中所述一致。結(jié)果顯示，使用引物組合B1/P1，以FBP：：IaaM基因純系與轉(zhuǎn)基因抗蟲棉F1代植株、非轉(zhuǎn)基因純系為模板時(shí)，在F1的5個(gè)單株中，均可以擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶（圖3中1-5），而非轉(zhuǎn)基因系則未見有擴(kuò)增產(chǎn)物（圖3中6），說明B1/P1的引物組合可以同時(shí)檢測(cè)FBP：：IaaM基因和Bt基因；使用B1/S1引物組合，分別以轉(zhuǎn)基因抗蟲棉純系和非轉(zhuǎn)基因純系為模板，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉純系的不同單株均可以檢測(cè)到Bt和Sad基因（圖4中1、3-7），而非轉(zhuǎn)基因純系只能檢測(cè)到Sad基因（圖4中2），說明B1/S1的引物組合可以區(qū)分抗蟲棉和非抗蟲棉系。表五：實(shí)例2的反應(yīng)體系實(shí)施例3育種后代群體的多重PCR分析用實(shí)施例2表五中的擴(kuò)增體系1對(duì)FBP：：IaaM基因純系與轉(zhuǎn)基因抗蟲棉聚合育種群體部分單株進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，并分別選用轉(zhuǎn)FBP：：IaaM基因純系與轉(zhuǎn)基因抗蟲棉F1代植株、轉(zhuǎn)基因抗蟲棉純系和非轉(zhuǎn)基因純系作為對(duì)照，（PCR程序同實(shí)施例1），目標(biāo)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物分析方法同實(shí)施例1（結(jié)果見圖2）。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)FBP：：IaaM基因純系與轉(zhuǎn)基因抗蟲棉F1代單株、轉(zhuǎn)基因抗蟲棉純系單株和非轉(zhuǎn)基因純系單株作為對(duì)照分別使用分別擴(kuò)增除了與目的條帶分子量一致的3、2和1個(gè)條帶（圖5中1.、2和3）、其他單株的DNA分別擴(kuò)增出3個(gè)（圖5中5、8和9）、2個(gè)（圖5中4、6、7和10）和1個(gè)條帶（圖5中11）。實(shí)施例4育種后代群體的結(jié)果分析利用卡那霉素鑒定鑒定后，提取陽(yáng)性植株的DNA作為模板，如果三對(duì)引物的多重PCR反應(yīng)中，F(xiàn)BP：：IaaM基因、Bt基因（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac與cry1Ab融合基因）和Sad1內(nèi)標(biāo)基因的序列得到了擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小一致，而在陰性對(duì)照中僅擴(kuò)增出Sad1基因片段，空白對(duì)照中沒有任何擴(kuò)增片段，表明PCR反應(yīng)體系正常工作。如果Sad1內(nèi)標(biāo)基因沒有擴(kuò)增，則表明PCR反應(yīng)體系不正常，需要查找原因重新檢測(cè)。在PCR反應(yīng)體系正常工作的前提下，育種群體后代的檢測(cè)結(jié)果通常有以下幾種情況：（1）在試樣PCR反應(yīng)中，只有Sad1內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因得到擴(kuò)增，則該單株不攜帶有Bt（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac與cry1Ab融合基因）抗蟲基因和FBP：：IaaM基因。（2）在試樣PCR反應(yīng)中，Sad1內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和Bt（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac與cry1Ab融合基因）抗蟲基因得到了擴(kuò)增，則該單株攜帶有Bt（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac與cry1Ab融合基因）抗蟲基因。（3）在試樣PCR反應(yīng)中，Sad1內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和FBP：：IaaM基因得到了擴(kuò)增，則該單株攜帶有FBP：：IaaM基因。（4）在試樣PCR反應(yīng)中，Sad1內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因、Bt（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac與cry1Ab融合基因）抗蟲基因和FBP：：IaaM基因均得到了擴(kuò)增，則該單株攜帶有Bt（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac與cry1Ab融合基因）和FBP：：IaaM基因，該單株為中選單株，可用于下一步研究。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3