本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種三聯(lián)肽Cec Md3cs、制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗菌肽是生物體抵御外界病原微生物入侵的有效屏障，具有廣譜抗菌作用，而且具有不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、食品、動(dòng)物飼料等領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。目前，已發(fā)現(xiàn)了上千種抗菌肽，但是能夠應(yīng)用于臨床的抗菌肽種類依然有限。因此，人們希望通過(guò)分子設(shè)計(jì)和重新改造獲得活性更好的新型抗菌肽。

由于抗菌肽屬于小分子肽，其克隆、表達(dá)、分離、純化和檢測(cè)工序都相對(duì)繁瑣，為了提高目的蛋白的回收效率，有效的保持抗菌肽活性、降低宿主細(xì)胞毒性、增加抗菌肽穩(wěn)定性和表達(dá)量，通常采用串聯(lián)表達(dá)的方式來(lái)表達(dá)抗菌肽。

天蠶素抗菌肽(cecropins)是目前研究最清楚、效果最好的天然抗菌肽；家蠅天蠶素抗菌肽(Cec Md)與天蠶素抗菌肽的同源性達(dá)81％，但Cec Md仍具有一定的溶血活性，且分離純化步驟繁瑣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種三聯(lián)肽Cec Md3cs、制備方法及應(yīng)用，利用該三聯(lián)肽Cec Md3cs制備的抗菌肽Cec Md溶血性低、抗菌活性高，該制備方法分離純化步驟簡(jiǎn)單。

本發(fā)明提供了一種三聯(lián)肽Cec Md3cs，用于編碼所述三聯(lián)肽Cec Md3cs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述三聯(lián)肽Cec Md3cs的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供了一種三聯(lián)肽Cec Md3cs的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，合成核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的目的基因；

步驟2，以限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切載體pGAPZαA，并回收得到3147bp的載體片段；將所述目的基因和所述載體片段連接，得到含有重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs的連接液；

步驟3，將步驟2的連接液轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，并提取重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs，得到重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs；

步驟4，將重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，得到表達(dá)工程菌；

步驟5，培養(yǎng)步驟4的表達(dá)工程菌，進(jìn)行三聯(lián)肽Cec Md3cs的表達(dá)，并提取三聯(lián)肽Cec Md3cs，得到三聯(lián)肽Cec Md3cs。

優(yōu)選的，上述三聯(lián)肽Cec Md3cs的制備方法中，步驟4的宿主細(xì)胞為畢赤酵母GS115。

本發(fā)明還提供了一種三聯(lián)肽Cec Md3cs，在制備抗菌肽Cec Md中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種三聯(lián)肽Cec Md3cs，在制備治療革蘭氏陰性菌疾病藥物或者治療革蘭氏陽(yáng)性菌疾病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種三聯(lián)肽Cec Md3cs，在制備動(dòng)物飼料添加劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還一種利用所述三聯(lián)肽Cec Md3cs制備抗菌肽Cec Md的方法，具體包括以下步驟：

步驟a，制備濃度為1U/μL的重組腸激酶溶液；

步驟b，將10×rEK Cleavage Buffer、三聯(lián)肽Cec Md3cs、重組腸激酶和去離子水按照5mL:50mg:1mL:46mL的比例混合均勻，并于22℃反應(yīng)16h，冷凍干燥，得到抗菌肽Cec Md粗品；

步驟c，抗菌肽Cec Md的純化

將抗菌肽Cec Md粗品經(jīng)5000kDa膜分離，得到的分離液經(jīng)G50層析柱純化，得到抗菌肽Cec Md。

本發(fā)明提供的一種三聯(lián)肽Cec Md3cs，并應(yīng)用基因工程技術(shù)在畢赤酵母中高效表達(dá)了該三聯(lián)肽Cec Md3cs，經(jīng)驗(yàn)證，利用該三聯(lián)肽Cec Md3cs制備的抗菌肽Cec Md溶血性低、對(duì)多種細(xì)菌具有抗菌活性、熱穩(wěn)定性好，表達(dá)量高，且分離純化簡(jiǎn)單、易操作，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，該三聯(lián)肽Cec Md3cs在醫(yī)藥(抗菌藥物)、食品(抗菌劑)、飼料添加劑等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs的PCR產(chǎn)物鑒定電泳圖；

圖2為重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs的雙酶切產(chǎn)物鑒定電泳圖；

圖3為重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs的線性化產(chǎn)物鑒定電泳圖；

圖4為酵母轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定電泳圖；

圖5為三聯(lián)肽Cec Md3cs的Tricine-SDS-PAGE分析圖譜；

圖6為三聯(lián)肽Cec Md3cs的高效液相色譜分析結(jié)果；

圖7為三聯(lián)肽Cec Md3cs的質(zhì)譜分析結(jié)果。

其中，圖1中M泳道為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Maker)，1、2號(hào)泳道均為重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs的PCR產(chǎn)物(711bp)；圖2中M泳道為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Maker)，1、2號(hào)泳道均為重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs的雙酶切產(chǎn)物(408bp)；圖3中M泳道為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Maker)，1號(hào)泳道為重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs的線性化產(chǎn)物(3555bp)；圖4中M泳道為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Maker)，1號(hào)泳道為酵母轉(zhuǎn)化子的菌落PCR產(chǎn)物(789bp)；圖5中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，1號(hào)泳道為三聯(lián)肽Cec Md3cs(13.91kDa)，2號(hào)泳道為抗菌肽Cec Md3js(13.36kDa)，3號(hào)泳道為Cec Md2cs(9.08kDa)，4號(hào)泳道為Cec Md2js(8.79kDa)，5號(hào)泳道為二聯(lián)肽Cec Md2ys(8.77kDa)，6號(hào)泳道為抗菌肽Cec Md(4.26kDa)，7號(hào)泳道為Cec Md3jn樣品上清液，8號(hào)泳道為Cec Md3cn樣品上清液，9號(hào)泳道為空白對(duì)照。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。

本發(fā)明提供了一種三聯(lián)肽Cec Md3cs，用于編碼所述三聯(lián)肽Cec Md3cs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述三聯(lián)肽Cec Md3cs的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基于同一種發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種三聯(lián)肽Cec Md3cs的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，合成核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的目的基因。

需要說(shuō)明的是，為了提高抗菌肽的表達(dá)量，采用串聯(lián)設(shè)計(jì)，遵循畢赤酵母偏愛(ài)性原則，設(shè)計(jì)如SEQ ID NO.1所示的用于編碼三聯(lián)肽Cec Md3cs的核苷酸序列，并在該序列的5’端添加KpnⅠ的限制性酶切位點(diǎn)GGTACC和起始密碼子ATG；并在該序列3’端添加X(jué)baⅠ的限制性酶切位點(diǎn)TCTAGA和終止密碼子TAA，得到如SEQ ID NO.3所示的目的基因。

步驟2，以限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切載體pGAPZαA，并回收得到3147bp的載體片段；將所述目的基因片段和所述載體片段連接，得到含有重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs的連接液。具體包括以下步驟：

步驟2.1，以限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切載體pGAPZαA，酶切體系如表1所示，得到載體雙酶切溶液；

取5μL載體雙酶切溶液與1μL的6×Loading Buffer混合均勻，在含有EB的1％瓊脂糖電泳檢測(cè)，電泳檢測(cè)正確后，將剩下15μL的載體雙酶切溶液按照DNA凝膠回收試劑盒方法進(jìn)行膠回收，得到3147bp的載體片段。

表1載體pGAPZαA的雙酶切體系

其中，雙酶切的條件為：將表1所示雙酶切體系中的各物質(zhì)加入PCR管中混勻，于37℃水浴3h。

步驟2.2，將所述目的基因和所述載體片段連接，其連接體系如表2所示，連接的條件為16℃水浴2h，得到含有重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs的連接液。

表2目的基因和載體片段的連接體系

步驟3，將步驟2.2的連接液轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中(該步驟主要是為了將連接液中的重組載體pGAPZαA/Cec Md2ys轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中)，37℃振蕩培養(yǎng)1h，涂布在含有25μg/mLZeocin^TM(博萊霉素)的低鹽LB培養(yǎng)基平板上，倒置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，過(guò)夜培養(yǎng)(12-16h)直至形成單菌落，挑取單菌落進(jìn)行PCR產(chǎn)物(711bp)鑒定，篩選出含有重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs的陽(yáng)性克隆子，并提取陽(yáng)性克隆子中的重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs，得到重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs。所述低鹽LB平板培養(yǎng)基的配方為：10g/L胰胨、5g/L酵母提取物、15g/L瓊脂、5g/L氯化鈉、余量為水，pH 7.5。所述PCR產(chǎn)物鑒定體系如表3所示。

表3重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs的PCR產(chǎn)物鑒定體系

其中，步驟3的PCR產(chǎn)物(711bp)鑒定采用的引物序列是：

ForwardPrimer：5’-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’

3’AOX1Primer：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。

重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs的PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果如圖1，711bp處有條帶，說(shuō)明重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs構(gòu)建成功；重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs的KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切產(chǎn)物鑒定結(jié)果如圖2所示，408bp處有條帶，說(shuō)明重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs構(gòu)建成功。

步驟4，將重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞(畢赤酵母GS115)中，得到表達(dá)工程菌。

步驟4.1，畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞的制備

步驟4.1.1，活化：取-80℃凍存的畢赤酵母GS115，采用YPD平板劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28-30℃(約2天)，得到第一單克隆細(xì)胞的單菌落；

挑取第一單克隆細(xì)胞的單菌落，采用YPD平板劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28-30℃(約2天)，得到第二單克隆細(xì)胞的單菌落；

挑取第二單克隆細(xì)胞的單菌落采用YPD平板劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28-30℃(約2天)，得到畢赤酵母GS115的單菌落。

其中，步驟4.1.1所述采用YPD平板劃線培養(yǎng)時(shí)可用保鮮膜包裹YPD平板。

步驟4.1.2，小量培養(yǎng)：挑取畢赤酵母GS115的單菌落接種到5mLYPD液體培養(yǎng)基中，28-30℃，200r/min搖瓶培養(yǎng)16-18h(OD₆₀₀值2.0左右)，得到畢赤酵母GS115菌懸液。

需要說(shuō)明的是，步驟4.1.2中搖瓶培養(yǎng)一般過(guò)夜即可，不需測(cè)OD₆₀₀值。

步驟4.1.3，放大培養(yǎng)：將5mL畢赤酵母GS115菌懸液接種到500mLYPD液體培養(yǎng)基中，并按1:100～200的體積比例接種，培養(yǎng)瓶采用2L的培養(yǎng)瓶，其中每1L培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)裝250mLYPD液體，以便于讓畢赤酵母GS115充分吸收吸氧氣，28-30℃，200r/min搖瓶培養(yǎng)16-18h(OD₆₀₀值2.0左右)，得到畢赤酵母GS115培養(yǎng)菌液。

需要說(shuō)明的是，步驟4.1.3中搖瓶培養(yǎng)一般過(guò)夜即可，不需測(cè)OD₆₀₀值。

步驟4.1.4，將畢赤酵母GS115培養(yǎng)菌液冰浴10min，移入4℃預(yù)冷的離心管，然后4℃，1500×g離心5min，去上清，收集沉淀；并用500mL4℃預(yù)冷的無(wú)菌水重懸沉淀，得到第一酵母菌重懸液。

步驟4.1.5，將第一酵母菌重懸液于4℃，1500×g離心5min，去上清，收集第一酵母菌沉淀；并用250mL4℃預(yù)冷的無(wú)菌水重懸酵母菌沉淀，得到第二酵母菌重懸液。

步驟4.1.6，將第二酵母菌重懸液于4℃，1500×g離心5min，去上清，收集第二酵母菌沉淀；并用20mL4℃預(yù)冷的無(wú)菌1mol/L山梨醇重懸第二酵母菌沉淀，得到第一山梨醇重懸液。

步驟4.1.7，將第一山梨醇重懸液于4℃，1500×g離心5min，去上清，收集第三酵母菌沉淀；并用1mL4℃預(yù)冷的無(wú)菌1mol/L山梨醇重懸第三酵母菌沉淀，得到畢赤酵母GS115細(xì)胞。

步驟4.1.8，制備畢赤酵母GS115細(xì)胞的感受態(tài)，得到畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，冰浴保存，且當(dāng)天制備當(dāng)天使用，不可凍存。

步驟4.2，重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs的線性化

將步驟3的重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs用限制性內(nèi)切酶AvrⅡ進(jìn)行線性化酶切，得到線性化產(chǎn)物溶液，其中線性化酶切的反應(yīng)體系如4所示，反應(yīng)條件為37℃水浴3h；

取5μL線性化產(chǎn)物溶液與1μL的6×Loading Buffer混合均勻，在含有EB的1％瓊脂糖電泳檢測(cè)，電泳檢測(cè)正確后，將剩下15μL的線性化產(chǎn)物溶液按照DNA凝膠回收試劑盒方法進(jìn)行膠回收，得到線性化重組載體pGAPZαA/CecMd3cs。

其中，試劑盒方法進(jìn)行膠回收的步驟如下：向線性化產(chǎn)物溶液中加入相當(dāng)于線性化產(chǎn)物溶液1/10倍體積的NaAC(3mol/L)、相當(dāng)于線性化產(chǎn)物溶液2.5倍體積無(wú)水乙醇，-80℃放置0.5h以上；12000r/min離心10min后棄上清；70％無(wú)水乙醇洗滌沉淀，真空干燥，得到線性化重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

其中，線性化產(chǎn)物溶液中的重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs的線性化產(chǎn)物的鑒定結(jié)果如圖3所示，3555bp處有條帶則說(shuō)明，重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs的線性化成功。

表4線性化酶切處理的反應(yīng)體系

步驟4.3，將步驟4.2的線性化重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs電轉(zhuǎn)化到步驟4.1.8的畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，得到表達(dá)工程菌，具體包括:

將80μL畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞與5-10μg或者5-10μL線性化重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs冰浴混勻，轉(zhuǎn)入冰浴預(yù)冷的2mm電轉(zhuǎn)杯中；繼續(xù)冰浴5min；電擊轉(zhuǎn)化，其中電擊轉(zhuǎn)化條件與電擊轉(zhuǎn)化釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的條件相同，為：電壓為1500V或2000V；電容為25μF；電阻為200歐，溫度為0℃。

電擊轉(zhuǎn)化后，立即往2mm電轉(zhuǎn)杯中加入1mL冰浴冷的1mol/L山梨醇，并將電擊產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至一個(gè)15mL Conical無(wú)菌管中，然后將15mL Conical無(wú)菌管中的電擊產(chǎn)物于30℃靜置培養(yǎng)1-2h，得到電轉(zhuǎn)化酵母。

取10μL、25μL、50μL、100μL、200μL的電轉(zhuǎn)化酵母，分別涂布在5個(gè)不同的YPDS培養(yǎng)基平板(含100μg/mLZeocin^TM)上(小密度的電轉(zhuǎn)化酵母涂布更有利于Zeocin^TM抗性選擇)；于30℃培養(yǎng)3-10天，直至酵母單克隆菌落出現(xiàn)；挑取10-20個(gè)酵母單克隆菌落在YPDS培養(yǎng)基平板(含100μg/mL的博萊霉素Zeocin^TM)上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，得到酵母轉(zhuǎn)化子的單菌落。

步驟4.4，篩選步驟4.3的酵母轉(zhuǎn)化子的單菌落中的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

步驟4.4.1，PCR鑒定：

挑取步驟4.3的酵母轉(zhuǎn)化子的單菌落接種于5mL含25μg/mL Zeocin^TM的YPD液體培養(yǎng)基中，于30℃200r/min搖床培養(yǎng)15-16h(過(guò)夜)，得到酵母轉(zhuǎn)化子菌懸液。

取500μL酵母轉(zhuǎn)化子菌懸液離心，棄上清，開(kāi)蓋，在500W微波加熱至煮沸，于液氮中放置5min，然后加入50μL無(wú)菌水，在500W微波加熱至煮沸，離心，收集上清，并將上清作為PCR的酵母基因組DNA模板。

采用引物對(duì)Forward Primer：5’-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’和3’AOX1Primer：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’進(jìn)行菌落PCR，鑒定重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs是否整合入畢赤酵母基因組中，其中菌落PCR的反應(yīng)體系如表5所示，菌落PCR的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s；54.8℃退火30s；72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min。

待菌落PCR反應(yīng)結(jié)束后，取3μLPCR產(chǎn)物在含有EB的2％瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，789bp處有條帶，說(shuō)明該酵母轉(zhuǎn)化子為陽(yáng)性克隆，該酵母轉(zhuǎn)化子的菌液為陽(yáng)性克隆菌液。

表5菌落PCR的反應(yīng)體系

步驟4.4.2，測(cè)序鑒定

將步驟4.4.1的陽(yáng)性克隆菌液與甘油按照5:1的體積比例混合均勻，送哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAMAN與所設(shè)計(jì)的目的基因進(jìn)行對(duì)比，若陽(yáng)性克隆中確實(shí)含有所設(shè)計(jì)的目的基因，則該陽(yáng)性克隆為表達(dá)工程菌，且該表達(dá)工程菌用于表達(dá)重組載體pGAPZαA/Cec Md3cs中含有的目的基因片段。

步驟5，培養(yǎng)步驟4.4.2的表達(dá)工程菌，進(jìn)行三聯(lián)肽Cec Md3cs的表達(dá)，并提取三聯(lián)肽Cec Md3cs，得到三聯(lián)肽Cec Md3cs。

步驟5.1，三聯(lián)肽Cec Md3cs的表達(dá)

在100μg/mLZeocin^TM篩選下穩(wěn)定性較好的表達(dá)工程菌，-80℃保存。

將表達(dá)工程菌接種至裝有20mLYPD液體培養(yǎng)基的50mL錐形瓶中，于30℃、200r/min培養(yǎng)16-18h，得到表達(dá)工程菌菌懸液；

取1mL的表達(dá)工程菌菌懸液于已滅菌的100mLYPD液體培養(yǎng)基中，用8層滅菌脫脂紗布封口，于30℃、200r/min培養(yǎng)2-4d，得到菌液樣品；

步驟5.2，三聯(lián)肽Cec Md3cs蛋白的提取

取步驟5.1的菌液樣品4mL，12000r/min離心5min，收集上清，然后將收集的上清進(jìn)行濃縮，得到三聯(lián)肽Cec Md3cs濃縮液，將三聯(lián)肽Cec Md3cs濃縮液用20％乙醇洗脫除雜，然后用3kD的超速離心管超速離心，冷凍干燥，得到三聯(lián)肽Cec Md3cs。

需要說(shuō)明的是，步驟5.1和步驟5.2也可以采用下列處理方式過(guò)濾濃縮：將表達(dá)工程菌接種至YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、240r/min培養(yǎng)72h，4000r/min離心20min，取上清液，0.45μm膜過(guò)濾，濾液采用TCA方法濃縮，冷凍干燥，得到三聯(lián)肽Cec Md3cs。

步驟5.3，利用三聯(lián)肽Cec Md3cs制備抗菌肽Cec Md(所述抗菌肽Cec Md的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示)。

步驟5.3.1，用1×rEK DilutionBuffer稀釋重組腸激酶(市售)，使其終濃度為1U/μL，得到濃度為1U/μL的重組腸激酶溶液，然后再1.5mL離心管中加入表6中的酶切體系成分，22℃反應(yīng)16h后，將酶切產(chǎn)物濃縮，并冷凍干燥，得到抗菌肽Cec Md粗品，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表6酶切體系

步驟5.3.2，抗菌肽Cec Md的純化

將三聯(lián)肽Cec Md3cs的水解產(chǎn)物(抗菌肽Cec Md粗品)通過(guò)Mini超濾系統(tǒng)5000kDa膜分離，分離液過(guò)G50層析柱后上液相純化，得到純化的抗菌肽Cec Md，該純化的抗菌肽Cec Md可用于制備治療革蘭氏陰性菌疾病藥物或者治療革蘭氏陽(yáng)性菌疾病藥物中的應(yīng)用，或者用于制備動(dòng)物飼料添加劑。

圖5為三聯(lián)肽Cec Md3cs(13.91kDa)的Tricine-SDS-PAGE分析圖譜，其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，1號(hào)泳道為三聯(lián)肽Cec Md3cs(13.91kDa)，2號(hào)泳道為三聯(lián)肽Cec Md3js(13.36kDa)，3號(hào)泳道為Cec Md2cs(9.08kDa)，4號(hào)泳道為Cec Md2js(8.79kDa)，5號(hào)泳道為二聯(lián)肽Cec Md2ys(8.77kDa)，6號(hào)泳道為抗菌肽Cec Md(4.26kDa)，7號(hào)泳道為Cec Md3jn樣品上清液，8號(hào)泳道為Cec Md3cn樣品上清液，9號(hào)泳道為空白對(duì)照，其中2、3、4、5、7、8號(hào)泳道是為了使不同樣品電泳圖譜區(qū)分開(kāi)來(lái)的輔助樣品，是為了方便觀察三聯(lián)肽Cec Md3cs和抗菌肽Cec Md條帶位置，并不涉及發(fā)明內(nèi)容。

下面采用HPLC法檢測(cè)三聯(lián)肽Cec Md3cs制備而成的抗菌肽Cec Md的純度，具體包括：

取3μL分析級(jí)HPLC分析，流動(dòng)相是水和乙腈，進(jìn)行30min的梯度洗脫。首先將HPLC用含95％的水和5％的乙腈的起始梯度平衡10min。然后注入準(zhǔn)備好的樣品，反應(yīng)時(shí)間為40min，收集從檢測(cè)器中出來(lái)的樣品。最后用25％的水和75％的乙腈混合液清洗30min，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6和圖7，結(jié)果表明，抗菌肽Cec Md具有較高的純度。

將三聯(lián)肽Cec Md3cs進(jìn)行抗菌與溶血活性檢測(cè)，具體包括：

最小殺菌濃度(MIC)采用96孔板法測(cè)定。將短乳桿菌、德氏乳桿菌、雙歧桿菌、畢赤酵母GS115和停乳鏈球桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌于平板劃線培養(yǎng)，并挑取單菌落與相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其中停乳鏈球桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌37℃，200r/min空氣震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；短乳桿菌、德氏乳桿菌、雙歧桿菌厭氧37℃，200r/min震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；畢赤酵母GS115于30℃，200r/min空氣震蕩培養(yǎng)48h。

將抗菌肽Cec Md用1×PBS分別稀釋成2000μmol/L、1500μmol/L、750μmol/L、500μmol/L、375μmol/L、250μmol/L、187.5μmol/L、125μmol/L、93.75μmol/L、62.5μmol/L、46.875μmol/L、31.25μmol/L、23.475μmol/L和15.625μmol/L共計(jì)16個(gè)梯度。將培養(yǎng)后的菌液稀釋至2×10⁵-7×10⁵CFU/mL，將稀釋好的測(cè)試菌液分別滴加到3個(gè)96孔培養(yǎng)板中，每行的1-12孔，每孔60μL，然后每孔滴加20μL的抗菌肽，每孔加120μL培養(yǎng)基。每個(gè)樣品設(shè)定3個(gè)重復(fù)，同時(shí)以不含測(cè)試菌作為陰性對(duì)照，培養(yǎng)48h。用肉眼觀察有無(wú)渾濁，即為受試菌的最小抑菌濃度。

最低殺菌濃度采(MBC)用96孔板法測(cè)定。將MIC前所有孔的混合液取5μL移入相應(yīng)新鮮培養(yǎng)基96孔板中，然后進(jìn)行培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果，沒(méi)有混濁可以當(dāng)做99.5％的原始種入的細(xì)菌被殺死，即為該菌的最低殺菌濃度。結(jié)果如表7所示。

表7抗菌肽Cec MdMIC和MBC

注：“-”表示無(wú)明顯抑菌濃度

通過(guò)SWISS-MODEL軟件對(duì)串聯(lián)肽水解產(chǎn)物預(yù)測(cè)，可看出，三聯(lián)肽Cec Md3cs含有α-螺旋結(jié)構(gòu)，三聯(lián)肽Cec Md3cs所用連接序列分別為腸激酶(DDDDK)，肽鏈的連接中心中出現(xiàn)Pro會(huì)有較好的細(xì)胞的選擇性毒性，其溶血活性降低，當(dāng)Pro被Ala替代后，細(xì)胞的選擇的有較大程度的降低，Asp是腸激酶的組成部分，具有解離的性質(zhì)，對(duì)溶血活性影響不大。

通過(guò)測(cè)定血紅素的釋放量來(lái)探索抗菌肽的溶血活性。采取濃度為2％的新鮮綿羊血紅細(xì)胞懸浮液，與0.1mL測(cè)試抗菌肽混合均勻。測(cè)試抗菌肽混勻后的濃度為100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL，混合均勻后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育1h，2000r/min離心10min。將上清液轉(zhuǎn)移至96孔板，使用酶標(biāo)儀在570nm下測(cè)定吸光值。使用無(wú)菌的生理鹽水和0.1％(v/v)的Triton-100作為溶血百分比0％和100％的標(biāo)準(zhǔn)。陰性對(duì)照用PBS緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照用0.1％TritonX-100。每個(gè)樣品設(shè)定3個(gè)平行，結(jié)果取其平均值。溶血率(％)＝(試驗(yàn)管吸光度-陰性對(duì)照管吸光度)/(陽(yáng)性對(duì)照管吸光度-陰性對(duì)照管吸光度)×100％。三聯(lián)肽Cec Md3cs對(duì)綿羊紅細(xì)胞溶血活性影響結(jié)果如表8所示，濃度為100μg/mL、50μg/mL和25μg/mL時(shí)，三聯(lián)肽Cec Md3cs和抗菌肽Cec Md的溶血活性顯著低于家蠅天蠶素抗菌肽；濃度為12.5μg/mL時(shí)，三聯(lián)肽Cec Md3cs的溶血活性為1.46，抗菌肽Cec Md的溶血活性為1.42，均較低。

表8不同多肽對(duì)綿羊紅細(xì)胞溶血活性的影響

注：不同字母表示相同濃度不同抗菌肽之間有顯著差異(P<0.05)；“—”代表未檢測(cè)出結(jié)果。

畢赤酵母在發(fā)酵生產(chǎn)的過(guò)程中能夠縮短菌種的培養(yǎng)周期、簡(jiǎn)化操作步驟、減少了資料的耗費(fèi)且降低了發(fā)酵成本，具備真核細(xì)胞蛋白合成通路。乙醇氧化酶(Alochol Oxidase，AOX1)基因啟動(dòng)子是畢赤酵母用來(lái)嚴(yán)格并啟動(dòng)調(diào)控源蛋白的表達(dá)的有力工具，在此基礎(chǔ)上，對(duì)于外源蛋白的誘導(dǎo)、糖基化修飾、二硫鍵的修飾以及加工都具有一定的生物學(xué)功能。雖然酵母菌所需的培養(yǎng)基組成單一，但卻是能在簡(jiǎn)單的培養(yǎng)條件下快速的高密度生長(zhǎng)，對(duì)于重組質(zhì)粒重組于畢赤酵母菌中遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，可較少地分泌自身蛋白，但整體細(xì)胞干重可達(dá)130g/L，由此可見(jiàn)酵母菌即是表達(dá)外源蛋白的最佳菌種。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。