本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及病毒介導(dǎo)的Cpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因編輯是在基因組水平上進(jìn)行精確修飾的一種技術(shù)，可完成基因定點(diǎn)刪除(InDel)突變、基因定點(diǎn)插入突變、多位點(diǎn)同時(shí)突變和小片段的刪失等?；蚓庉嫾夹g(shù)可用于基因功能及疾病發(fā)病機(jī)理研究、構(gòu)建疾病動(dòng)物模型、生物治療、遺傳和腫瘤相關(guān)疾病研究、整合病毒疾病研究和改良農(nóng)畜牧物種。基因編輯技術(shù)是從根本上改變物種遺傳物質(zhì)DNA的工具，具有極其廣泛的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。

鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)是三大基因編輯技術(shù)，本質(zhì)上均是利用非同源末端鏈接途徑(NHEJ)修復(fù)和同源重組(HR)修復(fù)，聯(lián)合特異性DNA的靶向識(shí)別及核酸內(nèi)切酶完成的DNA序列改變。NHEJ修復(fù)使基因產(chǎn)生插入或刪除突變，從而造成基因移碼突變，以實(shí)現(xiàn)編碼基因敲除，如果是基因組鄰近位置兩處雙鏈斷裂，NHEJ修復(fù)后則可造成基因組片段缺失。鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)三種編輯技術(shù)的共同點(diǎn)是含有靶點(diǎn)DNA序列的識(shí)別區(qū)域及DNA剪切功能區(qū)域。其中ZFN通過(guò)鋅指結(jié)構(gòu)域識(shí)別靶點(diǎn)DNA序列，TALEN識(shí)別靶點(diǎn)DNA序列的區(qū)域是重復(fù)可變雙殘基的重復(fù)，ZFN和TALEN的DNA剪切功能區(qū)域均為一種名為Fokl的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)okI結(jié)構(gòu)需要形成二聚體才能發(fā)揮DSB剪切功能，所以ZFNs和TALEN均需要表達(dá)兩個(gè)DNA靶向-FokI核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)融合蛋白。而CRISPR/Cas9系統(tǒng)是存在于大多數(shù)細(xì)菌(約40％)和古細(xì)菌(約90％)中的一種后天免疫系統(tǒng)，可用來(lái)消滅或?qū)雇鈦?lái)的質(zhì)體或者噬菌體，并在自身基因組中留下外來(lái)基因片段作為“記憶”，在下一次外源DNA入侵時(shí)，表達(dá)的Cas9核酸酶在含有記憶片段的crRNA及tracrRNA的指導(dǎo)下切割與記憶片段一樣且含有PAM的外源基因，發(fā)揮抵抗外源DNA片段入侵的免疫作用。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯生物基因組，可在靶標(biāo)片段處造成不同形式的缺失或插入，現(xiàn)已成功應(yīng)用于人類(lèi)細(xì)胞系、斑馬魚(yú)、大鼠、小鼠、果蠅等生物中。與ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)中蛋白質(zhì)對(duì)DNA序列的識(shí)別要更加精確得多，降低了脫靶切割的幾率，減低了細(xì)胞毒性，而且CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建僅僅需要設(shè)計(jì)與靶序列互補(bǔ)的gRNA即可，更為簡(jiǎn)單和廉價(jià)，大大提高了基因操作的效率及簡(jiǎn)便性。但是，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也存在著一些不足，如Cas9蛋白不能對(duì)任意序列進(jìn)行切割，其靶點(diǎn)3’端要求必須含有PAM序列(如SpCas9蛋白要求PAM序列為NGG)。

最新發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)(Zetsche B,Gootenberg JS et al.Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2CRISPR-Cas system.Cell.2015Oct22；

163(3):759-71.)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)同屬CRISPR-Cas Class2系統(tǒng)，但前者僅需要一條更短的crRNA即可實(shí)現(xiàn)基因編輯，更有潛力實(shí)現(xiàn)更簡(jiǎn)單、更精確的基因組工程操作。但對(duì)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(如來(lái)源于小鼠的ATDC5細(xì)胞和來(lái)源于大鼠的C6細(xì)胞)，Cpf1蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低，從而較難實(shí)現(xiàn)基因編輯。因此，尋找一種提高Cpf1蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法勢(shì)在必行。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何對(duì)受體中的目的基因進(jìn)行基因編輯。

為解決上述技術(shù)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了一種重組病毒。

本發(fā)明所提供的重組病毒可為表達(dá)Cpf1基因的重組病毒；所述Cpf1基因?yàn)榫幋aCpf1蛋白的基因。

上述重組病毒中，所述病毒可為慢病毒或腺病毒。

所述Cpf1蛋白可為AsCpf1蛋白或FnCpf1蛋白。

所述AsCpf1蛋白可為h1)或h2)或h3)：

h1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；

h2)在h1)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

h3)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

所述FnCpf1蛋白可為i1)或i2)或i3)：

i1)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白質(zhì)；

i2)在i1)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

i3)將序列表中序列5所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

所述編碼AsCpf1蛋白的基因可為AsCpf1基因。所述AsCpf1基因的核苷酸序列可如序列表中序列1所示。

所述編碼FnCpf1蛋白的基因可為FnCpf1基因。所述FnCpf1基因的核苷酸序列可如序列表中序列4所示。

所述重組病毒的制備方法具體如下：

(1)構(gòu)建含有所述Cpf1基因的重組質(zhì)粒；

(2)制備受體的單細(xì)胞懸液；

(3)取培養(yǎng)皿，加入所述單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)；

(4)完成步驟(3)后，取所述培養(yǎng)皿，棄液相，加入DMEM培養(yǎng)基，然后逐滴加入混合物，培養(yǎng)，得到重組病毒；所述混合物含有步驟(1)構(gòu)建的含有所述Cpf1基因的重組質(zhì)粒、質(zhì)粒pGag/Pol、質(zhì)粒pRev和質(zhì)粒Pvsv-G。

上述制備方法中，所述受體可為293T細(xì)胞。

上述制備方法中，每2mL單細(xì)胞懸液(濃度為10⁷個(gè)/mL)可加入60μg步驟(1)構(gòu)建的含有所述Cpf1基因的重組質(zhì)粒、20μg質(zhì)粒pGag/Pol、20μg質(zhì)粒pRev和20μg質(zhì)粒Pvsv-G。上述制備方法中，含有所述Cpf1基因的重組質(zhì)粒具體可為含有AsCpf1基因的質(zhì)粒Y1867、含有AsCpf1基因的質(zhì)粒Y1861、含有AsCpf1基因的質(zhì)粒Y1862、含有AsCpf1基因的質(zhì)粒Y1863、含有AsCpf1基因的質(zhì)粒Y1864、含有AsCpf1基因的質(zhì)粒Y1865、含有FnCpf1基因的質(zhì)粒Y1868、含有FnCpf1基因的質(zhì)粒Y1871、含有FnCpf1基因的質(zhì)粒Y1872、含有FnCpf1基因的質(zhì)粒Y1873、含有FnCpf1基因的質(zhì)粒Y1874或含有FnCpf1基因的質(zhì)粒Y1875。所述質(zhì)粒Y1867具體可為將慢病毒穿梭載體LV6的限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列1所示的DNA分子得到。所述質(zhì)粒Y1861具體可為將慢病毒穿梭載體LV5的限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列1所示的DNA分子得到。所述質(zhì)粒Y1862具體可為將慢病毒穿梭載體LV8的限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列1所示的DNA分子得到。所述質(zhì)粒Y1863具體可為將慢病毒穿梭載體LV11的限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列1所示的DNA分子得到。所述質(zhì)粒Y1864具體可為將腺病毒載體ADV11的限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列1所示的DNA分子得到。所述質(zhì)粒Y1865具體可為將腺病毒載體ADV4的限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列1所示的DNA分子得到。所述質(zhì)粒Y1868具體可為將慢病毒穿梭載體LV6的限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列4所示的DNA分子得到。所述質(zhì)粒Y1871具體可為將慢病毒穿梭載體LV5的限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列4所示的DNA分子得到。所述質(zhì)粒Y1872具體可為將慢病毒穿梭載體LV8的限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列4所示的DNA分子得到。所述質(zhì)粒Y1873具體可為將慢病毒穿梭載體LV11的限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列4所示的DNA分子得到。所述質(zhì)粒Y1874具體可為將腺病毒載體ADV11的限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列4所示的DNA分子得到。所述質(zhì)粒Y1875具體可為將腺病毒載體ADV4的限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列4所示的DNA分子得到。所述慢病毒穿梭載體LV6、所述腺病毒載體ADV11、所述慢病毒穿梭載體LV5、所述慢病毒穿梭載體LV8、所述慢病毒穿梭載體LV11或腺病毒載體ADV4均為上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。

上述制備方法中，所述質(zhì)粒pGag/Pol、所述質(zhì)粒pRev和所述質(zhì)粒Pvsv-G均為上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。

上述制備方法中，所述步驟(3)中的培養(yǎng)可為37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

上述制備方法中，所述步驟(4)中的培養(yǎng)可為37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。

為解決上述技術(shù)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種重組載體。

本發(fā)明所提供的重組載體可為具有病毒基因組和所述Cpf1基因的重組載體；所述Cpf1基因?yàn)榫幋a所述Cpf1蛋白的基因。

上述重組載體中，所述病毒可為慢病毒或腺病毒。

所述重組載體具體可為將所述Cpf1基因插入病毒載體得到的重組載體；所述病毒載體為具有病毒基因組的載體。

所述病毒載體具體可為所述慢病毒穿梭載體LV6、所述腺病毒載體ADV11、所述慢病毒穿梭載體LV5、所述慢病毒穿梭載體LV8、所述慢病毒穿梭載體LV11或所述腺病毒載體ADV4。

所述重組載體具體可為所述質(zhì)粒Y1867、所述質(zhì)粒Y1861、所述質(zhì)粒Y1862、所述質(zhì)粒Y1863、所述質(zhì)粒Y1864、所述質(zhì)粒Y1865、所述質(zhì)粒Y1868、所述質(zhì)粒Y1871、所述質(zhì)粒Y1872、所述質(zhì)粒Y1873、所述質(zhì)粒Y1874或所述質(zhì)粒Y1875。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種CRISPR/Cpf1系統(tǒng)。

本發(fā)明所提供的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)，包括上述任一所述重組病毒，或，上述任一所述重組載體。

所述CRISPR/Cpf1系統(tǒng)中還可包括crRNA。所述crRNA可根據(jù)目的靶標(biāo)設(shè)計(jì)。

所述crRNA具體可為hRb1 AscrRNA、mRb1 AscrRNA、rRb1 AscrRNA、hP53 AscrRNA、mP53 AscrRNA、rP53 AscrRNA、h/m/rDicer1 AscrRNA、hRb1 FncrRNA、mRb1 FncrRNA、rRb1 FncrRNA、hP53 FncrRNA、mP53 FncrRNA、rP53 FncrRNA或h/m/rDicer1 FncrRNA，序列分別如下：

hRb1 AscrRNA：5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUUcccaagUUaaccaagcUcU-3’；

mRb1 AscrRNA：5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUUcccaagUUagccaagcUcU-3’；

rRb1 AscrRNA：5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUUcccacgUUagccaagcUcU-3’；

hP53 AscrRNA：5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUaUgcUgUccccggacgaUaU-3’；

mP53 AscrRNA：5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUaaggcccaagUgaagcccUc-3’；

rP53 AscrRNA：5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUcaUaagcaUgaaaaUgUcUc-3’；

h/m/rDicer1 AscrRNA：5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUgacUgccaUggcaacaagaa-3’；

hRb1 FncrRNA：5’-TAATTTCTACTGTTGTAGAT UcccaagUUaaccaagcUcU-3’；

mRb1 FncrRNA：5’-TAATTTCTACTGTTGTAGATUcccaagUUagccaagcUcU-3’；

rRb1 FncrRNA：5’-TAATTTCTACTGTTGTAGATUcccacgUUagccaagcUcU-3’；

hP53 FncrRNA：5’-TAATTTCTACTGTTGTAGATaUgcUgUccccggacgaUaU-3’；

mP53 FncrRNA：5’-TAATTTCTACTGTTGTAGATaaggcccaagUgaagcccUc-3’；

rP53 FncrRNA：5’-TAATTTCTACTGTTGTAGATcaUaagcaUgaaaaUgUcUc-3’；

h/m/rDicer1 FncrRNA：5’-TAATTTCTACTGTTGTAGATgacUgccaUggcaacaagaa-3’。

上述任一所述重組病毒在對(duì)受體中的目的基因進(jìn)行基因編輯中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述任一所述重組載體在對(duì)受體中的目的基因進(jìn)行基因編輯中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述應(yīng)用中，所述受體可為293T細(xì)胞、ATDC5細(xì)胞或C6細(xì)胞。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了對(duì)受體中的目的基因進(jìn)行基因編輯的方法。

本發(fā)明所提供的對(duì)受體中的目的基因進(jìn)行基因編輯的方法，具體可為方法一，包括如下步驟：借助CRISPR/Cpf1系統(tǒng)對(duì)受體中的目的基因進(jìn)行基因編輯；所述CRISPR/Cpf1系統(tǒng)中的Cpf1蛋白是通過(guò)將上述任一所述重組病毒導(dǎo)入所述受體提供的。

本發(fā)明所提供的對(duì)受體中的目的基因進(jìn)行基因編輯的方法，具體可為方法二，包括如下步驟：借助CRISPR/Cpf1系統(tǒng)對(duì)受體中的目的基因進(jìn)行基因編輯；所述CRISPR/Cpf1系統(tǒng)中的Cpf1蛋白是通過(guò)將上述任一所述重組載體導(dǎo)入所述受體提供的。

上述方法中，所述受體可為293T細(xì)胞、ATDC5細(xì)胞或C6細(xì)胞。

上述方法中，所述Cpf1蛋白可為AsCpf1蛋白或FnCpf1蛋白。

所述AsCpf1蛋白可為h1)或h2)或h3)：

h1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；

h2)在h1)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

h3)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

所述FnCpf1蛋白可為i1)或i2)或i3)：

i1)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白質(zhì)；

i2)在i1)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

i3)將序列表中序列5所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)證明，病毒介導(dǎo)的AsCpf1蛋白FnCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)中均造成了hRb1基因、hP53基因、hDicer1基因、mRb1基因、mP53基因、mDicer1基因、rRb1基因、rP53基因和rDicer1基因的突變。因此，病毒介導(dǎo)的AsCpf1蛋白或FnCpf1蛋白可運(yùn)用于CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯，可見(jiàn)，利用本發(fā)明所提供的重組病毒或重組載體可對(duì)受體中的目的基因進(jìn)行基因編輯，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1步驟三中5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2為實(shí)施例1步驟三中7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3為實(shí)施例2步驟三中7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

293T細(xì)胞為中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)的產(chǎn)品，目錄號(hào)為GNHu17。ATDC5細(xì)胞為Riken細(xì)胞庫(kù)的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為RCB0565。C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞為中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為T(mén)CR1；C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞在下文中簡(jiǎn)稱(chēng)C6細(xì)胞。DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司的產(chǎn)品。PBS緩沖液是用超純水稀釋PBS(10×)至10倍體積得到的；PBS(10×)為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)為E607016。T7E1為T(mén)7E1突變檢測(cè)試劑盒中的組件；T7E1突變檢測(cè)試劑盒為蘇州吉瑪基因股份有限公司的產(chǎn)品。DNA Marker為T(mén)hermo Fisher公司產(chǎn)品，產(chǎn)品名稱(chēng)為GeneRuler DNA Ladder Mix，貨號(hào)為SM0331。10×退火buffer：含10mM EDTA·2Na、1000mM NaCl的pH8.0、100mM Tris-HCl緩沖液。Trypsin-EDTA Solution為Gibco公司的產(chǎn)品。FBS為Biological Industries公司的產(chǎn)品。Polybrene為Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為H9268。6孔板為Corning公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為3516。熒光顯微鏡為Motic公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品型號(hào)為AE31-252B。lipofectamine 2000為invitrogen公司產(chǎn)品。Genomic DNA Extraction kit為T(mén)akara公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為#9765。慢病毒穿梭載體LV6、腺病毒載體ADV11、慢病毒穿梭載體LV5、慢病毒穿梭載體LV8、慢病毒穿梭載體LV11和腺病毒載體ADV4均為上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品；慢病毒穿梭載體LV6在下文中簡(jiǎn)稱(chēng)載體LV6；腺病毒載體ADV11在下文中簡(jiǎn)稱(chēng)載體ADV11；慢病毒穿梭載體LV5在下文中簡(jiǎn)稱(chēng)載體LV5；慢病毒穿梭載體LV8在下文中簡(jiǎn)稱(chēng)載體LV8；慢病毒穿梭載體LV11在下文中簡(jiǎn)稱(chēng)載體LV11；腺病毒載體ADV4在下文中簡(jiǎn)稱(chēng)載體ADV4。嘌呤霉素為SIGMA公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為58-58-2。D-Hanks solution為Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為H1387。RNAi-mate為上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為G04001。質(zhì)粒pGag/Pol、質(zhì)粒pRev和質(zhì)粒Pvsv-G均為上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。

實(shí)施例1、病毒介導(dǎo)的AsCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)中的應(yīng)用

一、靶基因和靶序列的選擇

選擇hRb1基因(Gene ID：5925)、mRb1基因(Gene ID：19645)、rRb1基因(Gene ID：24708)、hP53基因(Gene ID：7157)、mP53基因(Gene ID：22059)、rP53基因(Gene ID：24842)、hDicer1基因(Gene ID：23405)、mDicer1基因(Gene ID：192119)和rDicer1基因(Gene ID：299284)作為檢測(cè)CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的基因編輯能力的靶基因。

根據(jù)hRb1基因的核苷酸序列選擇靶序列1，根據(jù)mRb1基因的核苷酸序列選擇靶序列2，根據(jù)rRb1基因的核苷酸序列選擇靶序列3，根據(jù)hP53基因的核苷酸序列選擇靶序列4，根據(jù)mP53基因的核苷酸序列選擇靶序列5，根據(jù)rP53基因的核苷酸序列選擇靶序列6，根據(jù)hDicer1基因的核苷酸序列選擇靶序列7，根據(jù)mDicer1基因的核苷酸序列選擇靶序列7，根據(jù)rDicer1基因的核苷酸序列選擇靶序列7。上述靶序列的核苷酸序列如下：

靶序列1：5’-tcccaagttaaccaagctctctc-3’；

靶序列2：5’-tcccaagttagccaagctctttc-3’；

靶序列3：5’-tcccacgttagccaagctctctc-3’；

靶序列4：5’-atgctgtccccggacgatattga-3’；

靶序列5：5’-aaggcccaagtgaagccctccga-3’；

靶序列6：5’-cataagcatgaaaatgtctcctg-3’；

靶序列7：5’-gactgccatggcaacaagaagca-3’。

二、化學(xué)合成的crRNA的制備

合成表1中所示的crRNA。表1中，單下劃線為As crRNA骨架序列，雙下劃線為靶序列1自5’末端起第1至20位，粗下劃線為靶序列2自5’末端起第1至20位，點(diǎn)式下劃線為靶序列3自5’末端起第1至20位，虛下劃線為靶序列4自5’末端起第1至20位，點(diǎn)－短線下劃線為靶序列5自5’末端起第1至20位，波浪線為靶序列6自5’末端起第1至20位，點(diǎn)－點(diǎn)－短線下劃線為靶序列7自5’末端起第1至20位。表1中所示的所有crRNA為均1OD(33μg)一管，每管中加入66μL DEPC水，得到RNA濃度均為0.5μg/μL的crRNA溶液。

表1.化學(xué)合成的crRNA的基本信息

三、檢測(cè)病毒介導(dǎo)的AsCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1系統(tǒng)中的基因編輯能力

1、質(zhì)粒Y1867的構(gòu)建

AsCpf1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。編碼AsCpf1蛋白的基因命名為AsCpf1基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，

(1)人工合成序列表中序列1所示的雙鏈DNA分子。

(2)以步驟(1)合成的雙鏈DNA分子為模板，以上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成的F：5’-AGGGTTCCAAGCTTAAGCGGCCGCGCCACCATGACACAGTTCGAGGGCTTTACCAACCTGTATCAGGTG-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶NotI的酶切識(shí)別序列)和R：5’-ATCAGTAGAGAGTGTCGGATCCTTAGGCATAGTCGGGGACATCATATGGGTATGCATAATC-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶BamHI的酶切識(shí)別序列)為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約4100bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

(3)用限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

(4)用限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI雙酶切載體LV6，回收約2600bp的載體骨架。

(5)將酶切產(chǎn)物和載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒LV6－Y1867。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒LV6－Y1867進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將載體LV6的限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列1所示的DNA分子。重組質(zhì)粒LV6－Y1867含有AsCpf1基因的核苷酸序列，表達(dá)AsCpf1蛋白。在下文中，重組質(zhì)粒LV6－Y1867簡(jiǎn)稱(chēng)為質(zhì)粒Y1867。

2、Y1867病毒液和Y1867病毒稀釋液的獲得

(1)Y1867病毒液的獲得

a、將293T細(xì)胞置于裝有含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待293T細(xì)胞培養(yǎng)至80～90％融合時(shí)，接種至新的培養(yǎng)皿，然后棄液相，用1mL D-Hanks solution洗滌兩次。

b、完成步驟a后，向所述培養(yǎng)皿中加入1mL Trypsin-EDTA Solution，混勻，棄液相，然后37℃靜置3min。

c、完成步驟b后，向所述培養(yǎng)皿中加入2mL含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)吹打，形成單細(xì)胞懸液。

d、完成步驟c后，將所述單細(xì)胞懸液接種于直徑為15cm的培養(yǎng)皿，加入18mL含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

e、完成步驟d后，取所述培養(yǎng)皿，棄液相，先加入8mLDMEM培養(yǎng)基，然后逐滴加入混合物，輕輕混勻，然后37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。

所述混合物為將溶液甲(將1.5mLDMEM培養(yǎng)基、60μg質(zhì)粒Y1867和1.5mL包裝質(zhì)粒溶液(含20μg質(zhì)粒pGag/Pol、20μg質(zhì)粒pRev和20μg質(zhì)粒Pvsv-G)混勻，然后室溫靜置5min)和溶液乙(將1.5mLDMEM培養(yǎng)基和300μLRNAi-mate混勻，然后室溫靜置5min)混勻，然后室溫靜置20min得到的。

f、完成步驟e后，取所述培養(yǎng)皿，棄液相，加入18mL含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

g、完成步驟f后，取所述培養(yǎng)皿，取上清，然后4℃、4000rpm離心4min，得到上清液；將所述上清液用0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾，得到濾液；將所述濾液4℃、20000rpm離心2h，得到Y(jié)1867病毒液。

(2)Y1867病毒稀釋液的獲得

取Y1867病毒液，用含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋至5倍體積，獲得Y1867病毒稀釋液。

3、ATDC5－Y1867穩(wěn)定株、C6－Y1867穩(wěn)定株和293T－Y1867穩(wěn)定株的構(gòu)建

(1)將ATDC5細(xì)胞置于裝有含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑為6cm)，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待ATDC5細(xì)胞培養(yǎng)至80～90％融合時(shí)，棄液相，ATDC5細(xì)胞用3mL PBS緩沖液洗滌兩次。

(2)完成步驟(1)后，向所述培養(yǎng)皿中加入1mLTrypsin-EDTA Solution，混勻，棄液相，然后37℃靜置3min。

(3)完成步驟(2)后，向所述培養(yǎng)皿中加入2mLDMEM培養(yǎng)基，反復(fù)吹打，形成單細(xì)胞懸液。

(4)完成步驟(3)后，將所述單細(xì)胞懸液接種于6孔板(每孔約接種1×10⁶個(gè)ATDC5細(xì)胞)，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

(5)完成步驟(4)后，取所述6孔板，每孔加入Polybrene和1mL的Y1867病毒稀釋液，得到混合液；該混合液中，Polybrene的濃度為5μg/mL。

(6)完成步驟(5)后，將6孔板隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(由3個(gè)實(shí)驗(yàn)孔組成)和對(duì)照組(由3個(gè)對(duì)照孔組成)，然后進(jìn)行如下操作：

A、實(shí)驗(yàn)孔

①取所述6孔板，棄液相，每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔加入2mL含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)至80～90％融合時(shí)，加入嘌呤霉素，得到混合液(該混合液中，嘌呤霉素的濃度為1.5μg/mL)，然后置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。

②完成步驟①后，棄液相，每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔加入2mL含10％(體積比)FBS和1.5μg/mL嘌呤霉素的DMEM培養(yǎng)基，然后置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

③同步驟②。

④同步驟③。

B、對(duì)照孔

①取所述6孔板，棄液相，每個(gè)對(duì)照孔加入2mL含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)至80～90％融合時(shí)，再置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。

②完成步驟①后，棄液相，每個(gè)對(duì)照孔加入2mL含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基，然后置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

③同步驟②。

④同步驟③。

結(jié)果判斷：待對(duì)照孔中的ATDC5細(xì)胞全部死亡后，實(shí)驗(yàn)孔中的ATDC5細(xì)胞即為ATDC5－Y1867穩(wěn)定株。

按照上述方法，將ATDC5細(xì)胞替換為C6細(xì)胞，其它步驟均不變，得到C6－Y1867穩(wěn)定株。

按照上述方法，將ATDC5細(xì)胞替換為293T細(xì)胞，其它步驟均不變，得到293T－Y1867穩(wěn)定株。

4、轉(zhuǎn)染

獲得hRb1－Y1867－293T細(xì)胞組的方法如下：

①取EP管，加入250μL DMEM培養(yǎng)基和含3μghRb1AscrRNA的crRNA溶液，混勻，室溫靜置5min，得到混合液甲；另取一EP管，加入250μL DMEM培養(yǎng)基和8μLlipofectamin2000，混勻，室溫靜置5min，得到混合液乙；將混合液甲和混合液乙混合，室溫靜置20min，得到轉(zhuǎn)染混合物。

②將293T－Y1867穩(wěn)定株置于裝有10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)至80～90％融合時(shí)，接種于6孔板(每孔約接種1×10⁶個(gè)細(xì)胞)，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

③完成步驟②后，取所述6孔板，棄液相，然后逐滴加入轉(zhuǎn)染混合物，混勻，然后置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中溫育5h。

④完成步驟③后，取所述6孔板，棄液相，然后加入含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

⑤重復(fù)步驟③一次。

⑥重復(fù)步驟④一次。

⑦完成步驟⑥后，取所述6孔板，棄液相，加入2mL含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

⑧完成步驟⑦后，1000rpm離心3min，得到沉淀。沉淀即為hRb1AscrRNA轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞組，簡(jiǎn)稱(chēng)hRb1－Y1867－293T細(xì)胞組。

按照上述的方法，將①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液分別替換為含3μg hP53 AscrRNA的crRNA溶液和含3μg h/m/rDicer1 AscrRNA的crRNA溶液，其它步驟均不變，得到hP53 －Y1867－293T細(xì)胞組和hDicer1－Y1867－293T細(xì)胞組。

按照上述的方法，將①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液分別替換為含3μg mRb1 AscrRNA的crRNA溶液、含3μg mP53 AscrRNA的crRNA溶液和含3μg h/m/rDicer1 AscrRNA的crRNA溶液，將②中293T－Y1867穩(wěn)定株替換為ATDC5－Y1867穩(wěn)定株，其它步驟均不變，得到mRb1－Y1867－ATDC5細(xì)胞組、mP53－Y1867－ATDC5細(xì)胞組和mDicer1－Y1867－ATDC5細(xì)胞組。

按照上述的方法，將①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液分別替換為含3μg rRb1 AscrRNA的crRNA溶液、含3μg rP53 AscrRNA的crRNA溶液和含3μg h/m/rDicer1 AscrRNA的crRNA溶液，將②中293T－Y1867穩(wěn)定株替換為C6－Y1867穩(wěn)定株，其它步驟均不變，得到rRb1－Y1867－C6細(xì)胞組、rP53－Y1867－C6細(xì)胞組和rDicer1－Y1867－C6細(xì)胞組。

按照上述的方法，將①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液替換為水，其它步驟均不變，得到Y(jié)1867－293T細(xì)胞組，作為空白對(duì)照。

按照上述的方法，將①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液替換為水，將②中293T－Y1867穩(wěn)定株替換為C6－Y1867穩(wěn)定株，其它步驟均不變，得到Y(jié)1867－C6細(xì)胞組，作為空白對(duì)照。

按照上述的方法，將①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液替換為水，將②中293T－Y1867穩(wěn)定株替換為ATDC5－Y1867穩(wěn)定株，其它步驟均不變，得到Y(jié)1867－ATDC5細(xì)胞組，作為空白對(duì)照。

5、熒光檢測(cè)

將上述步驟4獲得的各個(gè)細(xì)胞組在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

部分結(jié)果見(jiàn)圖1(圖1中A、C和E為在熒光視野下的觀察結(jié)果，B、D和F為在白光視野下的觀察結(jié)果，A和B為mP53－Y1867－ATDC5細(xì)胞組，C和D為rP53－Y1867－C6細(xì)胞組，E和F為hP53－Y1867－293T細(xì)胞組)。結(jié)果表明，慢病毒介導(dǎo)的AsCpf1基因能夠有效包裝慢病毒并侵染ATDC5細(xì)胞、C6細(xì)胞或293T細(xì)胞。

6、各細(xì)胞組的基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的獲得

(1)用Genomic DNA Extraction kit分別提取步驟4獲得的各個(gè)細(xì)胞組的基因組DNA。

(2)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的獲得

以hRb1－Y1867－293T細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-AGAAGTGTTTTGCTGCTTTGAAG-3’和5’-GATTACAGGCATGAACCACCGTG-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約408bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1。

以hP53－Y1867－293T細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TTCCATGGGACTGACTTTCTGCT-3’和5’-GGCATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約694bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2。

以hDicer1－Y1867－293T細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-AAGGTACAGAATGCTTGACTCCT-3’和5’-ATTAATCAGAAGTGGGAGGCCTG-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約515bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3。

以mRb1－Y1867－ATDC5細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TTCCGTCTTCCCAGTGTGCTTTA-3’和5’-TCAGAATCATCACCACAGCCACT-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約655bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6。

以mP53－Y1867－ATDC5細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TCCCCTTGCCTGAGAGAAACAAA-3’和5’-ACTCACCGTGCACATAACAGACT-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約612bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7。

以mDicer1－Y1867－ATDC5細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TTTAATGCCTGCCTGTACGTTGG-3’和5’-TTAATCAGAAGAGGCGGGCTTGA-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約719bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8。

以rRb1－Y1867－C6細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TGCTGCTCTGGATGTATGTGGTT-3’和5’-AAAGTTGGAAGGCGGAGATGAGA-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約610bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物9。

以rP53－Y1867－C6細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-CCTGCGCATAAGTTCCCCAAAAT-3’和5’-ACAGAATCTCACTTACCCCAGGC-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約502bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10。

以rDicer1－Y1867－C6細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TCCTTTGTTTTAACCCCGCATGG-3’和5’-ATGACATGCGTGACTGAACCCTA-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約506bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物11。

以Y1867－ATDC5細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TTTAATGCCTGCCTGTACGTTGG-3’和5’-TTAATCAGAAGAGGCGGGCTTGA-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約719bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物12，作為空白對(duì)照。

以Y1867－C6細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TCCTTTGTTTTAACCCCGCATGG-3’和5’-ATGACATGCGTGACTGAACCCTA-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約506bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物13，作為空白對(duì)照。

以Y1867－293T細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TTCCATGGGACTGACTTTCTGCT-3’和5’-GGCATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約694bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物14，作為空白對(duì)照。

7、T7E1突變檢測(cè)

(1)退火樣品的制備

①將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1進(jìn)行膠回收，得到回收產(chǎn)物1。

②完成步驟①后，將回收產(chǎn)物1和野生型DNA等摩爾混合，得到樣品1。野生型DNA的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。

③完成步驟②后，配制退火反應(yīng)體系，然后進(jìn)行退火反應(yīng)，得到退火樣品1。

退火反應(yīng)體系包括退火樣品1 1～3μg、突變檢測(cè)buffer 3μL，用ddH₂O補(bǔ)至30μL。

退火反應(yīng)條件為：首先98℃10min，然后緩慢降溫(降溫速度<1℃/10s)至25℃，最后25℃5min。

按照上述方法，將步驟①中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1分別替換為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物9、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物11、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物12、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物13和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物14，其它步驟均不變，得到退火樣品2、退火樣品3、退火樣品6、退火樣品7、退火樣品8、退火樣品9、退火樣品10、退火樣品11、退火樣品12、退火樣品13和退火樣品14。

(2)T7E1處理

取步驟(1)制備的退火樣品(退火樣品1、退火樣品2、退火樣品3、退火樣品6、退火樣品7、退火樣品8、退火樣品9、退火樣品10、退火樣品11、退火樣品12、退火樣品13或退火樣品14)20μL，加入0.5μL T7E1，得到處理體系；然后37℃條件下反應(yīng)30min。

(3)電泳分析和結(jié)果判斷

將完成步驟(2)的處理體系用濃度為1.8％的瓊脂糖凝膠電泳分析，然后進(jìn)行如下結(jié)果判斷：

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為56bp和352bp、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成hRb1基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成hRb1基因的突變；

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為269bp和425bp、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成hP53基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成hP53基因的突變；

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為192bp和323p、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成hDicer1基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成hDicer1基因的突變；

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為258bp和399bp、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成mRb1基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成mRb1基因的突變；

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為189bp和423bp、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成mP53基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成mP53基因的突變；

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為154bp和565p、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成mDicer1基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成mDicer1基因的突變；

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物9可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為270bp和340bp、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成rRb1基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物9被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成rRb1基因的突變；

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為270bp和232bp、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成rP53基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成rP53基因的突變；

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物11可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為229bp和277p、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成rDicer1基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物11被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成rDicer1基因的突變。

T7E1突變檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2(圖2中A從左至右依次為：hRb1為hRb1－Y1867－293T細(xì)胞組，hP53為hP53－Y1867－293T細(xì)胞組，hDicer1為hDicer1－Y1867－293T細(xì)胞組，M為DNA Marker，rRb1為rRb1－Y1867－C6細(xì)胞組，rP53為rP53－Y1867－C6細(xì)胞組，rDicer1為rDicer1－Y1867－C6細(xì)胞組，blank為Y1867－293T細(xì)胞組；圖2中B：M為DNA Marker，mRb1為mRb1－Y1867－ATDC5細(xì)胞組，mP53為mP53－Y1867－ATDC5細(xì)胞組，mDicer1為mDicer1－Y1867－ATDC5細(xì)胞組，ATDC5為Y1867－ATDC5細(xì)胞組)。結(jié)果表明，慢病毒介導(dǎo)的AsCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)中均造成了hP53基因、mRb1基因、mP53基因、rRb1基因、rP53基因和rDicer1基因的突變。因此，慢病毒介導(dǎo)的AsCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)中有一定的基因編輯能力。

8、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-TTGACTTACCATGCAAGCAAATA-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-GATCCCCACTTTTCCTCTTGCAG-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-TACCCAGCTCACTAGGACAGACA-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-TTCAAAACTGTGCTGGTGTGTGC-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-GTTGGGTGTCTGTAAATCCTGCG-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-CCCTGCATGGTTGTGTAATGGTA-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物9進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-GCTTTGTCTCAACGCTGTCTCGC-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-CATCTCCCTGCCAGATAGTCCAC-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物11進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-CCAAACCGACCATGGGAAGAATC-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物12進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-CCCTGCATGGTTGTGTAATGGTA-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物13進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-CCAAACCGACCATGGGAAGAATC-3’。

上述測(cè)序均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

部分測(cè)序結(jié)果如下：

(1)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物9的測(cè)序結(jié)果為：

(2)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10的測(cè)序結(jié)果為：

(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物11的測(cè)序結(jié)果為：

測(cè)序結(jié)果表明，慢病毒介導(dǎo)的AsCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)中均造成了hRb1基因、hP53基因、hDicer1基因、mRb1基因、mP53基因、mDicer1基因、rRb1基因、rP53基因和rDicer1基因的突變，尤其對(duì)rRb1基因和rP53基因的突變效果最為明顯。因此，慢病毒介導(dǎo)的AsCpf1蛋白可運(yùn)用于CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯。

按照上述步驟三的方法，將質(zhì)粒Y1867替換為質(zhì)粒Y1861、質(zhì)粒Y1862或質(zhì)粒Y1863，其它步驟均不變，結(jié)果表明，慢病毒介導(dǎo)的AsCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)中均造成了hRb1基因、hP53基因、hDicer1基因、mRb1基因、mP53基因、mDicer1基因、rRb1基因、rP53基因和rDicer1基因的突變。質(zhì)粒Y1861為將載體LV5的限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。質(zhì)粒Y1862為將載體LV8的限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。質(zhì)粒Y1863為將載體LV11的限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。因此，慢病毒介導(dǎo)的AsCpf1蛋白可運(yùn)用于CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯。

按照上述步驟三的方法，將質(zhì)粒Y1867替換為質(zhì)粒Y1864或質(zhì)粒Y1865，其它步驟均不變，結(jié)果表明，腺病毒介導(dǎo)的AsCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)中均造成了hRb1基因、hP53基因、hDicer1基因、mRb1基因、mP53基因、mDicer1基因、rRb1基因、rP53基因和rDicer1基因的突變。質(zhì)粒Y1864為將載體ADV11的限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。質(zhì)粒Y1865為將載體ADV4的限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。因此，腺病毒介導(dǎo)的AsCpf1蛋白可運(yùn)用于CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯。

上述結(jié)果表明，慢病毒或腺病毒介導(dǎo)的AsCpf1蛋白可運(yùn)用于CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯。

實(shí)施例2、病毒介導(dǎo)的FnCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)中的應(yīng)用

一、靶基因和靶序列的選擇

同實(shí)施例1步驟一。

二、化學(xué)合成的crRNA的制備

合成表2中所示的crRNA。表2中，單下劃線為Fn crRNA骨架序列雙下劃線為靶序列1自5’末端起第1至20位，粗下劃線為靶序列2自5’末端起第1至20位，點(diǎn)式下劃線為靶序列3自5’末端起第1至20位，虛下劃線為靶序列4自5’末端起第1至20位，點(diǎn)－短線下劃線為靶序列5自5’末端起第1至20位，波浪線為靶序列6自5’末端起第1至20位，點(diǎn)－點(diǎn)－短線下劃線為靶序列7自5’末端起第1至20位。

表2中所示的所有crRNA為均1OD(33μg)一管，每管中加入66μL DEPC水，得到RNA濃度均為0.5μg/μL的crRNA溶液。

表2.化學(xué)合成的crRNA的基本信息

三、檢測(cè)病毒介導(dǎo)的FnCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1系統(tǒng)中的基因編輯能力

1、質(zhì)粒Y1868的構(gòu)建

FnCpf1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示。編碼FnCpf1蛋白的基因命名為FnCpf1基因，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，

(1)人工合成序列表中序列4所示的雙鏈DNA分子。

(2)以步驟(1)合成的雙鏈DNA分子為模板，以上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成的F：5’-AGGGTTCCAAGCTTAAGCGGCCGCGCCACCATGAGCATCTACCAGGAGTTCGTCAACAAGTATTCACTG-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶NotI的酶切識(shí)別序列)和R：5’-ATCAGTAGAGAGTGTCGGATCCTTAGGCATAGTCGGGGACATCATATGGGTATGCATAATC-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶BamHI的酶切識(shí)別序列)為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約4100bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

(3)用限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

(4)用限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI雙酶切載體LV6，回收約2600bp的載體骨架。

(5)將酶切產(chǎn)物和載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒LV6－Y1868。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒LV6－Y1868進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將載體LV6的限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列4所示的DNA分子。重組質(zhì)粒LV6－Y1868含有FnCpf1基因的核苷酸序列，表達(dá)FnCpf1蛋白。在下文中，重組質(zhì)粒LV6－Y1868簡(jiǎn)稱(chēng)為質(zhì)粒Y1868。

2、Y1868病毒液和Y1868病毒稀釋液的獲得

(1)Y1868病毒液的獲得

a、將293T細(xì)胞置于裝有含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待293T細(xì)胞培養(yǎng)至80～90％融合時(shí)，接種至新的培養(yǎng)皿，然后棄液相，用1mL D-Hanks solution洗滌兩次。

b、完成步驟a后，向所述培養(yǎng)皿中加入1mL Trypsin-EDTA Solution，混勻，棄液相，然后37℃靜置3min。

c、完成步驟b后，向所述培養(yǎng)皿中加入2mL含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)吹打，形成單細(xì)胞懸液。

d、完成步驟c后，將所述單細(xì)胞懸液接種于直徑為15cm的培養(yǎng)皿，加入18mL含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

e、完成步驟d后，取所述培養(yǎng)皿，棄液相，先加入8mLDMEM培養(yǎng)基，然后逐滴加入混合物，輕輕混勻，然后37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。

所述混合物為將溶液1(將1.5mLDMEM培養(yǎng)基、60μg質(zhì)粒Y1868和1.5mL包裝質(zhì)粒溶液(含20μg質(zhì)粒pGag/Pol、20μg質(zhì)粒pRev和20μg質(zhì)粒Pvsv-G)混勻，然后室溫靜置5min)和溶液2(將1.5mLDMEM培養(yǎng)基和300μLRNAi-mate混勻，然后室溫靜置5min)混勻，然后室溫靜置20min得到的。

f、完成步驟e后，取所述培養(yǎng)皿，棄液相，加入18mL含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

g、完成步驟f后，取所述培養(yǎng)皿，取上清，然后4℃、4000rpm離心4min，得到上清液；將所述上清液用0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾，得到濾液；將所述濾液4℃、20000rpm離心2h，得到Y(jié)1868病毒液。

(2)Y1868病毒稀釋液的獲得

取Y1868病毒液，用含10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋至5倍體積，獲得Y1868病毒稀釋液。

3、ATDC5－Y1868穩(wěn)定株、C6－Y1868穩(wěn)定株和293T－Y1868穩(wěn)定株的構(gòu)建

(1)同實(shí)施例1步驟三3中(1)。

(2)同實(shí)施例1步驟三3中(2)。

(3)同實(shí)施例1步驟三3中(3)。

(4)同實(shí)施例1步驟三3中(4)。

(5)完成步驟(4)后，取所述6孔板，每孔加入Polybrene和1mL的Y1868病毒稀釋液，得到混合液；該混合液中，Polybrene的濃度為5μg/mL。

(6)同實(shí)施例1步驟三3中(6)。

結(jié)果判斷：待對(duì)照孔中的ATDC5細(xì)胞全部死亡后，實(shí)驗(yàn)孔中的ATDC5細(xì)胞即為ATDC5－Y1868穩(wěn)定株。

按照上述方法，將ATDC5細(xì)胞替換為C6細(xì)胞，其它步驟均不變，得到C6－Y1868穩(wěn)定株。按照上述方法，將ATDC5細(xì)胞替換為293T細(xì)胞，其它步驟均不變，得到293T－Y1868穩(wěn)定株。

4、轉(zhuǎn)染

獲得hRb1－Y1868－293T細(xì)胞組的方法如下：

①同實(shí)施例1步驟三4中①。

②將293T－Y1868穩(wěn)定株置于裝有10％(體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑為10cm)，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)至80～90％融合時(shí)，接種于6孔板(每孔約接種1×10⁶個(gè)細(xì)胞)，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

③同實(shí)施例1步驟三4中③。

④同實(shí)施例1步驟三4中④。

⑤重復(fù)步驟③一次。

⑥重復(fù)步驟④一次。

⑦同實(shí)施例1步驟三4中⑦。

⑧完成步驟⑦后，1000rpm離心3min，得到沉淀。沉淀即為hRb1AscrRNA轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞組，簡(jiǎn)稱(chēng)hRb1－Y1868－293T細(xì)胞組。

按照上述的方法，將①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液分別替換為含3μg hP53 AscrRNA的crRNA溶液和含3μg h/m/rDicer1 AscrRNA的crRNA溶液，其它步驟均不變，得到hP53－Y1868－293T細(xì)胞組和hDicer1－Y1868－293T細(xì)胞組。

按照上述的方法，將①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液分別替換為含3μg mRb1 AscrRNA的crRNA溶液、含3μg mP53 AscrRNA的crRNA溶液和含3μg h/m/rDicer1 AscrRNA的crRNA溶液，將②中293T－Y1868穩(wěn)定株替換為ATDC5－Y1868穩(wěn)定株，其它步驟均不變，得到mRb1－Y1868－ATDC5細(xì)胞組、mP53－Y1868－ATDC5細(xì)胞組和mDicer1－Y1868－ATDC5細(xì)胞組。

按照上述的方法，將①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液分別替換為含3μg rRb1 AscrRNA的crRNA溶液、含3μg rP53 AscrRNA的crRNA溶液和含3μg h/m/rDicer1 AscrRNA的crRNA溶液，將②中293T－Y1868穩(wěn)定株替換為C6－Y1868穩(wěn)定株，其它步驟均不變，得到rRb1－Y1868－C6細(xì)胞組、rP53－Y1868－C6細(xì)胞組和rDicer1－Y1868－C6細(xì)胞組。

按照上述的方法，將①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液替換為水，其它步驟均不變，得到Y(jié)1868－293T細(xì)胞組，作為空白對(duì)照。

按照上述的方法，將①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液替換為水，將②中293T－Y1868穩(wěn)定株替換為C6－Y1868穩(wěn)定株，其它步驟均不變，得到Y(jié)1868－C6細(xì)胞組，作為空白對(duì)照。

按照上述的方法，將①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液替換為水，將②中293T－Y1868穩(wěn)定株替換為ATDC5－Y1868穩(wěn)定株，其它步驟均不變，得到Y(jié)1868－ATDC5細(xì)胞組，作為空白對(duì)照。

5、熒光檢測(cè)

將上述步驟4獲得的各個(gè)細(xì)胞組在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，慢病毒介導(dǎo)的FnCpf1基因能夠有效包裝慢病毒并侵染ATDC5細(xì)胞、C6細(xì)胞或293T細(xì)胞。

6、各細(xì)胞組的基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的獲得

(1)用Genomic DNA Extraction kit分別提取步驟4獲得的各個(gè)細(xì)胞組的基因組DNA。

(2)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的獲得

以hRb1－Y1868－293T細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-AGAAGTGTTTTGCTGCTTTGAAG-3’和5’-GATTACAGGCATGAACCACCGTG-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約408bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a。

以hP53－Y1868－293T細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TTCCATGGGACTGACTTTCTGCT-3’和5’-GGCATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約694bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物b。

以hDicer1－Y1868－293T細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-AAGGTACAGAATGCTTGACTCCT-3’和5’-ATTAATCAGAAGTGGGAGGCCTG-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約515bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物c。

以mRb1－Y1868－ATDC5細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以以5’-TTCCGTCTTCCCAGTGTGCTTTA-3’和5’-TCAGAATCATCACCACAGCCACT-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約655bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物f。

以mP53－Y1868－ATDC5細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TCCCCTTGCCTGAGAGAAACAAA-3’和5’-ACTCACCGTGCACATAACAGACT-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約612bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物g。

以mDicer1－Y1868－ATDC5細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TTTAATGCCTGCCTGTACGTTGG-3’和5’-TTAATCAGAAGAGGCGGGCTTGA-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約719bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物h。

以rRb1－Y1868－C6細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TGCTGCTCTGGATGTATGTGGTT-3’和5’-AAAGTTGGAAGGCGGAGATGAGA-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約610bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物i。

以rP53－Y1868－C6細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-CCTGCGCATAAGTTCCCCAAAAT-3’和5’-ACAGAATCTCACTTACCCCAGGC-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約502bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物j。

以rDicer1－Y1868－C6細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TCCTTTGTTTTAACCCCGCATGG-3’和5’-ATGACATGCGTGACTGAACCCTA-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約506bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物k。

以Y1868－ATDC5細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TTTAATGCCTGCCTGTACGTTGG-3’和5’-TTAATCAGAAGAGGCGGGCTTGA-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約719bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物l，作為空白對(duì)照。

以Y1868－C6細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TCCTTTGTTTTAACCCCGCATGG-3’和5’-ATGACATGCGTGACTGAACCCTA-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約506bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物m，作為空白對(duì)照。

以Y1868－293T細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以5’-TTCCATGGGACTGACTTTCTGCT-3’和5’-GGCATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約694bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物n，作為空白對(duì)照。

7、T7E1突變檢測(cè)

(1)退火樣品的制備

①將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a進(jìn)行膠回收，得到回收產(chǎn)物a。

②完成步驟①后，將回收產(chǎn)物a和野生型DNA等摩爾混合，得到樣品a。野生型DNA的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。

③完成步驟②后，配制退火反應(yīng)體系，然后進(jìn)行退火反應(yīng)，得到退火樣品a。

退火反應(yīng)體系包括退火樣品a 1～3μg、突變檢測(cè)buffer 3μL，用ddH₂O補(bǔ)至30μL。

退火反應(yīng)條件為：首先98℃10min，然后緩慢降溫(降溫速度<1℃/10s)至25℃，最后25℃5min。

按照上述方法，將步驟①中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a分別替換為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物b、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物c、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物f、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物g、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物h、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物i、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物j、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物k、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物l、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物m和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物n，其它步驟均不變，得到退火樣品b、退火樣品c、退火樣品f、退火樣品g、退火樣品h、退火樣品i、退火樣品j、退火樣品k、退火樣品l、退火樣品m和退火樣品n。

(2)T7E1處理

取步驟(1)制備的退火樣品(退火樣品a、退火樣品b、退火樣品c、退火樣品f、退火樣品g、退火樣品h、退火樣品i、退火樣品j、退火樣品k、退火樣品l、退火樣品m或退火樣品n)20μL，加入0.5μL T7E1，得到處理體系；然后37℃條件下反應(yīng)30min。

(3)電泳分析和結(jié)果判斷

將完成步驟(2)的處理體系用濃度為1.8％的瓊脂糖凝膠電泳分析，然后進(jìn)行如下結(jié)果判斷：

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為56bp和352bp、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成hRb1基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成hRb1基因的突變；

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物b可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為269bp和425bp、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成hP53基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物b被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成hP53基因的突變；

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物c可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為192bp和323p、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成hDicer1基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物c被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成hDicer1基因的突變；

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物f可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為258bp和399bp、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成mRb1基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物f被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成mRb1基因的突變；

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物g可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為189bp和423bp、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成mP53基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物g被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成mP53基因的突變；

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物h可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為154bp和565p、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成mDicer1基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物h被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成mDicer1基因的突變；

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物i可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為270bp和340bp、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成rRb1基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物i被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成rRb1基因的突變；

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物j可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為270bp和232bp、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成rP53基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物j被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成rP53基因的突變；

如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物k可被T7EⅠ酶切為兩段且大小分別約為229bp和277p、說(shuō)明相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)造成rDicer1基因的突變；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物k被T7EⅠ酶切后的大小無(wú)明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不造成rDicer1基因的突變。

T7E1突變檢測(cè)的部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3(圖3中A從左至右依次為：hP53為hP53－Y1868－293T細(xì)胞組，hDicer1為hDicer1－Y1868－293T細(xì)胞組，293T為Y1868－293T細(xì)胞組，M為DNA Marker，mRb1為mRb1－Y1868－ATDC5細(xì)胞組，mP53為mP53－Y1868－ATDC5細(xì)胞組，mDicer1為mDicer1－Y1868－ATDC5細(xì)胞組，ATDC5為Y1868－ATDC5細(xì)胞組；圖3中B：rRb1和rRb1－2均為rRb1－Y1868－C6細(xì)胞組，rP53和rP53－2均為rP53－Y1868－C6細(xì)胞組，rDicer1為rDicer1－Y1868－C6細(xì)胞組，C6為Y1868－C6細(xì)胞組，M為DNA Marker)。結(jié)果表明，慢病毒介導(dǎo)的FnCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)中均造成了hP53基因和rP53基因的突變。因此，慢病毒介導(dǎo)的FnCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)中有一定的基因編輯能力。

8、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-TTGACTTACCATGCAAGCAAATA-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物b進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-GATCCCCACTTTTCCTCTTGCAG-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物c 進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-TACCCAGCTCACTAGGACAGACA-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物f進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-TTCAAAACTGTGCTGGTGTGTGC-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物g進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-GTTGGGTGTCTGTAAATCCTGCG-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物h進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-CCCTGCATGGTTGTGTAATGGTA-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物i進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-GCTTTGTCTCAACGCTGTCTCGC-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物j進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-CATCTCCCTGCCAGATAGTCCAC-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物k進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-CCAAACCGACCATGGGAAGAATC-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物l進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-CCCTGCATGGTTGTGTAATGGTA-3’。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物m進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5’-CCAAACCGACCATGGGAAGAATC-3’。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物j的測(cè)序結(jié)果為

測(cè)序結(jié)果表明，慢病毒介導(dǎo)的FnCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)中均造成了hRb1基因、hP53基因、hDicer1基因、mRb1基因、mP53基因、mDicer1基因、rRb1基因、rP53基因和rDicer1基因的突變，尤其對(duì)rP53基因的突變效果最為明顯。因此，慢病毒介導(dǎo)的FnCpf1蛋白可運(yùn)用于CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯。

按照上述步驟三的方法，將質(zhì)粒Y1868替換為質(zhì)粒Y1871、質(zhì)粒Y1872或質(zhì)粒Y1873，其它步驟均不變，結(jié)果表明，慢病毒介導(dǎo)的FnCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)中均造成了hRb1基因、hP53基因、hDicer1基因、mRb1基因、mP53基因、mDicer1基因、rRb1基因、rP53基因和rDicer1基因的突變。質(zhì)粒Y1871為將載體LV5的限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列4所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。質(zhì)粒Y1872為將載體LV8的限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列4所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。質(zhì)粒Y1873為將載體LV11的限制性內(nèi)切酶NotI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列4所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。因此，慢病毒介導(dǎo)的FnCpf1蛋白可運(yùn)用于CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯。

按照上述步驟三的方法，將質(zhì)粒Y1868替換為質(zhì)粒Y1874或質(zhì)粒Y1875，其它步驟均不變，結(jié)果表明，腺病毒介導(dǎo)的FnCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)中均造成了hRb1基因、hP53基因、hDicer1基因、mRb1基因、mP53基因、mDicer1基因、rRb1基因、rP53基因和rDicer1基因的突變。質(zhì)粒Y1874為將載體ADV11的限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列4所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。質(zhì)粒Y1875為將載體ADV4的限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI識(shí)別序列間的片段替換為序列表中序列4所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。因此，腺病毒介導(dǎo)的FnCpf1蛋白可運(yùn)用于CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯。

上述結(jié)果表明，慢病毒或腺病毒介導(dǎo)的FnCpf1蛋白可運(yùn)用于CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯。