本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，主要涉及一種應(yīng)用改良的Trizol法高效提取真菌總RNA的方法。

背景技術(shù)：

葡萄(Vitis vinifera L.)一直是全世界最重要的水果之一，占全球水果種植面積的10％以上，不僅可以鮮食還可以釀酒、制干和制汁等加工。截至2013年底，我國葡萄栽培面積已達到71.46萬hm²，葡萄產(chǎn)量1155萬噸，自2010年后一直位居世界葡萄產(chǎn)量的首位。

葡萄病害是影響葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)的最重要因素之一，據(jù)統(tǒng)計，危害我國葡萄生產(chǎn)的病害有40余種，根據(jù)其危害部位，葡萄病害可以分為葡萄葉部病害、果實病害、枝蔓病害和根系病害。由葡萄座腔病菌(Botryosphaeriaceae)引起的葡萄潰瘍病(Botryosphaeria dieback)是葡萄上存在的主要枝干病害之一，在世界上主要的葡萄栽培區(qū)域均有分布。葡萄座腔病菌是一類世界性分布的真菌，寄主范圍十分廣泛，不僅能侵染葡萄屬寄主還能侵染櫟屬、蘋果屬、梨屬等寄主。通常認為，這種病害主要通過自然孔口或修剪傷口進行侵染，造成葡萄果梗干枯、果實干縮或掉粒、枝干潰瘍、樹勢減弱等癥狀，嚴重時會導(dǎo)致植株整株死亡。

目前近年來對葡萄潰瘍病的研究主要集中在病原真菌類群的分子遺傳多樣性上，對葡萄潰瘍病的發(fā)生機理還不明晰。傳統(tǒng)的研究手段已不能滿足目前葡萄潰瘍病相關(guān)研究的需求。功能基因組學(xué)和分子生物學(xué)的快速發(fā)展，將極大地促進葡萄潰瘍病菌與宿主葡萄的互作研究，而所有這些研究的基礎(chǔ)是獲得高質(zhì)量的真菌菌絲RNA。提取的總RNA的質(zhì)量對下游實驗如反轉(zhuǎn)錄、實時定量PCR、RNA-Seq以及cDNA文庫構(gòu)建等的成敗至關(guān)重要，如果總RNA中殘留蛋白會使后續(xù)試驗中的RNA極易降解；同時多糖類物質(zhì)可以和RNA共沉淀，降低RNA的得率。

利用現(xiàn)有技術(shù)對葡萄潰瘍病菌絲提取RNA,多糖等雜質(zhì)非常多，提取質(zhì)量不佳，不能直接用于下游實驗，要經(jīng)過大量的純化的過程，耗費資金和精力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種提取產(chǎn)物純度高、產(chǎn)量高的提取葡萄潰瘍病菌菌絲RNA的方法。

本發(fā)明所提供的一種提取葡萄潰瘍病菌菌絲RNA的方法，包括下述步驟：

1)研缽和研棒預(yù)先用液氮冷卻，取出液氮中保存的葡萄潰瘍病菌菌絲，液氮中磨成粉末；

2)將粉末轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，以每90-110mg粉末加1mLTrizol抽提液的比例加入Trizol抽提液，搖動使其混勻，室溫下放置10-15min；

3)加入抽提液體積的1/5的氯仿，劇烈震蕩，室溫放置3-5min，于4℃12000g，離心15-20min；

4)取上清液于一新的離心管中，加入上清液體積的1/2的異丙醇和上清液體積的1/2的沉淀緩沖液，顛倒混勻；室溫放置10-12min，于4℃13000g離心10-15min；所述沉淀緩沖液為含1.2-1.5mol/L NaCl和0.5-0.8mol/L檸檬酸二鈉鹽·15H₂O的溶液。

5)棄去上清液，加1mL體積百分濃度為70％-75％的乙醇溶液清洗RNA沉淀塊，于4℃12000g離心5-10min；

6)棄去上清液，重復(fù)步驟5)；

7)棄乙醇，開蓋室溫放置2-5min，或真空干燥，使乙醇完全揮發(fā)；獲得的沉淀即RNA產(chǎn)物。

更進一步的，所述方法中，還包括葡萄潰瘍病菌菌絲的制備，所述葡萄潰瘍病菌菌絲的制備方法包括：

1)菌株準備：以無菌接種環(huán)或牙簽挑取方式，將保存的純化菌株接種于固體PDA培養(yǎng)基平板上，25-28℃培養(yǎng)10-12小時備用；

2)菌絲懸液準備：將步驟1)得到的菌絲用PDA培養(yǎng)基洗脫后，轉(zhuǎn)移到液體PDA培養(yǎng)基中，25-28℃120rpm(轉(zhuǎn))搖培10-12小時；

3)菌絲收集：將步驟2)得到的菌絲用單層miracloth濾布(Merck)過濾，擠壓去除培養(yǎng)液后，將菌絲置于錫紙中液氮速凍。

優(yōu)選的，所述步驟4)中，所述沉淀緩沖液為含1.2mol/L NaCl和0.8mol/L檸檬酸二鈉鹽·15H₂O的溶液；上清液、異丙醇和沉淀緩沖液的體積比為2:1:1。

本發(fā)明在常規(guī)Trizol法提取真菌菌絲RNA的基礎(chǔ)上，改良了葡萄座腔病菌菌絲準備及收集方式，并改良了RNA乙醇沉淀的方式，提取的RNA具有純度高、產(chǎn)量高的優(yōu)點，可以直接用于下游的分子生物學(xué)實驗。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提供實施例1的方法(泳道2和3)及對比例(泳道1)提取的總RNA瓊脂糖凝膠電泳照片。

圖2為本發(fā)明提供實施例2的方法(圖中A)及對比例(圖中B)提取的總RNA瓊脂糖凝膠電泳照片。

圖3為本發(fā)明提供方法提取的總RNA經(jīng)RT-PCR擴增的電泳照片。

具體實施方式

實施例1、提取葡萄潰瘍病菌菌絲RNA的方法

耗材:金屬鑰匙、研缽和研棒用0.1N的NaOH浸泡1小時后，用蒸餾水洗凈，160℃高溫滅菌6小時；RNase-free滅菌吸頭及1.5mL離心管(Axygen)。

試劑：Trizol(Qiagen)；氯仿；異丙醇；75％乙醇(DEPC處理水配制)；沉淀緩沖液(含1.2mol/L NaCl和0.8mol/L檸檬酸二鈉鹽·15H₂O的溶液)；RNase-free水；

菌株：野生型葡萄潰瘍病菌菌株CSS-01s，由本實驗室保存(劉愛芬,張鑫,張瑋,等.葡萄潰瘍病菌轉(zhuǎn)化子致病力快速評價體系的建立[J].植物保護,2013,2:021)。

1)菌株準備：以無菌接種環(huán)或牙簽挑取方式，將保存的純化菌株接種于固體PDA培養(yǎng)基平板上，28℃過夜培養(yǎng)備用；

2)菌絲懸液準備：將步驟1)得到的菌絲用PDA培養(yǎng)基洗脫后，轉(zhuǎn)移到100mL液體PDA培養(yǎng)基中，28℃120rpm搖培過夜；

3)菌絲收集：將步驟2)得到的菌絲用單層miracloth濾布(Merck)過濾，擠壓去除培養(yǎng)液后，將菌絲置于錫紙中液氮速凍。

4)研缽和研棒預(yù)先用液氮冷卻，取出液氮中保存的菌絲，液氮中磨成粉末；

5)將粉末轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1.5mL離心管中，已約100mg組織比1mL Trizol的比例加入Trizol抽提液(含苯酚、8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇，購自Qiagen公司)，搖動使其混勻，室溫下放置5min；

6)加入200μL的氯仿，劇烈震蕩，室溫放置2min，于4℃12000rpm離心15min；

7)分別取400μL上清液于3個新的離心管中，1號管加入300μL異丙醇和100μL沉淀緩沖液；2號管加入100μL異丙醇和300μL沉淀緩沖液；3號管加入200μL異丙醇和200μL沉淀緩沖液顛倒混勻；沉淀緩沖液為含1.2mol/L NaCl和0.8mol/L檸檬酸二鈉鹽·15H₂O的溶液。

8)室溫放置10min，于4℃13000rpm離心10min；棄去上清液，加1mL75％乙醇清洗RNA沉淀塊，于4℃12000rpm離心5min；

9)棄去上清液，重復(fù)步驟8)；

10)棄乙醇，開蓋室溫放置10min，或真空干燥，使乙醇完全揮發(fā)；

11)加50-100μL RNase-free水，用手指輕輕震蕩，使沉淀徹底溶解，取2μL電泳檢測及用紫外分光光度計測定RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀，并定量。

實施例1和對比例的結(jié)果比較：

上述實施例1和對比例的紫外分光光度計檢測結(jié)果如表1所示。

表1紫外分光光度計檢測結(jié)果

從表1中可以看出，采用改良方法(步驟7的編號2和3)提取的葡萄座腔病菌的RNA濃度高，OD₂₆₀/OD₂₈₀在2.00-2.04之間，OD₂₆₀/OD₂₃₀在1.95-1.95之間；而編號1得到的RNA濃度較低，質(zhì)量較差。

圖1是RNA跑膠結(jié)果。注：圖1泳道1,2，3表示采用上述方法提取的葡萄座腔病菌RNA上樣量均為500ng；M代表DNA Marker5000。

以上結(jié)果表明，在步驟7中以上清液：異丙醇：沉淀緩沖液＝2:1:1的比例添加時，得到的RNA質(zhì)量最好。

實施例2、

耗材:金屬鑰匙、研缽和研棒用0.1N的NaOH浸泡1小時后，用蒸餾水洗凈，160℃高溫滅菌6小時；RNase-free滅菌吸頭及1.5mL離心管(Axygen)。

試劑：Trizol(Qiagen)；氯仿；異丙醇；75％乙醇(DEPC處理水配制)；沉淀緩沖液(含1.2mol/L NaCl和0.8mol/L檸檬酸二鈉鹽·15H₂O的溶液)；RNase-free水；

菌株：野生型葡萄潰瘍病菌菌株CSS-01s，由本實驗室保存(劉愛芬,張鑫,張瑋,等.葡萄潰瘍病菌轉(zhuǎn)化子致病力快速評價體系的建立[J].植物保護,2013,2:021)。

1)菌株準備：以無菌接種環(huán)或牙簽挑取方式，將保存的純化菌株接種于固體PDA培養(yǎng)基平板上，28℃過夜培養(yǎng)備用；

2)菌絲懸液準備：將步驟1)得到的菌絲用PDA培養(yǎng)基洗脫后，轉(zhuǎn)移到100mL液體PDA培養(yǎng)基中，28℃120rpm搖培過夜；

3)菌絲收集：將步驟2)得到的菌絲用單層miracloth濾布(Merck)過濾，擠壓去除培養(yǎng)液后，將菌絲置于錫紙中液氮速凍。

4)研缽和研棒預(yù)先用液氮冷卻，取出液氮中保存的菌絲，液氮中磨成粉末；

5)將粉末轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1.5mL離心管中，在離心管中加入100mg菌絲粉末和1mL Trizol抽提液，搖動使其混勻，室溫下放置5min；Trizol抽提液：含苯酚、8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇，購自Qiagen公司。

6)在離心管中加入200μL的氯仿，劇烈震蕩，室溫放置2min，于4℃12000g離心15min；

7)取500μL上清液于一新的離心管中，加入250μL異丙醇和250μL沉淀緩沖液，顛倒混勻；室溫放置10min，于4℃13000g離心10min；沉淀緩沖液：含1.2mol/L NaCl和0.8mol/L檸檬酸二鈉鹽·15H₂O的溶液。

8)棄去上清液，加1mL 75％乙醇清洗RNA沉淀塊，于4℃12000g離心5min；

9)棄去上清液，重復(fù)步驟8)；

10)棄乙醇，開蓋室溫放置10min，或真空干燥，使乙醇完全揮發(fā)；

11)加50-100μL RNase-free水，用手指輕輕震蕩，使沉淀徹底溶解，取2μL電泳檢測及用紫外分光光度計測定RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀，并定量。

對比例、

耗材:金屬鑰匙、研缽和研棒用0.1N的NaOH浸泡1小時后，用蒸餾水洗凈，160℃高溫滅菌6小時；RNase-free滅菌吸頭及1.5mL離心管(Axygen)。

試劑：Trizol(Qiagen)；氯仿；異丙醇；75％乙醇(DEPC處理水配制)；RNase-free水；

1)菌株準備：以無菌接種環(huán)或牙簽挑取方式，將保存的純化菌株接種于固體PDA培養(yǎng)基平板上，28℃過夜培養(yǎng)備用；

2)菌絲懸液準備：將步驟1)得到的菌絲用PDA培養(yǎng)基洗脫后，轉(zhuǎn)移到100mL液體PDA培養(yǎng)基中，28℃120rpm搖培過夜；

3)菌絲收集：將步驟2)得到的菌絲用于4℃12000g離心5min，棄上清，將菌絲置于錫紙中液氮速凍。

4)研缽和研棒預(yù)先用液氮冷卻，取出液氮中保存的菌絲，液氮中磨成粉末；

5)將粉末轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1.5mL離心管中，在離心管中加入100mg組織粉末和1mL Trizol抽提液(含苯酚、8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇，購自Qiagen公司)，搖動使其混勻，室溫下放置5min；

6)加入200μL的氯仿，劇烈震蕩，室溫放置2min，于4℃12000g離心15min；

7)取500μL上清液于一新的離心管中，加入500μL異丙醇，顛倒混勻；-20℃冰箱放置15min，于4℃12000g離心10min；

8)棄去上清液，加1mL 75％乙醇清洗RNA沉淀塊，于4℃12000rpm離心5min；

9)棄去上清液，重復(fù)步驟8)；

10)棄乙醇，開蓋室溫放置10min，或真空干燥，使乙醇完全揮發(fā)；

11)加50-100μL RNase-free水，用手指輕輕震蕩，使沉淀徹底溶解，取2μL電泳檢測及用紫外分光光度計測定RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀，并定量。

實施例2和對比例的結(jié)果比較：

上述實施例2和對比例的紫外分光光度計檢測結(jié)果如表2所示。

表2紫外分光光度計檢測結(jié)果

從表1中可以看出，采用改良方法(編號1和2)提取的葡萄座腔病菌的RNA濃度高，OD₂₆₀/OD₂₈₀在2.00-2.01之間，OD₂₆₀/OD₂₃₀在1.9-1.95之間；而對照方法(編號3和4)得到的RNA濃度較低，質(zhì)量較差。以上結(jié)果表明改良方法提取出的RNA純度高，無蛋白和多糖類等物質(zhì)的污染。

從圖2中可以看出，采用改良方法RNA的三條帶型清晰明亮，且28S/18S亮度在2.0左右，且從兩個樣本中提取的RNA質(zhì)量基本一致，表明此方法穩(wěn)定、重復(fù)性較高，總量≥10μg能夠滿足轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建要求。注：圖2中A中的泳道1,2表示采用改良方法提取的葡萄座腔病菌RNA，泳道圖2中B中3,4表示采用對照方法提取的葡萄座腔病菌RNA上樣量均為500ng；M代表DNA Marker5000。

將上述實施例2提取的葡萄座腔病菌RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板，用BrActinF(5′-TCTTCGCTCGAGAAGTCGTA-3′)和BrActinR(5′-ACAATGGAAGGTCCGCTCTC-3′)組成的引物對進行PCR擴增(靶序列約500bp)，經(jīng)28個擴增循環(huán)10μL點樣所得條帶亮度較為一致(圖3)，表明該方法提取的RNA可用于葡萄座腔病菌基因功能表達實驗。注：泳道1,2表示PCR模板是采用本發(fā)明方法實施例2提取的葡萄座腔病菌RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA；泳道3表示PCR模板是葡萄座腔病菌基因組DNA；M代表DNA Marker2000。

以上說明對本發(fā)明而言只是說明性的，而非限制性的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在不脫離所附權(quán)利要求所限定的精神和范圍的情況下，可做出許多修改、變化或等效，但都將落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

序列表

<110> 北京市農(nóng)林科學(xué)院

<120> 一種提取葡萄潰瘍病菌菌絲RNA的方法

<130> WHOI1160074

<160> 2

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

tcttcgctcg agaagtcgta 20

<210> 2

<211> 1455

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

acaatggaag gtccgctctc 20