本發(fā)明涉及一種枸杞多糖的制備方法，具體涉及一種超聲波耦合膜分離分級(jí)制備不同分子量枸杞多糖的方法。
技術(shù)背景
枸杞(Lycium bararumL ) 是我國(guó)傳統(tǒng)藥食同源中藥材，有滋陰補(bǔ)腎、養(yǎng)肝明目等功效。近年來(lái)，青海柴達(dá)木盆地人工栽培枸杞發(fā)展迅速，至2015年總種植面積達(dá)30萬(wàn)畝，超過(guò)了寧夏。柴達(dá)木盆地獨(dú)特的自然條件和潔凈的生態(tài)環(huán)境，方圓百公里范圍無(wú)任何污染，晝夜溫差較大，病蟲(chóng)害輕，施藥次數(shù)少，農(nóng)殘檢出率低，使柴達(dá)木枸杞具有顆粒大而飽滿，肉質(zhì)肥厚而核少，色澤鮮艷而味甘等特性，被譽(yù)為青藏高原“紅寶石”，業(yè)內(nèi)有“中國(guó)枸杞在寧夏，精品枸杞在青海”之說(shuō)。新鮮枸杞在生產(chǎn)過(guò)程中，將會(huì)出現(xiàn)大量的枸杞果渣，通常這部分果渣將會(huì)被當(dāng)作廢品棄去，造成了很大的浪費(fèi)，同時(shí)增加了企業(yè)的生產(chǎn)成本。經(jīng)檢測(cè)枸杞果渣中多糖含量達(dá)10.09%，枸杞多糖含量豐富，功效明確，逐步得到國(guó)內(nèi)外的認(rèn)可，應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)展，具備廣闊的市場(chǎng)前景。
枸杞多糖(Lycium Bararum polysaccharide，LBP) 是枸杞的主要功效成分，具良好的抗氧化活性，其主要藥理作用有抗衰老、降血糖、降血脂、增強(qiáng)免疫功能、抗疲勞及抗腫瘤等，因此LBP作為天然抗氧化劑具很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。LBP組成較為復(fù)雜，分子量可從幾千到幾十萬(wàn)。黃琳娟等從制備枸杞多糖LBP經(jīng)DEAE-cellulose，Sephadex柱層析得到均一組分LbGP3、LbGP4和LbGP5，分子量分別為 2.37×104、9.25×104、21.48×104；其中LbGP4枸杞子糖綴合物L(fēng)bGp4經(jīng)U-消除、柱層析分離后得到一條分子量高達(dá)180800的分支多糖化合物L(fēng)bGp4-OL。LbGp4-OL糖基組成為n(Rha)∶n(Ara)∶n(Gal)= 0.05∶1.33∶1。根據(jù)甲基化、部分酸水解及1HNMR、13CNMR分析，確定了其主要的結(jié)構(gòu)，并對(duì)LbGp4和LbGp4-OL的免疫活性進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)：純化后的糖綴合物L(fēng)bGp4及糖鏈LbGp4-OL不僅對(duì)正常小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)有明顯的促進(jìn)作用，而且對(duì)快速老化模型小鼠SAMP8和SAMR1免疫功能低下也有明顯的改善作用，表明枸杞多糖具有直接促脾細(xì)胞增殖的作用。從它們的化學(xué)性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)來(lái)看，枸杞子糖綴合物L(fēng)bGp4及其糖鏈LbGp4-OL的分子量都較大,并且糖鏈具有密集的分支,這在一般的植物多糖中是罕見(jiàn)的。因此,它具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用可能與這種結(jié)構(gòu)有關(guān)（黃琳娟等，藥學(xué)學(xué)報(bào)，1998.33（7）:512-516；高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2001.3（22）：407-411）。彭雪梅等采用柱色譜法得到枸杞糖綴合物L(fēng)bGp2，經(jīng)HPLC,CE,GC,SE及糖含量分析、元素分析和氨基酸分析等研究其理化性質(zhì)，并用半體內(nèi)法、形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法和比色法等研究Lbp2對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能、淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及對(duì)小鼠血清半數(shù)溶血等的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LbGp2是均一組份，其分子量為6.8×104，糖含量為90.7%，糖組成為Ara-Gal 3∶4(摩爾比)，并含有18種天然氨基酸。免疫活性試驗(yàn)表明Lbp2具有顯著的免疫增強(qiáng)作用；還具有很好的抗氧化作用。田庚元等從寧夏枸杞子提取得到的粗多糖，經(jīng)DEAE-Cellulose和Sepadexe-100柱層析，得到均一的枸杞子糖蛋白LbGP。分子量由SDS-PAGE測(cè)定為88kd，糖含量為70%，糖組成為:Gal:Gl＝2.5:1.0:1.0(摩爾比)，并含有其他18種天然氨基酸（田庚元等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1995，27（2）:201-206）。姚瑞祺等用5種不同截留分子量(MWCO)的超濾膜分離LBP，苯酚-硫酸法測(cè)定不同分子量多糖的含量，鐵離子還原力(FRAP)法測(cè)定抗氧化活性。結(jié)果得到了6種不同分子量的LBP樣品液。分子量在5000以下的LBP占多數(shù)，達(dá)到74.5%;分子量大于3萬(wàn)的較低，尚不到7%。ＭＷ3萬(wàn)-10萬(wàn)的LBP抗氧化活性最強(qiáng)，其他5種LBP也都有一定程度的抗氧化活性（姚瑞祺等，食品工業(yè)科技，2008,29:89-91）。
植物多糖的提取多種多樣，但是提取活性多糖的方法卻基本相似，都是利用多糖易溶于水、酸、堿而不溶于醇等有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，但符合綠色、環(huán)保、無(wú)毒、具備較高提取效率的活性多糖的工業(yè)化提取、純化的方法很少。
水溶性枸杞多糖的純化方法一般有乙醇沉淀法、柱層析法和Sevage去除蛋白質(zhì)法。乙醇沉淀法利用多數(shù)糖類(lèi)物質(zhì)不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑這一性質(zhì)通過(guò)添加有機(jī)溶劑把不溶于溶劑的多糖類(lèi)物質(zhì)沉淀出來(lái)，從而達(dá)到和可溶性小分子物質(zhì)（比如色素小分子、鹽類(lèi)小分子等）分離的目的得到多糖粗品；柱層析具有較高的分離效能，但凝膠柱價(jià)格昂貴，通常應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)室中制備少量的純品，不適合在工業(yè)上大規(guī)模使用；Sevage去除蛋白質(zhì)法存在有機(jī)試劑消耗大，操作復(fù)雜，多糖損失嚴(yán)重等缺點(diǎn)。超濾法提取純化多糖具有工藝流程簡(jiǎn)單、產(chǎn)品純度高等特點(diǎn)。膜分離技術(shù)由于具有無(wú)相變過(guò)程、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，逐步在工業(yè)化生產(chǎn)中使用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種超聲波耦合膜分離分級(jí)制備不同分子量枸杞多糖的方法，該方法具有節(jié)能、綠色、環(huán)保、無(wú)污染的特點(diǎn)。本發(fā)明的方法使枸杞渣多糖下游分級(jí)提取制備，能夠根據(jù)枸杞粗多糖的特點(diǎn)，充分利用無(wú)機(jī)尼龍網(wǎng)和有機(jī)超濾膜的特點(diǎn)，選擇性的截留純化濃縮枸杞多糖，滿足大規(guī)模制備高純度、不同應(yīng)用效果的枸杞多糖的工業(yè)化生產(chǎn)需求。
本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種超聲波耦合膜分離分級(jí)制備不同分子量枸杞多糖的方法，其特征在于包括步驟：
步驟1，將枸杞渣晾干，用粉碎機(jī)粉碎，獲得枸杞渣粉末；
步驟2，對(duì)步驟1枸杞渣粉末按質(zhì)量體積比為1:20-30加入溶劑，室溫浸泡3h，得料液；料液在超聲功率為200-300w，超聲波提取枸杞渣3次，每次20-30min，合并濾液，獲得枸杞多糖提取液；
步驟3，對(duì)步驟2的枸杞多糖提取液，經(jīng)60-75目8層尼龍網(wǎng)過(guò)濾，除去枸杞籽及不溶物；
步驟4，對(duì)步驟3除去枸杞籽及不溶物后的枸杞多糖提取液靜置24小時(shí)，收集上清液，棄渣；
步驟5，對(duì)步驟4收集的上清液在離心分離機(jī)上，以7000-9000轉(zhuǎn)、離心15-25min進(jìn)行固液分離，收集上清液，棄渣，獲得枸杞多糖清液；
步驟6，對(duì)步驟5所得的枸杞多糖清液再經(jīng)過(guò)不同分子量的膜分離分級(jí)純化，得到不同分子量的枸杞多糖溶液；所述的不同分子量的膜分離分級(jí)純化是指先用6.7萬(wàn)分子量的超濾膜超濾，獲得透過(guò)液和截留液，截留液再用10萬(wàn)分子量的超濾膜超濾，獲得透過(guò)液和截留液，即分別收集到分子量小于6.7萬(wàn)、6.7萬(wàn)-10萬(wàn)和大于10萬(wàn)的超濾液；
步驟7，對(duì)步驟6所得的超濾液經(jīng)濃縮后干燥，分別制得分子量小于6.7萬(wàn)的水溶性枸杞多糖粉、分子量為6.7-10萬(wàn)之間的水溶性枸杞多糖粉和分子量大于10萬(wàn)的水溶性枸杞多糖粉。
所述步驟1中的枸杞渣是枸杞生產(chǎn)企業(yè)制備枸杞系列產(chǎn)品過(guò)程中的殘?jiān)?/p>
所述步驟2中的溶劑為水。
所述步驟2中的超聲波提取所用的提取設(shè)備為超聲波清洗器。
所述步驟6中的膜分離采用中空纖維膜小試設(shè)備。
所述步驟7中的超濾液的濃縮時(shí)，濃縮采用的設(shè)備是真空濃縮設(shè)備。
所述步驟7中的干燥為噴霧干燥或真空冷凍干燥。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明采用膜分離技術(shù)進(jìn)行分離，根據(jù)枸杞多糖分子量的大小，選擇分子截流量不同的膜進(jìn)行分離，可以得到分子量大小不同的枸杞多糖，突出每種枸杞多糖的應(yīng)用效果，拓寬了枸杞多糖的應(yīng)用范圍。同時(shí)協(xié)同超聲波提取提高了枸杞多糖提取效果，而且省時(shí)、高效、節(jié)能、綠色和環(huán)保。
下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，但不作為本發(fā)明的限定。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
一種超聲波耦合膜分離分級(jí)制備不同分子量枸杞多糖的方法，其特征在于包括步驟：
步驟1，將枸杞渣晾干，用粉碎機(jī)粉碎，獲得枸杞渣粉末；
步驟2，對(duì)步驟1枸杞渣粉末按質(zhì)量體積比為1:20加入溶劑，室溫浸泡3h得料液；料液在超聲功率為200w，超聲波提取枸杞渣3次，每次20min，合并濾液，獲得枸杞多糖提取液；所述溶劑為水；
步驟3，對(duì)步驟2的枸杞多糖提取液，經(jīng)60目8層尼龍網(wǎng)過(guò)濾，除去枸杞籽及不溶物；
步驟4，對(duì)步驟3除去枸杞籽及不溶物后的枸杞多糖提取液靜置24小時(shí)，收集上清液，棄渣；
步驟5，對(duì)步驟4收集的上清液在離心分離機(jī)上，以7000轉(zhuǎn)、離心15min進(jìn)行固液分離，收集上清液，棄渣，獲得枸杞多糖清液；
步驟6，對(duì)步驟5所得的枸杞多糖清液再經(jīng)過(guò)不同分子量的膜分離分級(jí)純化，得到不同分子量的枸杞多糖溶液；所述的不同分子量的膜分離分級(jí)純化是指先用6.7萬(wàn)分子量的超濾膜超濾，獲得透過(guò)液（分子量小于6.7萬(wàn)的超濾液）和截留液（分子量大于6.7萬(wàn)的超濾液），截留液再用10萬(wàn)分子量的超濾膜超濾，獲得透過(guò)液（分子量在6.7-10萬(wàn)的超濾液）和截留液（分子量大于10萬(wàn)的超濾液），即分別收集到分子量小于6.7萬(wàn)、分子量6.7萬(wàn)-10萬(wàn)和分子量大于10萬(wàn)的超濾液；
步驟7，對(duì)步驟6所得的超濾液經(jīng)濃縮后干燥，分別制得分子量小于6.7萬(wàn)的水溶性枸杞多糖粉、分子量為6.7-10萬(wàn)之間的水溶性枸杞多糖粉和分子量大于10萬(wàn)的水溶性枸杞多糖粉。以葡萄糖為標(biāo)品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量；以牛血清蛋白為標(biāo)樣，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量；以半乳糖醛酸為標(biāo)樣，采用咔唑-硫酸法測(cè)定樣品中的半乳糠醛酸含量，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1不同分子量枸杞多糖的多糖、蛋白質(zhì)、半乳糠醛酸的含量
實(shí)施例2
一種超聲波耦合膜分離分級(jí)制備不同分子量枸杞多糖的方法，其特征在于包括步驟：
步驟1，將枸杞渣晾干，用粉碎機(jī)粉碎，獲得枸杞渣粉末；
步驟2，對(duì)步驟1枸杞渣粉末按質(zhì)量體積比為1:25加入溶劑，室溫浸泡4h，得料液；料液在超聲功率為250w，超聲波提取枸杞渣3次，每次25min，合并濾液，獲得枸杞多糖提取液；所述溶劑為水；
步驟3，對(duì)步驟2的枸杞多糖提取液，經(jīng)65目8層尼龍網(wǎng)過(guò)濾，除去枸杞籽及不溶物；
步驟4，對(duì)步驟3除去枸杞籽及不溶物后的枸杞多糖提取液靜置24小時(shí)，收集上清液，棄渣；
步驟5，對(duì)步驟4收集的上清液在離心分離機(jī)上，以8000轉(zhuǎn)、離心20min進(jìn)行固液分離，收集上清液，棄渣，獲得枸杞多糖清液；
步驟6，對(duì)步驟5所得的枸杞多糖清液再經(jīng)過(guò)不同分子量的膜分離分級(jí)純化，得到不同分子量的枸杞多糖溶液；所述的不同分子量的膜分離分級(jí)純化是指先用6.7萬(wàn)分子量的超濾膜超濾，獲得透過(guò)液（分子量小于6.7萬(wàn)的超濾液）和截留液（分子量大于6.7萬(wàn)的超濾液），截留液再用10萬(wàn)分子量的超濾膜超濾，獲得透過(guò)液（分子量在6.7萬(wàn)-10萬(wàn)的超濾液）和截留液（分子量大于10萬(wàn)的超濾液），即分別收集到分子量小于6.7萬(wàn)、分子量6.7萬(wàn)-10萬(wàn)和大于10萬(wàn)分子量的超濾液；
步驟7，對(duì)步驟6所得的超濾液經(jīng)濃縮后干燥，分別制得分子量小于6.7萬(wàn)的水溶性枸杞多糖粉、分子量為6.7萬(wàn)-10萬(wàn)之間的水溶性枸杞多糖粉和分子量大于10萬(wàn)的水溶性枸杞多糖粉。以葡萄糖為標(biāo)品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量；以牛血清蛋白為標(biāo)樣，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量；以半乳糖醛酸為標(biāo)樣，采用咔唑-硫酸法測(cè)定樣品中的半乳糠醛酸含量，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2不同分子量枸杞多糖的多糖、蛋白質(zhì)、半乳糠醛酸的含量
實(shí)施例3
一種超聲波耦合膜分離分級(jí)制備不同分子量枸杞多糖的方法，其特征在于包括步驟：
步驟1，將枸杞渣晾干，用粉碎機(jī)粉碎，獲得枸杞渣粉末；
步驟2，對(duì)步驟1枸杞渣粉末按質(zhì)量體積比為1:30加入溶劑，室溫浸泡5h，得料液；料液在超聲功率為300w，超聲波提取枸杞渣3次，每次30min，合并濾液，獲得枸杞多糖提取液；所述溶劑為水；
步驟3，對(duì)步驟2的枸杞多糖提取液，經(jīng)70目8層尼龍網(wǎng)過(guò)濾，除去枸杞籽及不溶物；
步驟4，對(duì)步驟3除去枸杞籽及不溶物后的枸杞多糖提取液靜置24小時(shí)，收集上清液，棄渣；
步驟5，對(duì)步驟4收集的上清液在離心分離機(jī)上，以9000轉(zhuǎn)、離心30min進(jìn)行固液分離，收集上清液，棄渣，獲得枸杞多糖清液；
步驟6，對(duì)步驟5所得的枸杞多糖清液再經(jīng)過(guò)不同分子量的膜分離分級(jí)純化，得到不同分子量的枸杞多糖溶液；所述的不同分子量的膜分離分級(jí)純化是指先用6.7萬(wàn)分子量的超濾膜超濾，獲得透過(guò)液（分子量小于6.7萬(wàn)的超濾液）和截留液（分子量大于6.7萬(wàn)的超濾液），截留液再用10萬(wàn)分子量的超濾膜超濾，獲得透過(guò)液（分子量在6.7萬(wàn)-10萬(wàn)的超濾液）和截留液（分子量大于10萬(wàn)的超濾液），即分別收集到分子量小于6.7萬(wàn)、分子量6.7萬(wàn)-10萬(wàn)和大于10萬(wàn)的超濾液；
步驟7，對(duì)步驟6所得的超濾液經(jīng)濃縮后干燥，分別制得分子量小于6.7萬(wàn)的水溶性枸杞多糖粉、分子量為6.7萬(wàn)-10萬(wàn)之間的水溶性枸杞多糖粉和分子量大于10萬(wàn)的水溶性枸杞多糖粉。以葡萄糖為標(biāo)品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量；以牛血清蛋白為標(biāo)樣，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量；以半乳糖醛酸為標(biāo)樣，采用咔唑-硫酸法測(cè)定樣品中的半乳糠醛酸含量，結(jié)果見(jiàn)表3。
表3.不同分子量枸杞多糖的多糖、蛋白質(zhì)、半乳糠醛酸的含量
實(shí)施例4
比較例：方法1是以實(shí)施例3制備不同分子量枸杞多糖；方法2與實(shí)施例3制備枸杞多糖的步驟基本相同，不同的是方法2醇沉代替了膜分離；方法3與實(shí)施例3制備枸杞多糖的步驟基本相同，不同的是方法3沒(méi)有醇沉或膜分離。
對(duì)比試驗(yàn)表4
對(duì)比試驗(yàn)表4顯示，從多糖含量來(lái)看，醇沉>膜分離>不醇沉，通過(guò)化學(xué)試劑制備的多糖和膜分離制備的多糖相差不太大；從蛋白質(zhì)含量來(lái)看，不醇沉>醇沉和膜分離，膜分離制備的多糖和化學(xué)試劑制備的多糖蛋白質(zhì)含量接近；從半乳糖醛酸含量來(lái)看，不醇沉>醇沉和膜分離，膜分離制備的多糖和化學(xué)試劑制備的多糖半乳糖醛酸含量接近。表明沒(méi)有任何化學(xué)試劑的膜分離制備工藝可行。
從上述對(duì)比試驗(yàn)表4說(shuō)明，采用本發(fā)明的一種超聲波耦合膜分離分級(jí)制備不同分子量枸杞多糖的方法效果好。
本發(fā)明方法獲得的多糖，具有節(jié)能、省時(shí)、無(wú)污染、綠色、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，可用用于工業(yè)化生產(chǎn)，膜分離后分級(jí)純化的各種分子量的枸杞多糖適用于不同的食品行業(yè)，拓寬了應(yīng)用范圍，效果明顯。
本實(shí)施例沒(méi)有詳細(xì)敘述的工藝步驟或部件屬本行業(yè)的常用手段或公知結(jié)構(gòu)，這里不一一敘述。