一種基于dna條形碼的搖蚊科兩個屬水生昆蟲的鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種基于DNA條形碼鑒定水生昆蟲搖蚊科兩 個屬昆蟲的方法，可快速鑒別帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬昆蟲。
【背景技術(shù)】
[0002] 水生昆蟲是水生態(tài)系統(tǒng)中最重要的生物類群之一。作為魚類的重要基礎(chǔ)性巧料資 源，水生昆蟲在水體物質(zhì)循環(huán)和能量流動過程中發(fā)揮重要的作用與功能。此外，水生昆蟲在 水質(zhì)評價中發(fā)揮著重要的作用。近年來基于水生昆蟲各種生物指數(shù)和多樣性指數(shù)的水環(huán)境 評價在國內(nèi)外得到廣泛的應(yīng)用，其前提要求是對水生昆蟲的準(zhǔn)確分類和鑒定。傳統(tǒng)的分類 方法主要根據(jù)形態(tài)學(xué)來進(jìn)行物種鑒定，運(yùn)種方法通常較困難、緩慢、耗時較長。底棲動物的 分類關(guān)鍵通常只存在于生活史的某一階段，一些種類需要依據(jù)成蟲的特點來對幼蟲進(jìn)行分 類鑒定，容易導(dǎo)致物種鑒定的錯誤。
[0003] 搖蚊科(化ironomidae)隸屬于昆蟲雙翅目（Diptera)，生活于各種類型的水體中， 是種類最多、分布最廣、生物量最多的淡水底棲生物類群之一。幾乎所有的水體中都會存在 搖蚊幼蟲，但對于搖蚊幼蟲的種類鑒定是長期困擾動物學(xué)和生態(tài)學(xué)專家的重要科學(xué)問題之 一。搖蚊科帕搖蚊屬(Pagastia)和寡角搖蚊屬化iamesa)外部特征幾乎一樣，體型屬中等大 ?。?1毫米左右），觸角均為5節(jié)，第5節(jié)比第4節(jié)稍長，第3節(jié)有環(huán)紋，前后原足分離;兩者生態(tài) 分布相近，多分布于流動水體，形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果受到操作人的經(jīng)驗和專業(yè)技能的限制，易混 淆出錯，并且此方法難W針對帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬的不同生物型、幼蟲或殘缺個體進(jìn)行 鑒定，因此傳統(tǒng)的鑒定方法存有諸多不便，難W將其準(zhǔn)確區(qū)分。
[0004] 近年來，隨著DNA條形碼技術(shù)的出現(xiàn)，運(yùn)用DNA條形碼來進(jìn)行物種的分類成為現(xiàn)代 生物學(xué)的一個重要途徑。DNA條形碼是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的，標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異 的、易擴(kuò)增且相對較短的DNA片段，可W用來進(jìn)行物種分類，并鑒定隱存種，為研究大型底棲 動物生物多樣性提供新型技術(shù)和手段，DNA條形碼還能將生物的生活史和性別聯(lián)系起來，并 且通過建立數(shù)據(jù)庫為未來的研究提供參照信息。線粒體細(xì)胞色素 C氧化酶亞基I基因 (切tochrome C oxidase I，C0I)的前部約65化P長的序列，常被用作動物類群的主要條形 碼序列，基于該基因片段的昆蟲條形碼研究在國內(nèi)外廣泛開展。利用該基因序列可W快速、 準(zhǔn)確和自動化地對物種進(jìn)行鑒定和分類，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類方法的不足。然而，目前國內(nèi)外尚 無利用DNA條形碼作為分子標(biāo)記鑒定搖蚊科帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬的報道。
[0005] 因此，本發(fā)明首次通過帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬的DNA條形碼，即擴(kuò)增測定其線粒體 DNA的COI基因序列，根據(jù)帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬核巧酸的序列特征變異位點進(jìn)行物種鑒 另IJ，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定的諸多不足，該方法科學(xué)有效，快速準(zhǔn)確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供了一種基于DNA條形碼的水生昆蟲搖蚊科帕搖蚊屬和寡角 搖蚊屬的鑒定方法，解決了帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬形態(tài)鑒定困難的問題，該方法科學(xué)有效， 快捷準(zhǔn)確。
[0007] 為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0008] -種基于DNA條形碼的搖蚊科兩個屬昆蟲的鑒別方法，其步驟是：
[0009] (1)采用DNA提取試劑盒提取搖蚊科帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬昆蟲的總基因組DNA;
[0010] (2)利用線粒體COI基因的通用引物COI-F(5 ' -ggaatagtaggaacatcccttagaa-3 '） 和C0I-R(5 '-acttctgggtgtccaaagaat-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50化，其中 10 X PCR buffer 5化，Mg2+(2.5mmol/L)5化，dNTP(2.5mmol/L)3.5化，正反向引物各 1.扣L(l〇nm〇l/ L)，Taq酶0.抓，DNA模板化L(50ngAiL)，d地2〇補(bǔ)足至50化;反應(yīng)條件如下：循環(huán)前94°C預(yù)變 性5min，每個循環(huán)包括94°C變性40s，55°C退火45s，72°C延伸60s，共設(shè)30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束 后于72 °C延伸IOmin;
[0011] (3) 1 %濃度瓊脂糖凝膠電泳，回收COI擴(kuò)增片段，測序；
[0012] (4)按照下表所示帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬的核巧酸的序列特征變異位點進(jìn)行物種 鑒別：

[0013] 表1:搖蚊科帕搖蚊屬和篡角搖蚊屬的COI序列特征變異位點
[0014]
[0015]
[0016] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有W下優(yōu)點和效果：
[0017] 1.本發(fā)明方法能對搖蚊科帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬不同生物型W及幼蟲、殘缺個體 進(jìn)行鑒定，克服了形態(tài)鑒定的困難，縮短了鑒定的周期；
[0018] 2.本方法對使用的儀器設(shè)備要求較低，一般的分子生物學(xué)實驗室均可進(jìn)行，無需 復(fù)雜的技術(shù)步驟和昂貴的試劑，且對鑒定人員的專業(yè)知識要求不高，比傳統(tǒng)的依賴成蟲的 形態(tài)特征鑒別更準(zhǔn)確可靠，又可節(jié)省時間和費(fèi)用。
【具體實施方式】 [0019]實施例1:
[0020] 下面將結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明：
[0021] -種基于DNA條形碼的水生昆蟲搖蚊科帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬的鑒定方法，包括 如下步驟：
[0022] (1)樣品的采集、鑒定及保存:使用索伯網(wǎng)（面積〇.3mX0.3m，孔徑0.5mm)和l/16m 2 彼得遜采泥器在新疆伊準(zhǔn)河與額爾齊斯河進(jìn)行樣品采集，所采集的樣品通過60目網(wǎng)篩洗 凈，倒入白瓷盤中挑選實驗所需的帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬昆蟲，并用無水乙醇對樣品進(jìn)行 保存。保持更換無水乙醇(在溶液變黃之前），利用便攜式冰箱及時帶回實驗室進(jìn)行分析，在 顯微鏡下根據(jù)樣品的勞氏器來區(qū)分種類，寡角搖蚊屬的勞氏器小或無，帕搖蚊屬的勞氏器 與第=節(jié)等長。
[0023] (2)昆蟲基因組總DNA的提?。悍謩e取待測帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬蟲體的全部或 SOmg組織樣品，為避免污染，從頭部和腿部提取總基因組DNAdDNA的提取采用DNA抽提試劑 盒(天根生化科技有限公司）提取，提取的總基因組DM于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0024] (3)C0I基因片度的擴(kuò)增和測序
[002引利用DNA條形碼通用引物，W步驟(2)所述昆蟲的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增線粒 體COI基因片度，PCR擴(kuò)增引物如沈Q ID NO: 1和沈Q ID N0:2所示：
[00%]沈Q ID NO: 1:5'-ggaa1:agtaggaacatccct1:agaa-3'；
[0027]沈Q ID N0:2:5'-acttctgggtgtccaaagaat-3'；
[002 引 PCR 反應(yīng)體系為為 50 化，其中 IOXPCR buffer 化L，Mg2+(2.5mmol/L)5^，dNTP (2.511111101/1)3.5化，正反向引物各1.5化（10醒01/1)^日9酶0.抓，0麻模板化1(50叫/化）， d地20補(bǔ)足至50化；
[00巧]PCR反應(yīng)條件為：循環(huán)前94 °C預(yù)變性5min，每個循環(huán)包括94 °C變性40s，55 °C退火 45s，72°C延伸60s，共設(shè)30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72°C延伸lOmin。
[0030] PCR產(chǎn)物用1%濃度瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，用北京全式金生物技術(shù)有限公司的 試劑盒回收COI擴(kuò)增片段，回收產(chǎn)物送往上海英驗生物工程公司進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果如 沈Q ID NO :3-11所示。
[0031] (4)依據(jù)序列特征變異位點進(jìn)行物種鑒別:經(jīng)測序儀分析得到的序列用DNAStar中 的SeqMan程序結(jié)合人工作正反鏈拼接，去掉引物序列后，用Clus化1 W排序，序列變異位點 用MEGA 6.06進(jìn)行分析。
[0032] 表1顯示了搖蚊科帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬昆蟲的核巧酸序列的特征變異位點。位 點的序號W本片度核巧酸位置為基準(zhǔn)，變異位點的位置讀法為表頭數(shù)字從上而下讀，如帕 搖蚊屬和寡角搖蚊屬昆蟲COI基因的第一個變異位點為核巧酸的187號位置，第二個變異位 點為核巧酸序列的346號位置。
[0033] 表1搖蚊科帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬的核巧酸序列特征變異位點
[0034]

[0035] 在187和346號變異位點，申請人發(fā)現(xiàn)核巧酸序列為CC的為帕搖蚊屬昆蟲，TT的為 寡角搖蚊屬昆蟲。我們將根據(jù)運(yùn)些變異位點來進(jìn)行搖蚊科帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬昆蟲幼蟲 的分子生物學(xué)鑒定。
【主權(quán)項】
1. 一種基于DNA條形碼的水生昆蟲搖蚊科帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬的鑒定方法，其步驟 是： (1 )DNA提取試劑盒法提取待鑒別的搖蚊科昆蟲的總DNA; (2) 利用DNA條形碼的通用引物PCR擴(kuò)增線粒體COI基因前段序列； (3) 1%濃度瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒法割膠回收COI擴(kuò)增片段，測序； (4) 依據(jù)待鑒別的搖蚊科昆蟲的COI序列特征變異位點進(jìn)行物種快速鑒別，如下表所 不。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于DNA條形碼的水生昆蟲搖蚊科帕搖蚊屬和寡角搖蚊 屬的鑒定方法，其特征在于，步驟(1)中，所述提取搖蚊科昆蟲總DNA的個體為幼蟲。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于DNA條形碼的水生昆蟲搖蚊科帕搖蚊屬和寡角搖蚊 屬的鑒定方法，其特征在于，步驟(2)中，所述通用引物序列為： COI F:5 '-ggaatagtaggaacatcccttagaa-3 ' COI R:5'-acttctgggtgtccaaagaat_3'。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于DNA條形碼的水生昆蟲搖蚊科帕搖蚊屬和寡角搖蚊 屬的鑒定方法，其特征在于，步驟(2)中的PCR反應(yīng)體系為為50yL，其中10XPCR buffer 5μ L，Mg2+5yL，dNTP3.5yL，正反向引物各 1.5yL，Taq酶0.5U，DNA模板2yL，ddH20補(bǔ)足至50yL;反 應(yīng)條件如下:循環(huán)前94°C預(yù)變性5min，每個循環(huán)包括94°C變性40s，55°C退火45s，72°C延伸 60s，共設(shè)30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于72°C延伸lOmin;電泳后純化并測序。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于DNA條形碼的水生昆蟲搖蚊科帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬的鑒別方法。首先提取待鑒別的搖蚊科帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬昆蟲的基因組總DNA，以此為PCR模板，利用COI通用引物擴(kuò)增線粒體COI前部區(qū)段的約650 bp的序列，并進(jìn)行回收測序，最后按照核苷酸特征變異位點進(jìn)行種屬鑒別。本發(fā)明方法能對帕搖蚊屬和寡角搖蚊屬不同生物型以及幼蟲或殘缺個體進(jìn)行鑒定，具有快速、高效、準(zhǔn)確和便捷的特點，本方法對使用的儀器設(shè)備要求較低，一般的分子生物學(xué)實驗室均可進(jìn)行且對鑒定人員的專業(yè)知識要求不高，相比傳統(tǒng)方法依賴成蟲形態(tài)特征的鑒別更為準(zhǔn)確可靠，具有重要意義。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105713992
【申請?zhí)枴緾N201610306996
【發(fā)明人】周瓊, 鄭圓圓, 謝從新, 張秀杰, 王軍, 葛奕豪
【申請人】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)