利用線粒體分子標(biāo)記鑒定牧草盲蝽種群的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及一種利用線粒體分子標(biāo)記鑒定牧草 盲睹種群的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 牧草盲睹化ygus pratensis)屬于盲睹科(Miridae)草盲睹屬(XygUS)，為棉田重 要的害蟲種類之一，尤其是近十年來，隨著轉(zhuǎn)基因棉花的大量種植，伴隨著化學(xué)農(nóng)藥的減少 使用，該蟲已經(jīng)從次要害蟲上升為主要害蟲，特別是我國的西北棉區(qū)呈急劇上升趨勢。牧草 盲睹種群數(shù)量大范圍內(nèi)的明顯增加和空間范圍的擴(kuò)張給防治工作帶來很大挑戰(zhàn)。
[0003] 大量的研究表明牧草盲睹雖然在中國西北地區(qū)種群數(shù)量大且危害嚴(yán)重，但該昆蟲 的外部形態(tài)特征在不同地理種群間差異并不明顯，很難進(jìn)行區(qū)分，因此通過外部形態(tài)特征 實(shí)現(xiàn)不同地區(qū)種群的鑒定是非常困難的。線粒體基因在遺傳過程中嚴(yán)格遵守母系遺傳，進(jìn) 化速率快，在短時(shí)間內(nèi)即能完成譜系分化，因此利用線粒體分子標(biāo)記對牧草盲睹新疆地區(qū) 和甘肅、寧夏地區(qū)種群進(jìn)行鑒定是一種非?？煽康姆肿由飳W(xué)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種利用線粒體分子標(biāo)記快速鑒定牧草盲睹種群的方法，特 別是對新疆種群W及甘肅、寧夏種群進(jìn)行鑒別。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供用于鑒定牧草盲睹種群的PCR引物組合，所述引 物組合包括引物對①~④中的至少兩種:① PCR擴(kuò)增牧草盲睹線粒體細(xì)胞色素氧化酶II基 因的引物對，②擴(kuò)增細(xì)胞色素 b基因的引物對，③擴(kuò)增線粒體NADH脫氨酶亞基5基因的引物 對;④擴(kuò)增16S rDNA的引物對；引物序列如下：
[0006] @1^-C0II-F: 5' - TGGCAGAATAAGTGCCATGA- 3 '
[0007] kCOII-R:5'-GAGACCAATGCTTTCTTTCAGC-3'
[0008] ②L-ND5-F:5 '-AAACATAATTACCTGAACCCATGAA-3 '
[0009] L-ND5-R:5'-TCTTCAACTTTAGTAACTGCAGGAG-3 '
[0010] 憂-F: 5 ' -TCTAATTGATCTTCCTAGCCCAAG-3 '
[0011] kCy憂-R: 5 ' -CCGTGCTCCAATTCATGTTA-3 '
[0012] @kl6S-F: 5' - TCCACAAATATCCCCAATCTG-3 '
[0013] L-16S-R:5'-CCTTGAAATGTCCCTTCTCG-3 '
[0014] 優(yōu)選所述引物組合包括引物對①~④。
[001引本發(fā)明還提供含有所述引物組合的用于鑒定牧草盲睹種群的PCR檢現(xiàn)聯(lián)劑盒。
[0016] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、化q DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽性 模板等中的至少一種。
[0017] 本發(fā)明還提供利用線粒體分子標(biāo)記鑒定牧草盲睹種群的方法，包括W下步驟：
[001引1)提取待測牧草盲睹的基因組DNA;
[0019] 2) W步驟I)中提取的DM為模板，利用引物對①~④分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0020] 3)純化并分析PCR產(chǎn)物。
[0021] PCR反應(yīng)體系為：5 XPCR反應(yīng)緩沖液扣L,IOmM dNTPs 0.化L，抓AU hq DNA聚合 酶0. ，IOiiM上、下游引物各化L，模板DNA化L，無菌水補(bǔ)足至25化。
[0022] PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C 預(yù)變性 3min;94°C 變性 lmin，55°C 退火 lmin，72°C 延伸 Imin, 30個(gè)循環(huán);72°C延伸5min，4°C保存。
[0023] 前述的方法，步驟3)中分別對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和測序后，將測序結(jié)果按照COII-ND5-切tb-16S rDNA串聯(lián)拼接，串聯(lián)序列大小為3190bp，新疆種群第300、543、1204、1279、 1981、2509、2999、316化9處堿基依次為4、4、1/6、4、4、4、(：，甘肅寧夏種群依次為6、6、(：、4、6、 G、G、T O
[0024] 將上述位點(diǎn)作為分子標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)對我國牧草盲睹種群，特別是新疆種群W及 甘肅、寧夏種群的鑒定。
[0025] 本發(fā)明提供的分子鑒別方法簡單可靠，可操作性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，可重復(fù)性強(qiáng)。
【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中牧草盲睹新疆種群和甘肅、寧夏種群的線粒體細(xì)胞色素氧 化酶II(COII)、細(xì)胞色素 b(切tb)、線粒體NADH脫氨酶亞基5(ND5)和16S rDNA，四個(gè)基因片 段的串聯(lián)序列比對結(jié)果;其中，表示相同堿基。
[0027] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中利用引物心切計(jì)斗凡-切tb-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果；其中， 泳道1-15為牧草盲睹樣本，16-21為長毛草盲睹，22-24為陰性對照，M為2000bp DNA Markero
[00%]圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中引物心切計(jì)斗凡-切計(jì)-1?的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系靈敏度檢測 結(jié)果;其中，1-6分別代表DNA樣品經(jīng)1〇1、102、103、104、10 5、IO6倍稀釋結(jié)果，7-9為陰性對照，M 為2000bp DNA Marker。
[0029] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中利用引物kND5-F/L-ND5-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果；其中，泳 道1-15為牧草盲睹樣本，16-21為長毛草盲睹，22-24為陰性對照，M為2000bp DNA Marker。
[0030] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中引物kND5-F/l-ND5-R的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系靈敏度檢測結(jié) 果;其中，1-6分別代表DNA樣品經(jīng)1〇1、IO 2、IO3、104、IO5、IO6倍稀釋結(jié)果，7-9為陰性對照，M為 2000bp DNA Marker。
【具體實(shí)施方式】
[0031] W下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（Sambrook J & Russell DW, Molecular cloning:a Iaboratoiy manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0032] 實(shí)施例1用于鑒定牧草盲睹種群的PCR引物組合的設(shè)計(jì)與合成
[0033] 根據(jù)牧草盲睹線粒體細(xì)胞色素氧化酶II(COII)基因、細(xì)胞色素 b(切tb)基因、線粒 體NADH脫氨酶亞基5(ND5)基因 W及16S rDNA序列，利用Primer Prime巧軟件分別設(shè)計(jì)用于 PCR擴(kuò)增上述四個(gè)基因的特異性引物。引物序列如下(SEQ ID N0:l-8):
[0034] @1^-C0II-F: 5' - TGGCAGAATAAGTGCCATGA- 3 '
[0035] kCOII-R:5'-GAGACCAATGCTTTCTTTCAGC-3'
[0036] ②L-ND5-F:5，-AAACATAATTACCTGAACCCATGAA-3 '
[0037] L-ND5-R:5'-TCTTCAACTTTAGTAACTGCAGGAG-3 '
[0038] 憂-F: 5 ' -TCTAATTGATCTTCCTAGCCCAAG-3 '
[0039] kCy憂-R: 5 ' -CCGTGCTCCAATTCATGTTA-3 '
[0040] @kl6S-F: 5' -TCCACAAATATCCCCAATCTG-3 '
[0041 ] L-16S-R:5'-CCTTGAAATGTCCCTTCTCG-3 '
[0042] 上述引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0043] 實(shí)施例2利用線粒體分子標(biāo)記快速鑒定牧草盲睹新疆種群W及甘肅寧夏種群的方 法
[0044] 1、采集新疆、甘肅和寧夏的牧草盲睹個(gè)體，提取全基因組DNA
[0045] 中國的新疆、甘肅和寧夏地區(qū)分別選取代表種群，即在新疆地區(qū)的庫車、庫爾勒和 莎車，甘肅地區(qū)的武威，寧夏地區(qū)青銅峽采集牧草盲睹個(gè)體。牧草盲睹的野外采集使用網(wǎng)捕 法，利用吸蟲管收集成蟲，再將成蟲放入無水乙醇中，然后帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，采用體式解剖鏡 進(jìn)一步對成蟲形態(tài)特征進(jìn)行鑒定確認(rèn)，確保種類鑒定正確無誤。
[0046] 提取基因組DNA時(shí)，將成蟲腹部和翅去除，剩余組織結(jié)構(gòu)作為試驗(yàn)材料，采用天根 生化科技有限公司生產(chǎn)的TIANamp Genomic DNA試劑盒提取因組DNA。參照說明書操作。
[0047] 2、四種線粒體分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增
[0048] 利用實(shí)施例1合成的引物進(jìn)行四種線粒體分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)在美國 Bio-RAD公司生產(chǎn)的Myclycler,SlOO PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。
[0049] PCR反應(yīng)體系為：5 XPCR反應(yīng)緩沖液扣L,IOmM dNTPs 0.化L，抓AU hq DNA聚合 酶0. ，IOiiM上、下游引物各化L，模板DNA化L，無菌水補(bǔ)足至25化。
[00 加 ]PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C 預(yù)變性 3min;94°C 變性 1111111，55。(：退火1111111，72。(：延伸1111111， 30個(gè)循環(huán);72°C延伸5min，4°C保存。
[0化1] 3、PCR產(chǎn)物純化
[0052] PCR產(chǎn)物采用1 %瓊脂糖凝膠檢測，EB染色，在凝膠成像儀器中將PCR產(chǎn)物切膠回 收，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購自上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行純化，參照說明書操作。 [0化3] 4、純化PCR產(chǎn)物測序和序列比對
[0054] 將純化的PCR產(chǎn)物送金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序，采用雙向測序方法，測序 反應(yīng)在3730化DNA Genetic Analyser(ABI)測序儀上進(jìn)行。獲得測序結(jié)果后，利用BioEdit version 7.0.5序列分析軟件進(jìn)行雙向測序結(jié)果的拼接及序列的校對。利用Clustal X2軟 件進(jìn)行序列比對，從而得到不同地區(qū)牧草盲睹種群線粒體序列間保守堿基位點(diǎn)和變異堿基 位點(diǎn)，通過堿基變異位點(diǎn)對新疆種群W及甘肅、寧夏種群進(jìn)行鑒別。
[0055] 本實(shí)施例中區(qū)別我國新疆地區(qū)的庫車、庫爾勒、莎車種群和甘肅地區(qū)的武威、寧夏 地區(qū)的青銅峽牧草盲睹種群四個(gè)線粒體分子標(biāo)記的串聯(lián)序列（C0II-ND5-切tb-16S rDNA) 比對結(jié)果如圖1所示。
[0056] 新疆地區(qū)庫車、庫爾勒、莎車種群和甘肅地區(qū)武威、寧夏地區(qū)青銅峽牧草盲睹種群 線粒體基因串聯(lián)序列（31Wbp)的比對結(jié)果顯示，五個(gè)地區(qū)=大種群存在8個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換，其 中第300、543、1981、2509、2999堿基位點(diǎn)為4一6轉(zhuǎn)換;第1279堿基位點(diǎn)為6-4轉(zhuǎn)換;第1204 位點(diǎn)為T-C轉(zhuǎn)換;第3161位點(diǎn)為C-T轉(zhuǎn)換。將上述位點(diǎn)作為分子標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)對我國牧草 盲睹種群，特別是新疆種群W及甘肅、寧夏種群的鑒定。
[0057]本方法穩(wěn)定性好，可重復(fù)性強(qiáng)，操作簡單易行，因此利用本發(fā)明的四種線粒體分子 標(biāo)記能夠快速的區(qū)分牧草盲睹新疆、甘肅、寧夏地區(qū)種群。
[005引實(shí)施例3利用PCR引物kCy憂-FA-Cy憂-R檢測牧草盲睹的特異性和靈敏度分析 [0化9] 1、樣本來源：
[0060]本實(shí)施例中使用兩種草盲睹，其中牧草盲睹來自于新疆的庫爾勒、甘肅武威、寧夏 青銅峽地區(qū)；同屬于草盲睹屬的長毛草盲睹化ygus rugulipennis)來自于新疆的庫爾勒、 庫車、莎車地區(qū)，運(yùn)些樣本保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所植物保護(hù)研究室。
[0061 ] 2、DNA 提?。?br>[0062]同實(shí)施例2所述。
[006；3] 3、PCR 擴(kuò)增：
[0064] PCR反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序同實(shí)施例2所述。
[00化]4、結(jié)果分析：
[0066] 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物化L，在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電壓為150V，25~30分鐘后在 紫外光下檢測結(jié)果，如果出現(xiàn)大小約910bp的特征條帶，則證明所檢測樣本為牧草盲睹。電 泳檢測結(jié)果如圖2所示，泳道1-15為牧草盲睹樣本，均能擴(kuò)增出約91化P的特征條帶，而同屬 長毛草盲睹未出現(xiàn)條帶。上述結(jié)果表明引物kCy憂-FA-Cy憂-R的特異性強(qiáng)。
[0067] 將DNA樣品分別進(jìn)行10l、102、103、104、105、10 6倍濃度梯度，并W稀釋的DNA樣品為 模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增程序和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法同上。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)稀釋至 IO3倍時(shí)，條帶不明顯。因此，該引物對的靈敏度可達(dá)7.99ng/iiL，檢測靈敏度高。
[006引實(shí)施例4利用PCR引物kND5-F/l-ND5-R檢測牧草盲睹的特異性和靈敏度分析
[0069] PCR反應(yīng)使用的引物為レND5-F和レND5-R，PCR擴(kuò)增反應(yīng)和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法同實(shí) 施例3所述，引物的特異性和靈敏度分析方法同實(shí)施例3。
[0070] PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物扣L在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，如果出現(xiàn) 大小約570bp的特征條帶，則證明所檢測樣本為牧草盲睹，而同屬長毛草盲睹未出現(xiàn)條帶。 電泳檢測結(jié)果如圖4所示，泳道1-15為牧草盲睹樣本，均能擴(kuò)增出約57化P的特征條帶，而同 屬長毛草盲睹未出現(xiàn)條帶。該結(jié)果表明引物レND5-F和レND5-R的特異性強(qiáng)。
[0071] 將DNA樣品分別進(jìn)行10l、102、103、104、105、10 6倍濃度梯度，并W稀釋的DNA樣品為 模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增程序和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法同上。結(jié)果如圖5所示，當(dāng)稀釋至 IO6倍時(shí)，條帶不明顯。因此，該引物對的靈敏度可達(dá)7.99Xl(T3ngAiL，檢測靈敏度最高。
[0072] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可W對之作一些修改或改進(jìn)，運(yùn)對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的運(yùn)些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于鑒定牧草盲蝽種群的PCR引物組合，其特征在于，所述引物組合包括引物對①~ ④中的至少兩種:① PCR擴(kuò)增牧草盲蝽線粒體細(xì)胞色素氧化酶II基因的引物對，②擴(kuò)增細(xì)胞 色素 b基因的引物對，③擴(kuò)增線粒體NADH脫氫酶亞基5基因的引物對;④擴(kuò)增16S rDNA的引 物對；引物序列如下： ?L-COII-F:5，-TGGCAGAATAAGTGCCATGA-3 ' L-COII-R：5'-GAGACCAATGCTTTCTTTCAGC-3' ② L-ND5-F:5，-AAACATAATTACCTGAACCCATGAA-3 ' L-ND5-R:5，-TCTTCAACTTTAGTAACTGCAGGAG-3 ' ③ L-Cytb-F:5 '-TCTAATTGATCTTCCTAGCCCAAG-3 ' L-Cytb-R:5 '-CCGTGCTCCAATTCATGTTA-3 ' ?L-16S-F:5 '-TCCACAAATATCCCCAATCTG-3 ' L-16S-R:5 '-CCTTGAAATGTCCCTTCTCG-3 '。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR引物組合，其特征在于，所述引物組合包括引物對①~④。3. 含有權(quán)利要求1或2所述引物組合的用于鑒定牧草盲蝽種群的PCR檢測試劑盒。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合 酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板中的至少一種。5. 利用線粒體分子標(biāo)記鑒定牧草盲蝽種群的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取待測牧草盲蝽的基因組DNA; 2) 以步驟1)中提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1或2所述引物對①~④分別進(jìn)行PCR擴(kuò) 增反應(yīng)； 3) 純化并分析PCR產(chǎn)物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系為：5 X PCR反應(yīng)緩沖液5yL， 10mM dNTPs 0.5yL，5UAU Taq DNA聚合酶0·5μL，10μΜ上、下游引物各lyL，模板DNA 2yL，無 菌水補(bǔ)足至25yL。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 °C預(yù)變性3min; 94 °C 變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán);72°C延伸5min，4°C保存。8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟3)中分別對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純 化和測序后，將測序結(jié)果按照C0II-ND5-Cytb-16S rDNA串聯(lián)拼接，串聯(lián)序列大小為3190bp， 新疆種群第 300、543、1204、1279、1981、2509、2999、316比口處堿基依次為4、4、1'、6、4、4、八、(：， 甘肅寧夏種群依次為G、G、C、A、G、G、G、T。
【專利摘要】本發(fā)明提供利用線粒體分子標(biāo)記快速鑒定牧草盲蝽(Lygus pratensis)種群的方法，特別是對新疆種群以及甘肅、寧夏種群進(jìn)行鑒別。本發(fā)明根據(jù)牧草盲蝽線粒體細(xì)胞色素氧化酶II(COII)、細(xì)胞色素b(Cytb)、線粒體NADH脫氫酶亞基5(ND5)、16S rDNA四個(gè)基因片段分別設(shè)計(jì)特異性引物，然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行串聯(lián)比對，從而實(shí)現(xiàn)對我國牧草盲蝽種群的鑒定。該方法簡單可靠，可操作性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，可重復(fù)性強(qiáng)。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105713979
【申請?zhí)枴緾N201610212419
【發(fā)明人】張利娟, 崔金杰, 雒珺瑜, 張帥, 王春義, 呂麗敏, 朱香鎮(zhèn), 王麗, 李春花
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所