具體而言，本發(fā)明涉及用于PCR擴(kuò)增人PDE9A基因的引物組、包含該引物組的用于測(cè)定孕婦血漿中胎兒游離DNA濃度的試劑盒及使用該引物組的PCR擴(kuò)增方法。
背景技術(shù)：
：自從孕婦血漿的游離DNA(cfDNA，cellfreeDNA)中存在胎兒游離DNA(cellfreefetalDNA)這個(gè)現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，研究者們就利用這個(gè)現(xiàn)象來(lái)進(jìn)行多種研究和應(yīng)用，例如無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測(cè)、胎兒性別確定、胎兒染色體異常檢測(cè)、單基因遺傳病篩查、妊娠相關(guān)疾病篩查等。目前有通過檢測(cè)SRY基因來(lái)確定孕婦血漿中胎兒游離DNA的濃度的方法，但是SRY基因是男胎特有基因，對(duì)于孕有女胎的孕婦來(lái)說(shuō)就無(wú)法檢測(cè)出胎兒游離DNA的濃度。后來(lái)，科學(xué)家們通過甲基化測(cè)序等手段發(fā)現(xiàn)孕婦和胎兒基因組在甲基化水平上差異很大，從而找到了一些胎兒特異性的甲基化基因，目前檢測(cè)胎兒游離DNA濃度的方法就集中在檢測(cè)甲基化差異方面。PDE9A基因位于21q22.3，在孕婦外周血中為甲基化狀態(tài)，而在胎兒組織中為非甲基化狀態(tài)。理論上，孕婦血漿中的胎兒游離DNA(cffDNA)可以通過胎兒特異的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記——非甲基化的PDE9A基因(U-PDE9A)來(lái)測(cè)定。U-PDE9A也可以作為無(wú)創(chuàng)檢測(cè)21三體的一個(gè)標(biāo)志物。利用甲基化敏感酶消化后，來(lái)自胎兒的PDE9A基因被消化降解掉，游離DNA中只剩下來(lái)自母親的PDE9A基因。通過這種方法我們可以有效的檢測(cè)孕婦血漿中游 離DNA含量，準(zhǔn)確的檢測(cè)孕婦血漿中胎兒游離DNA的濃度，有助于為目前的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查方法提供指導(dǎo)和理論依據(jù)。然而，作為一種有臨床應(yīng)用價(jià)值的cffDNA檢測(cè)方法，需要保證測(cè)定值與真實(shí)值之間有良好的相關(guān)性(R2值接近1)。因此，上述理論上可行的方法離實(shí)際應(yīng)用還相去甚遠(yuǎn)。備注：cffDNA，表示的是cellfreefetalDNA，游離胎兒DNA；而cfDNA是cellfreeDNA，游離DNA。參考文獻(xiàn)[1]PresenceoffetalDNAinmaternalplasmaandserum.Lancet1997.350:485-487.[2]Cell-freefetalDNAplasmaextractionandreal-timepolymerasechainreactionquantification.MethodsMolMed2007.132:51-63.[3]QuantificationofCell-freeDNAinnormalandcomplicatedpregnancies:overcomingbiologicalandtechnicalissues,PLoSOne2014.9(7):1-7.[4]Cell-freeFetalDNAandCell-FreeTotalDNAlevelsinspontaneousabortionwithfetalchromosomalaneuploidy,PLoSOne2013.8:2.[5]Non-invasiveepigeneticdetectionoffetaltrisomy21infirsttrimestermaternalplasma.PLoSOne2011.6(11):e27709.[6]Non-invasiveprenatalaneuploidytestingatchromosomes13,18,21,X,andY,usingtargetedsequencingofpolymorphicloci.PrenatDiagn2012.32(13):1233-1241.技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠使得胎兒游離DNA的測(cè)定值與真實(shí)值之間有良好的相關(guān)性的、用于測(cè)定孕婦血漿中胎兒游離DNA濃度的試劑盒。本發(fā)明人為解決上述技術(shù)問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過使用特定用于測(cè)定孕婦血漿中胎兒游離DNA濃度的試劑盒，可以使采用Q-PCR方 法獲得的胎兒游離DNA的測(cè)定值與真實(shí)值之間具有良好的相關(guān)性，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明包括：1.一種引物組，其由上游引物及下游引物組成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。2.根據(jù)項(xiàng)1所述的引物組，其用于擴(kuò)增人PDE9A基因。3.根據(jù)項(xiàng)2所述的引物組，其中，所述人PDE9A基因來(lái)源于孕婦血漿游離DNA。4.一種用于擴(kuò)增人PDE9A基因的試劑盒，其包含項(xiàng)1-3任一項(xiàng)所述的引物組。5.根據(jù)項(xiàng)4所述的試劑盒，其還包含核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的絕對(duì)定量用標(biāo)準(zhǔn)品。6.一種擴(kuò)增人PDE9A基因的方法，其使用項(xiàng)1-3任一項(xiàng)所述的引物組作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。7.根據(jù)項(xiàng)6所述的方法，其使用從孕婦血漿中提取的游離DNA作為模板。8.根據(jù)項(xiàng)6所述的方法，其使用經(jīng)甲基化酶消化的從孕婦血漿中提取的游離DNA作為模板。9.根據(jù)項(xiàng)6所述的方法，其中，所述PCR擴(kuò)增的變性溫度為93℃-98℃，優(yōu)選94℃-96℃。10.根據(jù)項(xiàng)6所述的方法，其中，所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為52℃-62℃，優(yōu)選55℃-60℃。11.根據(jù)項(xiàng)6所述的方法，其中，所述PCR擴(kuò)增的延伸溫度為72℃。12.一種用于測(cè)定孕婦血漿中胎兒游離DNA濃度的試劑盒，其包含權(quán)利要求1所述的引物組。13.根據(jù)項(xiàng)12所述的試劑盒，其還包含核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的絕對(duì)定量用標(biāo)準(zhǔn)品。14.一種用于測(cè)定孕婦血漿中胎兒游離DNA濃度的試劑盒，其包括：用于對(duì)從孕婦血漿中提取的游離DNA進(jìn)行消化的甲基化酶。15.根據(jù)項(xiàng)14所述的試劑盒，其還包括：用于測(cè)定從孕婦血漿中提取的游離DNA的濃度的試劑；以及用于測(cè)定經(jīng)所述甲基化酶消化后的從孕婦血漿中提取的游離DNA的濃度的試劑。16.根據(jù)項(xiàng)14所述的試劑盒，其還包括下述引物組：所述引物組由上游引物及下游引物組成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其還包含核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的絕對(duì)定量用標(biāo)準(zhǔn)品。18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中，所述甲基化酶是選自BstUI、HhaI和HpaII中的一種或多種。發(fā)明效果通過使用本發(fā)明的用于測(cè)定孕婦血漿中胎兒游離DNA濃度的試劑盒，能夠使采用Q-PCR方法獲得的胎兒游離DNA的測(cè)定值與真實(shí)值之間具有良好的相關(guān)性。附圖說(shuō)明圖1顯示了使用本發(fā)明的引物組擴(kuò)增人PDE9A基因的情況下，采用Q-PCR方法獲得的胎兒游離DNA的測(cè)定值與真實(shí)值之間具有良好的相關(guān)性。圖2顯示了使用對(duì)比例的引物組擴(kuò)增人PDE9A基因的情況下，采用Q-PCR方法獲得的胎兒游離DNA的測(cè)定值與真實(shí)值之間的相關(guān)性不良。發(fā)明的具體實(shí)施方式在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種引物組(本發(fā)明的引物組)，其由上游引物及下游引物組成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。SEQIDNO：15’-TCGGTGAGTGCGCGCTGC-3’(也稱作PDE9A-FS)SEQIDNO：25’-CAGCCATCCCGAAAAGGCGA-3’(也稱作PDE9A-RS)所述引物組可以在針對(duì)人PDE9A基因的PCR擴(kuò)增中作為引物使用。本說(shuō)明書中，人PDE9A基因包括完整的人PDE9A基因，也包括其片段。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種用于擴(kuò)增人PDE9A基因的試劑盒(本發(fā)明的擴(kuò)增試劑盒)，其包含本發(fā)明的引物組。對(duì)于本發(fā)明的試劑盒而言，本發(fā)明的引物組是必須的，其中，上游引物和下游引物可以分別裝在不同容器內(nèi)，也可以裝在同一容器內(nèi)。除了包含本發(fā)明的引物組以外，本發(fā)明的試劑盒還可以包含例如用于PCR擴(kuò)增的其他試劑，包括但不限于選自dNTPS、MgSO4、Taq酶、DMSO、Tween20、甜菜堿、熒光染料、PCR反應(yīng)緩沖液、絕對(duì)定量用標(biāo)準(zhǔn)品、雙蒸水(ddH2O)等中的至少一種，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要適當(dāng)選擇。此外，本發(fā)明還提供一種用于測(cè)定孕婦血漿中胎兒游離DNA濃度的試劑盒(本發(fā)明的測(cè)定試劑盒)，其包含本發(fā)明的引物組或本發(fā)明的擴(kuò)增試劑盒。這里，作為絕對(duì)定量用標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)選使用核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的絕對(duì)定量用標(biāo)準(zhǔn)品。優(yōu)選地，本發(fā)明的測(cè)定試劑盒還可以包括：用于測(cè)定從孕婦血漿中提取的游離DNA的濃度的試劑；和/或用于測(cè)定經(jīng)所述甲基化酶消化后的從孕婦血漿中提取的游離DNA的濃度的試劑。這里，所述用于測(cè)定從孕婦血漿中提取的游離DNA的濃度的試劑包括但不限于：dNTPS、MgSO4、Taq酶、DMSO、Tween20、甜菜堿、熒光染料、PCR反應(yīng)緩沖液；所述用于測(cè)定經(jīng)所述甲基化酶消化后的從孕婦血漿中提取 的游離DNA的濃度的試劑包括但不限于：dNTPS、MgSO4、Taq酶、DMSO、Tween20、甜菜堿、熒光染料、PCR反應(yīng)緩沖液。本發(fā)明的引物組可適用于在熒光實(shí)時(shí)定量PCR中作為引物組對(duì)人PDE9A基因進(jìn)行擴(kuò)增。在使用本發(fā)明的引物組擴(kuò)增人PDE9A基因的情況下，采用Q-PCR方法獲得的胎兒游離DNA的測(cè)定值與真實(shí)值之間能夠具有良好的相關(guān)性。因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種擴(kuò)增人PDE9A基因的方法(本發(fā)明的擴(kuò)增方法)，其使用本發(fā)明的引物組作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(例如熒光實(shí)時(shí)定量PCR)。PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，其一般通過一定的PCR反應(yīng)程序(溫度循環(huán))來(lái)實(shí)現(xiàn)。所述PCR反應(yīng)程序一般包括變性、退火、延伸等步驟。對(duì)本發(fā)明的擴(kuò)增方法而言，變性步驟可以在93-98℃(優(yōu)選94-96℃)進(jìn)行0.1～10分鐘(優(yōu)選0.2～2分鐘)；退火步驟可以在52-62℃(優(yōu)選55-60℃)進(jìn)行0.1～10分鐘(優(yōu)選0.2～2分鐘)；延伸步驟可以在72℃進(jìn)行0.1～10分鐘(優(yōu)選0.5～5分鐘)；由上述變性、退火、延伸步驟組成的循環(huán)可以進(jìn)行10-50次(優(yōu)選25-45次)。優(yōu)選地，經(jīng)歷上述溫度循環(huán)前的模板可以在93-98℃(優(yōu)選94-96℃)進(jìn)行1～60分鐘(優(yōu)選5～20分鐘)的熱預(yù)變性。本發(fā)明的擴(kuò)增方法可以使用各種樣本作為模板來(lái)進(jìn)行，只要樣本中包含人PDE9A基因即可。優(yōu)選地，所述模板可以是從孕婦血漿中提取的游離DNA，或者經(jīng)甲基化酶消化的從孕婦血漿中提取的游離DNA。例如，在基于熒光實(shí)時(shí)定量PCR、通過擴(kuò)增人PDE9A基因測(cè)定孕婦血漿中的胎兒游離DNA量的情況下，可以將從孕婦血漿中提取的游離DNA平均分為兩份，一份直接進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR(測(cè)定的是孕婦血漿中總游離DNA的量)，一份先經(jīng)過甲基化酶消化再進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR(測(cè)定的是孕婦血漿中母親游離DNA的量)，兩者的差值即為孕婦血漿中的胎兒游離DNA的量。從孕婦血漿中提取游離DNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。此外，對(duì)游離DNA進(jìn)行甲基化酶消化的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以使用的甲基化酶包括例如BstUI、HhaI、HpaII等，但不限于此。實(shí)施例以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例是用于解釋本發(fā)明，并非對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1分別提取孕婦(孕齡20周)基因組DNA和羊水中胎兒基因組DNA(下稱羊水DNA)，精確定量后，利用超聲波打斷儀將基因組DNA打斷至200bp左右的片段，模擬血漿游離DNA的狀態(tài)。片段化后的羊水DNA模擬血漿中的胎兒游離DNA，片段化后的孕婦基因組DNA模擬血漿中的母親游離DNA，將兩者以已知比例混合，混合成不同胎兒游離DNA濃度的樣本，然后采用本發(fā)明的引物組作為人PDE9A基因的擴(kuò)增引物，基于Q-PCR方法進(jìn)行胎兒游離DNA濃度測(cè)定，樣本中胎兒游離DNA濃度的測(cè)定值及真實(shí)值如表1所示。表1樣本胎兒游離DNA濃度真實(shí)值胎兒游離DNA濃度測(cè)定值Sample12％1.5％Sample26％5.2％Sample39％8.9％Sample413％12.5％Sample515％15.4％Sample617.2％18％Sample719.5％20％上述測(cè)定值與真實(shí)值之間的相關(guān)性如圖1所示，可知R2高達(dá)0.997。本實(shí)施例中，首先將各待測(cè)樣本均分成兩份，一份直接進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR，一份先采用常規(guī)方法進(jìn)行甲基化酶消化再進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。熒光實(shí)時(shí)定量PCR的條件如下：反應(yīng)程序：95℃10min；(95℃15sec,60℃30sec,72℃for30sec)45cycles。該熒光實(shí)時(shí)定量PCR中使用的絕對(duì)定量用標(biāo)準(zhǔn)品的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。SEQIDNO：35’-TGCCTCGGTGAGTGCGCGCTGCGGGCTCTGCCCGGTGACGCCACGCGGCCTCCTCGCCTTTTCGGGATGGCTGGGAG-3’對(duì)比例1像實(shí)施例1那樣進(jìn)行了樣本中胎兒游離DNA濃度的測(cè)定，不同的是：替代本發(fā)明的引物組使用了下述引物組作為人PDE9A基因的擴(kuò)增引物。樣本中胎兒游離DNA濃度的測(cè)定值及真實(shí)值如表2所示。引物組序列如下：FS：ACCGGCCTGCCTCGGTGAGTGRS：GCCCCTCCCAGCCATCC表2樣本胎兒游離DNA濃度真實(shí)值胎兒游離DNA濃度測(cè)定值Sample12％0.8％Sample26％7.6％Sample39％13％Sample413％9.4％Sample515％11％Sample617.2％15.6％Sample719.5％18.4％上述測(cè)定值與真實(shí)值之間的相關(guān)性不好，如圖2所示，R2僅為0.799?？梢娛褂眠@對(duì)引物的檢測(cè)效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本發(fā)明提供的引物對(duì)的效果。還需要說(shuō)明的是，在可實(shí)施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，在本說(shuō)明書中作為某一技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的任一技術(shù)特征或技術(shù)特征的組合同樣也可以適用于其它技術(shù)方案；并且，在可實(shí)施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，作為不同技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的技術(shù)特征之間也可以以任意方式進(jìn)行組合，來(lái)構(gòu)成其它技術(shù)方案。本發(fā)明也包含在上述情況下通過組合而得到的技術(shù)方案，并且這些技術(shù)方案相當(dāng)于記載在本說(shuō)明書中。上述說(shuō)明示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用 于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域技術(shù)人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，提供了一種能夠使得胎兒游離DNA的測(cè)定值與真實(shí)值之間有良好的相關(guān)性的、用于擴(kuò)增PDE9A基因的引物組，以及包含該引物組的用于測(cè)定孕婦血漿中胎兒游離DNA濃度的試劑盒。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3