本發(fā)明屬于食品領(lǐng)域，涉及一種ACE抑制蛋白肽粉及其制備方法。
背景技術(shù)：
牛乳營養(yǎng)豐富，容易消化吸收，物美價廉，是最接近完善的天然食品。除食物纖維外，牛奶含有人體所需要的全部營養(yǎng)物質(zhì)，其價值之高，是其他食物無法相比的。牛乳中含有大量的蛋白質(zhì),其含量約為2.8％～3.2％,主要有酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳鐵蛋白和一些具有重要生理功能的酶類,這些乳蛋白都是全價蛋白質(zhì)，消化率高達98％。
濃縮乳蛋白粉(MPC，milk protein concentrate)是具有多種功能特性的乳蛋白產(chǎn)品，是將牛乳等通過超濾、過濾等處理截留乳蛋白后，進一步通過蒸發(fā)濃縮和干燥處理得到的乳蛋白產(chǎn)品，其含有的蛋白中酪蛋白與乳清蛋白的比例與原料乳中相似。濃縮乳蛋白粉的蛋白含量從42％～92％不等，蛋白含量越高，乳糖和鹽分的含量越少。其主要應(yīng)用之一是用于干酪加工中，提高干酪原料乳的酪蛋白含量，從而提高干酪加工的生產(chǎn)效率和產(chǎn)量。另外由于其特有的營養(yǎng)價值及功能，可以制成各種高附加值的營養(yǎng)保健品及其它工業(yè)原料，廣泛應(yīng)用于冷凍甜品、高蛋白運動飲料、能量棒和營養(yǎng)補充品的生產(chǎn)加工當(dāng)中。
生物活性肽(Biological Active peptide，BAP)是一類分子量較小，在結(jié)構(gòu)上較松散，具有多種生物功能的小肽，是一類對人體功能有積極作用的、最終影響人體健康的特定的蛋白質(zhì)片段。乳蛋白水解后也會產(chǎn)生的一些肽類物質(zhì)，能夠直接參與攝食、消化、代謝及內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)，其吸收機制優(yōu)于蛋白質(zhì)和氨基酸，且具有蛋白質(zhì)和氨基酸不可比擬的生理功能。目前，多數(shù)具有ACE抑制活性的蛋白肽均來源于乳蛋白。
酶解法是生物活性肽制備的最首要的方法，此法安全性高，生產(chǎn)條件溫和，易于控制，工藝簡單，容易進行工業(yè)化生產(chǎn)，成本低，原料來源廣。但是酶解法也有它的不利方面，主要是產(chǎn)品一些功能性質(zhì)及生物活性受到影響，需要調(diào)整水解參數(shù)或通過其它輔助手段改善產(chǎn)品的特殊性能。
超聲波是指頻率大于20kHz的聲波，超出人的聽覺上限，是一種有彈性的機械振蕩。超聲波在食品行業(yè)中有很多作用，如乳化、均質(zhì)、提取、結(jié)晶化、脫水作用、低溫巴氏殺菌、消沫、活化和鈍化酶、粒度黏度降低等。大量的研究表明，適宜的超聲處理條件可提高酶促反應(yīng)速度，對酶有激活作用；超聲波可以提高乳蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，包括溶解性及起泡性等。
膜分離技術(shù)作為一項新技術(shù)，由于具有節(jié)能、降耗、無污染及操作溫度低等的優(yōu) 點，在乳品工業(yè)中已取得了廣泛的應(yīng)用，如回收乳清、脫脂乳濃縮、微濾除菌等，其中，應(yīng)用膜技術(shù)對乳蛋白的分離已成為目前國內(nèi)外研究的熱點課題。膜分離技術(shù)是一種純粹的物理篩分過程，生產(chǎn)過程中不需添加任何化學(xué)物質(zhì)，而且操作溫度低，不會破壞乳蛋白的天然結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)出的乳蛋白產(chǎn)品具有更好的功能特性，在食品加工領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用前景。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種ACE抑制蛋白肽粉及其制備方法。
本發(fā)明提供的制備ACE抑制蛋白肽粉的方法，包括如下步驟：
1)將濃縮乳蛋白粉的水溶液進行超聲波處理后，再進行酶解，酶解完畢后滅酶、離心，收集上清液；
2)將步驟1)所得上清液進行第一次超濾，得到第一次截留液及第一次滲透液；
3)將所述第一次滲透液進行第二次超濾，得到第二次截留液及第二次滲透液；
4)將所述第二次滲透液進行納濾，得到第三次截留液及第三次滲透液；
5)將步驟2)所得第一次截留液、步驟3)所得第二次截留液和步驟3)所得第三次截留液和第三次滲透液中的至少一種進行噴霧干燥，得到所述ACE抑制蛋白肽粉。
上述方法的所述步驟1)中，濃縮乳蛋白粉中，蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分含量不低于60％，具體可為65％或75％，以保證酶解后ACE抑制肽活性及含量；
所述濃縮乳蛋白粉的水溶液中，濃縮乳蛋白粉的質(zhì)量百分含量為2％-5％，具體可為3％；
所述超聲波處理步驟中，超聲頻率為20kHz-30kHz，功率為800W-1000W，時間為4-6min。時間過長導(dǎo)致反應(yīng)溶液溫度上升，容易引起蛋白質(zhì)變性。
所述步驟1)酶解步驟中，所用酶為堿性蛋白酶；
所用酶的酶活為20U/g-150U/g，具體可為80U/g；該堿性蛋白酶的酶活定義為在測定條件(40±0.2℃；pH值10.5)下，每分鐘水解酪蛋白釋出的三氯乙酸可溶物在275nm波長有吸光度與1微克酪氨酸的吸光度相當(dāng)時，所需的酶量即為一個活力單位，用U/g表示；
酶的加入量為水溶液中乳濃縮蛋白質(zhì)量的2-5％，具體為3％；
所述酶解在攪拌的條件下進行；
所述攪拌步驟中，攪拌速率具體為1000-1500rmp；
酶解的時間為1.5-2.5h，具體為2h；反應(yīng)時間過短，蛋白質(zhì)酶解不徹底，ACE抑制活性肽含量過低，反應(yīng)時間過長，ACE抑制活性肽進一步酶解，失去活性。
酶解的溫度為45℃-55℃，具體為50℃；
酶解的pH值為8.0-9.0，具體為8.5。
所述滅酶按照包括如下步驟進行：在100℃左右進行滅酶，時間控制在10-15min。
所述第一次超濾步驟中，超濾膜的截留分子量為7-9KDa；
所述第二次超濾步驟中，超濾膜的截留分子量為3.5-5KDa；
所述納濾步驟中，納濾膜的截留分子量為150-300Da。
所述第一次超濾、第二次超濾和納濾步驟中，料液溫度均為30-32℃，進口壓力均為3-5bar，具體為3.5bar或4bar或3.5-4bar，濃縮系數(shù)均為3-6，具體可為3或4；
所述步驟5)噴霧干燥步驟中，進口溫度為130℃-140℃；進口溫度較低，這是為避免進口溫度過高導(dǎo)致乳蛋白肽可溶性降低；
出口溫度為55℃-65℃，具體可為60℃；
霧化壓力為1.5bar-2.5bar，具體可為1.5bar和2bar；霧化壓力過低，乳蛋白肽粉的粒度不均勻，霧化壓力過高，粉體粒度過細；
入料流量為3-5kg/h，具體可為3.5kg/h或4kg/h或3.5-4kg/h。
本發(fā)明使用超聲波協(xié)同酶解乳濃縮蛋白經(jīng)膜過濾的方法制備具有不同ACE抑制活性的肽粉，通過超聲波預(yù)處理，提高了乳濃縮蛋白肽酶解產(chǎn)物ACE抑制活性及溶解性，可作為功能性成份添加到食品中。故按照上述方法制備得到的ACE抑制的蛋白肽及含有ACE抑制的蛋白肽的食品、藥品或保健品及該ACE抑制的蛋白肽在制備食品、藥品或保健品中的應(yīng)用，也屬于本發(fā)明的保護范圍。
其中，所述ACE抑制蛋白肽粉的ACE抑制活性IC50不高于0.30mg/mL。該ACE抑制肽粉色澤呈白色，顆粒均一，溶解性好。
具體的，所得ACE抑制蛋白肽粉的各項指標(biāo)如表1，表2及表3所示。
表1、ACE抑制蛋白肽粉肽粉感官指標(biāo)
表2、ACE抑制蛋白肽粉理化指標(biāo)
表3、ACE抑制蛋白肽粉微生物指標(biāo)
本發(fā)明公開了一種ACE抑制蛋白肽粉及其制備方法。本發(fā)明采用超聲波協(xié)同酶解制備具有ACE抑制活性的乳濃縮蛋白肽粉，ACE抑制活性高，在食品，藥品及保健品工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實施例。所述方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所述原材料如無特別說明均能從公開商業(yè)途徑獲得。
下述實例中所用乳濃縮蛋白購自寧夏塞尚乳業(yè)有限公司；堿性蛋白酶購自南寧龐博生物工程有限公司；超聲波裝置購自北京鴻祥隆生物技術(shù)有限公司；磁力攪拌發(fā)酵罐購自上海保興生物工程技術(shù)有限公司；離心機購自英國Armfield公司。超濾及納濾膜購自美國GE Osmonics公司。噴霧干燥設(shè)備購自GEA工程技術(shù)中國有限公司。
實施例1：超聲波輔助酶解ACE抑制蛋白肽粉制備
1)乳濃縮蛋白溶液：將1.34kg濃縮乳蛋白粉(其中蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分含量為75％)溶于50L去離子水中，磁力攪拌1h，于40℃條件下孵育1h，得到濃縮乳蛋白粉的水溶液，該水溶液中，濃縮乳蛋白粉的質(zhì)量百分含量為2％。
超聲波預(yù)處理：20kHz，800W超聲波處理濃縮乳蛋白粉的水溶液4-6min。
酶解：將超聲波預(yù)處理后的濃縮乳蛋白粉的水溶液的pH值調(diào)至8.5，倒入磁力攪拌發(fā)酵罐中加熱至50℃并保溫，加入3％(酶與底物質(zhì)量比)堿性蛋白酶(酶活為80U/g)，1000rmp磁力攪拌2h進行酶解反應(yīng)，之后再100℃條件下加熱15min進行滅菌。碟片式離心機離心30min，取上清液。
2)超濾、納濾：將上述步驟1)所得上清液加熱至31℃，在進口壓力4bar，濃縮比4，8kDa截留分子量條件下進行超濾，得到第一次截留液及第一次滲透液。
3)將上述第一次滲透液加熱至31℃，在進口壓力4bar,濃縮比4，3.5kDa截留分子量條件下進行超濾，得到第二次截留液及第二次滲透液。
4)將上述第二次滲透液加熱至31℃，在進口壓力4bar，濃縮比3，200Da截留分子量條件下進行納濾，得到超濾第三次截留液及第三次滲透液。
5)噴霧干燥：將步驟4)所得第一次截留液，第二次截留液，第三次截留液及第三次滲透液在進口溫度130℃，出口溫度65℃，霧化壓力1.5bar，入料流量3.5kg/h條件下進行噴霧干燥，得到本發(fā)明提供的ACE抑制蛋白肽粉。
ACE抑制活性測定：20μl ACE溶液(20mU溶于80mM硼酸緩沖液，0.3M NaCl，pH 8.2)與200μl上清酶解液或空白對照200μl硼酸緩沖液混合，加入37℃孵育的0.8mM FAPGG。室溫條件下，記錄5min鐘內(nèi)，上述混合液在340nm條件下吸光值。ACE活性為5min鐘內(nèi)340nm條件下吸光值的下降速率(ΔA340min-1)，ACE抑制率為(1-酶解液ACE抑制活性/空白ACE抑制活性)×100％。最終將ACE抑制率轉(zhuǎn)換為IC50，即ACE抑制率為50％時所需酶解產(chǎn)物的濃度。
該實施例所得第一次截留液蛋白肽粉ACE抑制率IC50為0.25mg/ml，第二次截留液蛋白肽粉ACE抑制率IC50為0.15mg/ml，第三次截留液蛋白肽粉ACE抑制率IC50為0.08mg/ml，第三次滲透液蛋白肽粉ACE抑制率IC50為0.16mg/ml。
該實施例所得ACE抑制蛋白肽粉的感官、理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)檢測結(jié)果如表4至表6所示。
表4、ACE抑制蛋白肽粉感官指標(biāo)
表5、ACE抑制蛋白肽粉肽粉理化指標(biāo)
表6、ACE抑制蛋白肽粉微生物指標(biāo)
注：乳蛋白濃縮肽分子量分布測定：采用高效凝膠過濾色譜法測定。即以多孔性填料為固定相，依據(jù)樣品組分分子體積大小的差別進行分離，在肽鍵的紫外吸收波長220nm條件下檢測，使用凝膠色潛測定分子最分布的專用數(shù)據(jù)處理軟件(即GPC軟件)，對色譜圖及其數(shù)據(jù)進行處理，計算得到乳濃縮蛋白肽的相對分子量大小及分布范圍。
儀器：高效液相色譜儀，配有紫外檢測器和含有GPC數(shù)據(jù)處理軟件的色譜工作站或積分儀；流動相真空抽濾脫氣裝置；超聲波振蕩器；分析天平，感量0.0001g。
試劑：乙腈，色譜純；二氟醋酸，分析純；水，超純級或二次蒸餾水；分子量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品；細胞色素C(cyyochrome,MW12500)；抑肽酶(aprotinin,MW6500)；桿菌酶(bacitracin,MW1450)；乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451)；乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW 189)
色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實驗：色譜柱:TSKgeIG 2000S WXL 3 00m m X7.8mm或性能與此相近的同類型其他適用于測定蛋白質(zhì)和肽的凝膠柱。流動相：乙腈：水：三氟乙酸，10:90:0.1(體積比)。檢測波長：UV220nm。流速：0.5mL/min。柱溫：300C。進樣體積：10μL。
為使色譜系統(tǒng)符合檢測要求，規(guī)定在上述色譜條件下，凝膠色譜柱的柱效即理論塔板數(shù)(N)按三肽標(biāo)準(zhǔn)品(乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸)峰計算不低于10000，乳濃縮蛋白肽的分配系數(shù)(Kd)應(yīng)在0～l之間。
分子量校正曲線制作：分別用流動相配制成質(zhì)量分數(shù)為0.1的上述不同分子量肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用孔徑為0.21μm～0.5μm。GB/T 2653-2004。聚四氟乙烯或尼龍過濾膜過濾后分別進樣，得到系列標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。以分子量的對數(shù)(1gMV)對保留時間作圖或作線性回歸得到分子量校正曲線及其方程。
樣品制備：稱取樣品約20.0mg于10mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，超聲振蕩10min，使樣品充分溶解混勻，用孔徑為0.2μm～0.5μm聚四氟乙烯或尼龍過濾膜過濾后，上機進樣。
分子量分布的計算：將上述所述制備的樣品溶液在上述色譜條件下分析。然后用GPC數(shù)據(jù)處理軟件，將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線方程中進行計算，即可得到樣品的肽分子量及其分布范圍。用峰面積歸一法可計得不同分子量范圍肽的相對百分比。
實施例2：超聲波輔助酶解ACE抑制蛋白肽粉制備
1)乳濃縮蛋白溶液：將3.35kg濃縮乳蛋白粉(其中蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分含量為75％)溶于50L去離子水中，磁力攪拌1h，于40℃條件下孵育1h。得到濃縮乳蛋白粉的水溶液，該水溶液中，濃縮乳蛋白粉的質(zhì)量百分含量為5％。
超聲波預(yù)處理：20kHz，800W超聲波處理濃縮乳蛋白粉的水溶液4-6min。
酶解：將超聲波預(yù)處理后的濃縮乳蛋白粉的水溶液pH值調(diào)至8.5，倒入磁力攪拌發(fā)酵罐中加熱至50℃并保溫，加入3％(酶與底物比)堿性蛋白酶(酶活為80U/g)，1000rmp磁力攪拌2h,100℃條件下加熱15min進行滅菌。碟片式離心機離心30min，收集上清液。
2)超濾、納濾：將上述步驟1)所得上清液加熱至31℃，在進口壓力4bar，濃縮比4，8kDa截留分子量條件下進行超濾，得到第一次截留液及第一次滲透液。
3)將上述第一次滲透液加熱至31℃，在進口壓力4bar,濃縮比4，3.5kDa截留分子量條件下進行超濾，得到第二次截留液及第二次滲透液。
4)將上述第二次滲透液加熱至31℃，在進口壓力4bar，濃縮比3，200Da截留分子量條件下進行納濾，得到第三次截留液及第三次滲透液。
5)噴霧干燥：將步驟4)所得第一次截留液，第二次截留液，第三次截留液及第三次滲透液在進口溫度130℃，出口溫度65℃，霧化壓力1.5bar，入料流量3.5kg/h條件下進行噴霧干燥，得到本發(fā)明提供的ACE抑制活性肽。
ACE抑制活性測定：20μl ACE溶液(20mU溶于80mM硼酸緩沖液，0.3M NaCl，pH 8.2)與200μl上清酶解液或空白對照200μl硼酸緩沖液混合，加入37℃孵育的0.8mM FAPGG。室溫條件下，記錄5min鐘內(nèi)，上述混合液在340nm條件下吸光值。ACE活性為5min鐘內(nèi)340nm條件下吸光值的下降速率(ΔA340min-1)，ACE抑制率為(1-酶解液ACE抑制活性/空白ACE抑制活性)×100％。最終將ACE抑制率轉(zhuǎn)換為IC50，即ACE抑制率為50％時所需酶解產(chǎn)物的濃度。
該實施例所得第一次截留液蛋白肽粉ACE抑制率IC50為0.24mg/ml，第二次截留液蛋白肽粉ACE抑制率IC50為0.20mg/ml，第三次截留液蛋白肽粉ACE抑制率IC50為0.10mg/ml，第三次滲透液蛋白肽粉ACE抑制率IC50為0.17mg/ml。
該實施例所得ACE抑制蛋白肽粉的感官、理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)檢測結(jié)果如表7至表9所示。
表7、乳濃縮蛋白肽粉感官指標(biāo)
表8、乳濃縮蛋白肽粉理化指標(biāo)
表9、乳濃縮肽粉微生物指標(biāo)
注：乳蛋白濃縮肽分子量分布測定同實施例1。