本發(fā)明屬于核酸檢測領(lǐng)域，涉及一種用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和試劑盒的陽性對照，特別涉及一種用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和試劑盒的陽性對照組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)技術(shù)具有靈敏度高，特異性強，操作簡單快捷等優(yōu)點，已在多個領(lǐng)域得到廣泛地應(yīng)用。PCR的整個技術(shù)過程經(jīng)若干個循環(huán)組成，一個循環(huán)經(jīng)過變性、退火、延伸3個連續(xù)過程后，合成了新鏈，新鏈又可作為DNA模板參與下一輪的復(fù)制，由此循環(huán)進行。一般單一拷貝的基因進行25-30次循環(huán)擴增后，DNA分子可增加100萬-200萬倍。由于PCR靈敏度特別高，在擴增過程中容易受到多種因素的影響，例如有時在樣品中包含有抑制性物質(zhì)，可產(chǎn)生假陰性結(jié)果，或者是由于污染產(chǎn)生假陽性結(jié)果。因此，為了將檢測過程中的假陽性和假陰性結(jié)果最小化，通常均需要使用陽性和陰性對照。在每次PCR檢測過程中，只有在陽性對照和陰性對照都成立的前提下，才能對檢測樣品進行判定。引物與目標(biāo)序列的結(jié)合是PCR反應(yīng)中最關(guān)鍵的影響因素之一，因此，應(yīng)盡量使用與目標(biāo)序列具有相同引物結(jié)合位點的陽性對照，已驗證PCR檢測體系是否能夠進行有效的擴增。但與此同時，由于陽性對照的引入，又使得聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)存在潛在的污染風(fēng)險。由于現(xiàn)在的陽性對照與目標(biāo)序列擴增大小一致，一旦陽性對照污染后，通過普通凝膠電泳無法對污染陽性和檢測樣品陽性進行區(qū)分，從而造成假陽性結(jié)果的判斷。因此，亟需一種既能反應(yīng)PCR檢測體系是否正常擴增，能夠快速排除陽性對照污染的陽性對照。技術(shù)實現(xiàn)要素：：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種既能滿足聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)陽性對照設(shè)置要求，又能排除陽性對照污染的陽性組合物對照，特別是陽性對照組合物及其制備方法，該方法制得的陽性對照既滿足聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對陽性對照的要求，同時又能夠通過瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)和判別由陽性對照引入的污染。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方法實現(xiàn)的。本發(fā)明提供了一種普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的陽性對照組合物的制備方法，其特征在于選取一種與目標(biāo)序列具有相同引物結(jié)合位點，但擴增片段大小有差異的陽性對照模板，同時引入與目標(biāo)序列大小相同的非擴增片段作為指示分子。本發(fā)明的一個方面，普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的陽性對照組合物的制備方法，選取與目標(biāo)序列具有相同引物結(jié)合位點，但擴增片段大小有差異的基因序列作為陽性對照模板。該模板可以在靶序列的引物結(jié)合位點外任意位點進行缺失、插入等操作，并且突變后的序列不能干擾引物與靶序列相關(guān)位點的結(jié)合，也不能引起引物的非特異性擴增。該模板經(jīng)引物擴增后，片段大小與目標(biāo)序列大小不一致。本發(fā)明的另一個方面，與目標(biāo)序列大小相同的非擴增片段作為指示分子選取與引物擴增序列大小一致，且對反映體系不能產(chǎn)生干擾。指示分子可以與陽性模板混合使用，也可以在擴增結(jié)束后，加入陽性對照體系中進行電泳或單獨進行電泳。本發(fā)明在具體實施過程中該陽性對照模板的存在形式，可以裝載于各類基因工程載體，如質(zhì)粒載體、病毒載體、細(xì)菌人工染色體載體等，也可以是經(jīng)酶切、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增后的線性形式存在。非擴增片段指示分子的存在形式為線性DNA分子。本發(fā)明的具體實施方式中，適用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和試劑盒，也適用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和試劑盒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的陽性對照既能夠反應(yīng)檢測體系中引物與模板的結(jié)合及擴增情況，擴增大小與目標(biāo)序列大小不同，從而能夠快速識別陽性對照引起的污染，同時指示分子的引入也利于對檢測結(jié)果進行判斷，從而避免了現(xiàn)有技術(shù)中陽性模板對檢測結(jié)果污染后難以判別的缺點。附圖說明為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)描述，其中：圖1.本發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增結(jié)果在電泳檢測的圖譜，其中：M為DL2000markDNA，1.為PCV檢測陽性樣品，大小為386bp，2.236bp陽性擴增對照和386bp指示分子3.586bp陽性擴增對照和386bp指示分子。具體實施方式：下面結(jié)合附圖和具體實例對本發(fā)明做進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限定。1.試驗材料1.1主要試驗儀器伯樂C-1000PCR儀、伯樂C1000PCR儀、超低溫冰箱、紫外分光光度計、高速離心機、電泳儀、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)1.2試驗材料病毒DNA/RNA磁珠法提取試劑盒購自成都拓洋科技有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、TaqPlantinumPCRMasterMix購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、瓊脂糖購自寶生物工程(大連)有限公司，質(zhì)粒pGFP-n3由四川出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心保存；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。圓環(huán)病毒疫苗株由海利公司生產(chǎn)提供。引物送成都擎科生物科技有限公司合成，見下表。名稱序列長度bpPCV-FCAACGGTCACCAGACTCC18PCV-RAAGAAGCGGACCCCAACCAC20eGFP-FGAACCATCTTCTTCAAGGACGAC23eGFP-RCACGAACTCCAGCAGGACCAT21陽性模板送成都擎科生物科技有限公司進行基因合成。2實驗方法2.1陽性模板的制備2.1.1陽性模板1的制備在目標(biāo)序列內(nèi)部插入200bp非PCV基因序列，通過基因合成方式合成陽性模板，陽性擴增對照1大小為586bp，具體序列如下：CAACGGTCACCAGACTCCCGCTCTCCAACAAGGTACTCACAGCAGTAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTGAGATCGAGGAGCTCCACATTCAATAAGTAAGTTGCCTTCTTTACTGCAATATTCTTTATTCTGCTGATCAGTTCCTTTGGCTTTCTCGATGTGGCAGCGGGCACCCAAATACCACTTCACTTTATTAAAAGTTTGCTTCTTCACAAAATTAGCGAACCCCTGGAGGTGAGGTGTTCGTCCTTCCTCATTACCCTCCTCGCCAACAATAAAATAATCAAACAGGGAGATTGGGAGCTCCCGTATTTTCTTGCGCTCGTCTTCGGAAGGATTATTCAGCGTGAACACCCACCTTTTATGTGGTTGGGGTCCGCTTCTT合成的基因序列克隆到pMDT-18載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，經(jīng)培養(yǎng)后進行質(zhì)粒提取，使用微量紫外分光光度計測定出質(zhì)粒的濃度，并經(jīng)過計算，確定其拷貝數(shù)，置于-20℃低溫保存。2.1.2陽性模板2的制備在目標(biāo)序列內(nèi)部刪除150bp非PCV基因序列，通過基因合成方式合成陽性模板，陽性擴增對照2片段大小為236bp，具體序列如下：CAACGGTCACCAGACTCCCGCTCTCCAACAAGGTACTCACTTTATTAAAAGTTTGCTTCTTCACAAAATTAGCGAACCCCTGGAGGTGAGGTGTTCGTCCTTCCTCATTACCCTCCTCGCCAACAATAAATAATCAAACAGGGAGATTGGGAGCTCCCGTATTTTCTTGCGCTCGTCTTCGGAAGGATTATTCAGCGTGAACACCCACCTTTTATGTGGTTGGGGTCCGCTTCTT合成的基因序列克隆到pMDT-18載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，經(jīng)培養(yǎng)后進行質(zhì)粒提取，使用微量紫外分光光度計測定出質(zhì)粒的濃度，并經(jīng)過計算，確定其拷貝數(shù)，置于-20℃低溫保存。2.2指示分子的制備以適當(dāng)濃度pGFP-n3質(zhì)粒為模板，采用引物eGFP-F和eGFP-R進行PCR擴增，反應(yīng)體系為：25μl體系，TaqPlantinumPCRMasterMix12.5μL，模板2μL，上下游引物各0.5μL，，其余用滅菌蒸餾水補足25μL。反應(yīng)條件為94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR純化試劑盒純化后，置于-20℃低溫保存。3.3PCR反應(yīng)操作程序以適當(dāng)陽性模板1或陽性模板2質(zhì)粒為模板，采用引物PCV-F和PCV-R進行PCR擴增，反應(yīng)體系為：25μl體系，TaqPlantinumPCRMasterMix12.5μL，模板2μL，上下游引物各0.5μL，，其余用滅菌蒸餾水補足25μL。反應(yīng)條件為94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃5min。4試驗結(jié)果將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，陽性擴增對照1出現(xiàn)預(yù)期的586bp擴增帶，陽性擴增對照2出現(xiàn)236bp，指示分子大小386bp?？梢匀￡栃詳U增對照、指示分子混合后，進行電泳，也可以分別進行陽性擴增對照和指示分子的電泳。結(jié)果見圖1。當(dāng)前第1頁1 2 3