一種從杏鮑菇加工副產物中同步提取多糖及蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從杏鮑菇加工副產物中同步提取多糖及蛋白的方法，屬于農產品精深加工領域。杏鮑菇加工副產物是指成熟杏鮑菇采收后加工成鮮售菇過程中，被切除的沒有商業(yè)價值的粘連培養(yǎng)基的根蒂部分。將經預處理后制得的杏鮑菇加工副產物超微粉經85％乙醇室溫浸泡，離心，沉淀加入磷酸緩沖液，室溫鹽溶提取蛋白，離心，上清液經100kDa超濾膜超濾，噴霧干燥制得蛋白，截留液備用；以鹽溶過后離心沉淀為原料，熱水浸提多糖，離心，上清液與上述備用截留液混合，濃縮液經乙醇沉淀12h離心，沉淀60℃烘干，加水溶解，100kDa超濾膜超濾，截留液凍干得粗多糖；采用熱水浸提、超濾膜分離、噴霧干燥、冷凍干燥技術相結合的方法，多糖得率為10.69％，蛋白得率為11.23％。
【專利說明】一種從杏鮑菇加工副產物中同步提取多糖及蛋白的方法 一、

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從杏鮑菇加工副產物中同步提取提取蛋白及多糖的方法，屬于農 產品精深加工領域，產品可廣泛應用于功能食品、生物醫(yī)藥等領域。其中杏鮑菇加工副產物 是指在完整成熟杏鮑菇采收后加工成鮮售的產品過程中，被切除的沒有商業(yè)價值的粘連培 養(yǎng)基的根蒂部分。 二、

【背景技術】
[0002] 杏鮑菇（Pleurotus eryngii)又名刺芹側耳，在食用菌界被譽為"菇中之王"，其子 實體顏色雪白，質地脆嫩，又稱雪茸、鮑魚菇或干貝菇，為擔子菌亞門、擔子菌綱、層菌亞綱、 無隔擔子菌亞綱、傘菌目、側耳科、側耳屬食用菌。其菌肉肥厚，營養(yǎng)豐富，具有杏仁味和鮑 魚味，故稱杏仁鮑魚菇。杏鮑菇是近些年來開發(fā)栽培成功的集食療、藥用、食用于一體的珍 貴食用菌新品種。杏鮑菇中含有較高的蛋白質、碳水化合物和膳食纖維，而脂肪含量較低， 還含有V E、Vb2等多種維生素，且富含|丐、憐、鐵等多種礦物質，是一種不可多得的1?營養(yǎng)食 品。
[0003] 隨著人類對保健食品以及杏鮑菇營養(yǎng)價值的認識逐漸加深，杏鮑菇將會有非常廣 闊的開發(fā)前景，與此同時，越來越多的杏鮑菇加工副產物在杏鮑菇的生產過程中被廢棄，甚 至連作牲畜的飼料都不甚理想，沒有得到充分的利用。這樣杏鮑菇加工副產物在生產流通 環(huán)節(jié)的廢棄，給企業(yè)增加了處理廢棄物的成本。因此，杏鮑菇加工副產物的合理開發(fā)利用迫 在眉睫，所以需要為杏鮑菇加工副產物的利用開辟一條途徑。
[0004] 在杏鮑菇多糖及蛋白的開發(fā)應用中，分離提取是關鍵的步驟之一，它不僅影響著 產品的得率，直接關系經濟效益，還與產品的活性價值密切相關。杏鮑菇多糖能溶于水， 不溶于醇、醚、酮等有機溶劑，因而多糖傳統(tǒng)提取方法主要有熱水浸提法、酸堿浸提法、酶法 等。而大部分蛋白質都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類結合的蛋白質則溶于乙 醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因此，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質。但是關于此 兩類活性物質的提取方法大都單獨進行，在提取時間長、提取溫度高、能耗大的前提下很難 達到理想效果，這些都大大限制了活性物質的開發(fā)利用。利用超微粉碎、熱水浸提、超濾膜 分離與噴霧干燥技術、冷凍干燥技術相結合對多糖和蛋白進行有效的分離與純化，可以相 對快速的對這兩種活性物質進行提取與富集。同時提取過程不涉及化學試劑，具有條件溫 和、不引入雜質、無污染、產品質量好等優(yōu)點，這在一定程度上減少了對浸提物質生物活性 的影響，并且可以使多糖與蛋白的損失率降低，有利于后續(xù)純化。
[0005] 利用超微粉碎、熱水浸提、超濾膜分離與噴霧干燥技術、冷凍干燥技術相結合的方 法，研究其適宜的提取條件，是提高杏鮑菇加工副產物利用率的重要途徑，也是后續(xù)生物活 性研究的基礎。 三、


【發(fā)明內容】
[0006] 技術問題
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種從杏鮑菇加工副產物中同步提取提取蛋白及多糖的方 法，該方法避免了傳統(tǒng)提取技術提取時間長，提取率低、能耗高的弊端。同時該方法簡便，易 得，制得的多糖與蛋白無毒、安全，且得率與純度較高，可廣泛應用于保健品、功能食品、生 物醫(yī)藥等領域。可以最大程度地提高廢棄物的利用率，減少對環(huán)境的污染。
[0008] 技術方案
[0009] -種從杏鮑菇加工副產物中同步提取多糖及蛋白的方法，其特征在于收集新鮮的 杏鮑菇加工副產物，進行除雜、清洗等預處理后利用超微粉碎技術制得杏鮑菇加工副產物 超微粉，再利用鹽溶蛋白技術、熱水浸提多糖技術、超濾膜分離技術、冷凍干燥技術與噴霧 干燥技術相結合得到杏鮑菇加工副產物多糖與蛋白。提取工藝包括：
[0010] 1)杏鮑菇加工副產物超微粉的制備：新鮮杏鮑菇加工副產物經除雜、清洗、晾曬 至半干后，放于烘箱中60°C鼓風烘干，然后經30B粉碎機粉碎，雙輥破碎機破碎，80目篩分， 氣流粉碎機粉碎，300目篩分，制得杏鮑菇加工副產物超微粉，置于_4°C備用。
[0011] 2)稱取杏鮑菇加工副產物超微粉，按每Ig超微粉加10?30mL85 %乙醇的比例 室溫下浸泡2h，以除去部分色素及雜質，離心取沉淀，按每Ig沉淀加入10?20mL緩沖液 (0? 05M Na2HPO4,0? 05M NaH2PO4,0? 3M NaCl)室溫攪拌1?3h，離心沉淀用于杏鮑菇加工副 產物多糖的制備，上清液經Millipore公司超濾分離裝置過孔徑為IOOkDa的超濾膜進行超 濾，截留液備用，透過液低溫濃縮至適量，噴霧干燥制得杏鮑菇廢棄物蛋白粗品；
[0012] 3)向上述離心沉淀中加入去離子水，去離子水的用量為10?50mL/g，利用HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，以60?100°C水浴提取1?3h，4000r/min條件下離心IOmin取上清；
[0013] 4)上清液與上述超濾截留液混合低溫濃縮至原體積的1/4,濃縮液加4倍體積無 水乙醇，4°C下沉淀12h，離心取沉淀，沉淀物置60°C烘箱烘干；
[0014] 5)以干燥的沉淀為基準，按水料比200mL/g加去離子水溶解，經Mi Ilipore公司超 濾分離裝置過孔徑為IOOkDa的超濾膜進行超濾，截留液經低溫濃縮至原體積的1/4,凍干， 即得到杏鮑菇加工副產物粗多糖。
[0015] 有益效果
[0016] 本發(fā)明與傳統(tǒng)的分步提取多糖與蛋白相比，該方法具有提取時間短、操作方便、產 品安全無毒、得率與純度較高等特點，產品作為一種功能基料，可廣泛應用于功能食品和醫(yī) 藥等領域。在加工副產物的開發(fā)應用中，將其中的活性成分提取出來是關鍵的步驟之一，它 不僅單純地影響著產品的得率，直接關系經濟效益，還與產品的生物活性有著密切的關系。 由于傳統(tǒng)分步提取多糖與蛋白的方法，提取時間長，多糖與蛋白得率低，很難最大程度的提 高杏鮑菇加工副產物的利用率，為了改善這種情況，本發(fā)明采用超濾膜分離技術結合超微 粉碎技術與鹽溶技術制得杏鮑菇加工副產物蛋白；并利用熱水浸提技術與冷凍干燥技術超 濾膜分離與相結合的方法研究了浸提時間、水料比、浸提溫度這3個單因素對多糖得率的 影響，篩選各個因素的中心點，在此基礎上，采用Design experts V6.0軟件的BBD法，進行 3因素3水平的提取參數(shù)優(yōu)化試驗，同時運用Design experts V6.0軟件進行統(tǒng)計分析，確 定3個因素不同水平的最優(yōu)組合，最后優(yōu)化出杏鮑菇加工副產物多糖提取的工藝參數(shù)為浸 提時間140min，浸提溫度72°C，水料比為25mL/g，研究結果顯示按照本發(fā)明的工藝參數(shù)，杏 鮑菇加工副產物多糖的得率可達到10. 69%，蛋白的得率可達到11. 23%，與傳統(tǒng)分步提取 多糖與蛋白相比，多糖純度提高了 31. 1%，蛋白純度提高了 19. 58%，時間縮短了 lOOmin。
[0017] 本發(fā)明采用超微粉碎、熱水浸提、超濾膜分離、噴霧干燥技術、冷凍干燥技術相結 合的方法，在制得具有較高純度杏鮑菇加工副產物蛋白的同時制得了較高純度的杏鮑菇加 工副產物多糖，顯著提高多糖與蛋白的得率和提取效率，且分離過程中無有毒有機試劑參 與，所得產品無毒，安全；同時超濾膜分離技術具有設備簡單，操作容易，適用范圍廣，生產 效率高，能量損耗小等優(yōu)點。因此，該技術為杏鮑菇加工副產物的充分利用，開辟了新的途 徑。 四、【具體實施方式】
[0018] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明。 圖1是杏鮑菇加工副產物示意圖。其中圖I-A為成熟杏鮑菇；圖I-B為市售杏鮑菇；圖 I-C為未經預處理的杏鮑菇加工副產物；圖I-D為預處理過后的杏鮑菇加工副產物。 圖2是杏鮑菇加工副產物蛋白與多糖示意圖。其中圖2-A是杏鮑菇加工副產物蛋白樣 品；圖2-B是杏鮑菇加工副產物多糖樣品。 1.多糖含量的測定方法：
[0019] 采用硫酸苯酚法，精密稱取杏鮑菇加工副產物粗多糖5g，溶與250mL去離子水，精 密吸取樣液〇. 5mL，置15mL試管中，并用蒸饋水補至2mL，分別加入1II1L61%苯酚和5mL濃硫 酸，搖勻，沸水中水浴20min，自然冷卻后在490nm處測定吸光值A。以D-半乳糖為標準品， 制作標準曲線。
[0020] 蛋白含量的測定方法：微量凱氏定氮法（GB5009. 5-2010)
[0021] 粗多糖及蛋白得率的計算公式：
[0022] 粗多糖得率（％ )=粗多糖質量（g)/超微粉重（g) X 100%
[0023] 粗蛋白得率（％)=粗蛋白質量（g)/超微粉重（g) X 100%
[0024] 2?原料預處理
[0025] 杏鮑菇加工副產物，由南京市高固食用菌科貿有限公司提供。
[0026] 杏鮑菇加工副產物超微粉的制備：新鮮杏鮑菇加工副產物經除雜、清洗、晾曬至半 干后，放于烘箱中60°C鼓風烘干，然后經30B粉碎機粉碎，雙輥破碎機破碎，80目篩分，氣流 粉碎機粉碎，300目篩分，制得杏鮑菇加工副產物超微粉，置于_20°C備用。
[0027] 稱取杏鮑菇加工副產物超微粉，按每Ig超微粉加15mL85%乙醇的比例室溫下浸 泡2h，以除去部分色素及雜質，離心取沉淀，備用。
[0028] 3.熱水浸提杏鮑菇加工副產物粗多糖（對照）
[0029] 1)取經過乙醇預處理的沉淀物，以原料為基準，按水料比28mL/g加入420mL去離 子水充分混勻，在80°C水浴中浸提4h(浸提期間可以適時攪拌）；
[0030] 2)浸提液5000r/min離心15min取上清，上清液采用Sevag試劑（正丁醇：三氯 甲燒=1 : 4)法去蛋白，8000r/min條件下離心IOmin取上清；
[0031] 3)上清液置旋轉蒸發(fā)儀（N-1100EYELA型旋轉蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會 社）50°C減壓濃縮至適量，濃縮液加4倍體積無水乙醇于4°C冰箱沉淀12h ;
[0032] 4) 5000r/min離心15min取沉淀物，沉淀物置60°C烘箱烘干，即可得到熱水浸提的 杏鮑菇加工副產物粗多糖。粗多糖得率為8. 26%，提取時間為240min。
[0033] 采用傳統(tǒng)熱水浸提多糖的最優(yōu)條件稍作修改，提取溫度80°C，提取時間240min， 水料比28mL/g時，多糖的得率為8. 26%。
[0034] 4?低溫鹽溶提取杏鮑菇加工副產物蛋白（對照）
[0035] 1)取經過乙醇預處理的沉淀物，按每Ig沉淀加入15mL緩沖液（0. 05M Na2HPO4, 0? 05M NaH2PO4,0? 03M NaCl)室溫攪拌 2h ;
[0036] 2)鹽溶溶液5000r/min離心15min取上清；
[0037] 3)上清液置旋轉蒸發(fā)儀（N-1100EYELA型旋轉蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會 社）50°C減壓濃縮至適量；
[0038] 4)對濃縮液進行噴霧干燥即可得到低溫鹽溶提取的杏鮑菇加工副產物蛋白。蛋白 得率為9. 23%，提取時間為120min。
[0039] 采用低溫鹽溶的提取方法的最優(yōu)條件作修改，提取溫度4°C，提取時間120min，液 料比15mL/g時，蛋白的得率為9. 23%
[0040] 5?熱水浸提、超濾膜分離與鹽溶技術結合法（本發(fā)明）
[0041] 1)取經過乙醇預處理的沉淀物，按每Ig沉淀加入15mL緩沖液（0. 05M Na2HPO4, 0.05M NaH2PO4,0.03M NaCl)室溫攪拌2h，離心取上清，經Millipore公司超濾分離裝置過 孔徑為IOOkDa的超濾膜進行超濾，透過液置旋轉蒸發(fā)儀（N-1100EYELA型旋轉蒸發(fā)儀，日本 東京理化器械株式會社）50°C減壓濃縮至原體積的1/4,噴霧干燥制得杏鮑菇加工副產物 蛋白粗品；
[0042] 2)向上述離心沉淀中加入去離子水，去離子水的用量為10?50mL/g，利用HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，以60?100°C水浴提取1?3h，4000r/min條件下離心IOmin取上清；
[0043] 3)上清液與上述超濾截留液混合，置旋轉蒸發(fā)儀（N-1100EYELA型旋轉蒸發(fā)儀，日 本東京理化器械株式會社）50°C減壓濃縮至原體積的1/4,濃縮液加4倍體積無水乙醇，4°C 下沉淀12h，離心取沉淀，沉淀物置60°C烘箱烘干；
[0044] 4)以干燥的沉淀為基準，按水料比200mL/g加去離子水溶解，經Mi Ilipore公司超 濾分離裝置過孔徑為IOOkDa的超濾膜進行超濾，截留液經旋轉蒸發(fā)濃縮至原體積的1/4， 凍干，即得到杏鮑菇加工副產物粗多糖；粗多糖得率為10. 69%，粗蛋白得率為11. 23%，所 用時間為260min。
[0045] 選擇浸提溫度、浸提時間和水料比做單因素試驗，通過單因素試驗初步確定3個 變量的適宜范圍，進行三因素三水平Box-Behnken試驗設計，各因素的試驗水平及編碼列 于表1，Box-Behnken試驗設計及其響應值見表2。
[0046] 表IBox-Behnken試驗設計各因素的試驗水平及編碼
[0047]

【權利要求】
1. 本發(fā)明涉及一種從杏鮑菇加工副產物中同步提取多糖及蛋白的方法，其特征在于收 集新鮮的杏鮑菇加工副產物，進行除雜、清洗等預處理后利用超微粉碎技術制得杏鮑菇加 工副產物超微粉，再利用鹽溶蛋白技術、熱水浸提多糖技術、超濾膜分離技術、冷凍干燥技 術與噴霧干燥技術相結合得到杏鮑菇加工副產物多糖與蛋白。 1) 稱取杏鮑菇加工副產物超微粉，按每lg超微粉加10?20mL85%乙醇的比例室溫下 浸泡2h，以除去部分色素及雜質，離心取沉淀，按每lg沉淀加入10?30mL緩沖液（0. 05M Na2HP04,0 . 05M NaH2P04,0 . 03M NaCl)室溫攪拌1?3h，離心沉淀用于杏鮑菇加工副產物多 糖的制備，上清液經孔徑為lOOkDa的超濾膜超濾，截留液4°C備用，透過液低溫濃縮，噴霧 干燥得杏鮑菇加工副產物蛋白產品； 2) 向上述備用離心沉淀中加入去離子水，去離子水的用量為10?50mL/g，以60? 10(TC熱水提取1?3h，4000r/min條件下離心lOmin取上清；上清液與上述截留液混合，低 溫濃縮至原體積的1/4,濃縮液加4倍體積無水乙醇，沉淀12h，離心取沉淀，沉淀物置60°C 烘干；以干燥的沉淀為基準，按水料比150?300mL/g加去離子水溶解，經孔徑為lOOkDa 的超濾膜進行超濾，截留液經低溫濃縮至原體積的1/4,凍干得到杏鮑菇加工副產物多糖產 品。
2. 根據(jù)權利要求1所述的從杏鮑菇加工副產物中同步提取多糖及蛋白的方法，其特征 在于，杏鮑菇加工副產物是指在完整成熟杏鮑菇采收后加工成鮮售的產品過程中，被切除 的沒有商業(yè)價值的粘連培養(yǎng)基的根蒂部分.
3. 根據(jù)權利要求1和2所述的從杏鮑菇加工副產物中同步提取多糖及蛋白的方法，其 特征在于新鮮杏鮑菇加工副產物經除雜、清洗、晾曬至半干后，放于烘箱中60°C鼓風烘干， 然后經粉碎機粉碎，雙輥破碎機破碎，80目篩分，氣流粉碎機粉碎，300目篩分，制得杏鮑菇 加工副產物超微粉。
【文檔編號】C08B37/00GK104292348SQ201410366273
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權日:2014年7月28日
【發(fā)明者】胡秋輝, 馬高興, 楊文建, 趙立艷, 裴斐, 安辛欣, 楊方美, 王賀祥, 程薇, 張夢甜, 方勇, 馬寧, 余杰 申請人:南京農業(yè)大學, 南京財經大學