一種杏鮑菇下腳料粗多糖及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種杏鮑菇下腳料粗多糖，其是由如下方法制備得到的：粗多糖的提取、乙醇沉淀、透析及干燥。本發(fā)明制備的杏鮑菇下腳料粗多糖得率高，蛋白質(zhì)含量低，同時粗多糖中β-葡聚糖含量大大增加。
【專利說明】一種杏鮑菇下腳料粗多糖及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明主要涉及食用菌提取領(lǐng)域，具體的說，涉及一種杏鮑菇下腳料粗多糖及其 制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 杏鮑菇（Pleurotus Eryngii)是近年來開發(fā)栽培成功的集食用、藥用于一體的珍 稀食用菌新品種?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，杏鮑菇多糖含量豐富，是主要的活性成分之一，其 在抗血栓、調(diào)血脂、調(diào)節(jié)免疫功能和抗腫瘤、抗放射方面都具有顯著的藥理作用。
[0003] 杏鮑菇下腳料是菌腳、菇片、菌柄基部等杏鮑菇加工副產(chǎn)物，在加工過程中因難以 食用或商品價值低而被廢棄。
[0004] 常規(guī)粗多糖提取只是將杏鮑菇下腳料粉碎為粗粉，獲得的多糖粗品得率低且多糖 含量低，尤其是普通粉碎很難使胞壁多糖得到大量釋放，使多糖粗品中β-葡聚糖含量偏 低。同時，普通粉碎提取多糖蛋白質(zhì)含量高，但現(xiàn)有的脫蛋白技術(shù)較為復(fù)雜，且會造成多糖 的損失，不利于規(guī)?；a(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種杏鮑菇下腳料粗多糖及其制備方法，以 克服現(xiàn)有技術(shù)中粗多糖提取得率低，粗多糖中β -葡聚糖含量低，難以工業(yè)化生產(chǎn)的缺點。
[0006] 本發(fā)明首先提供了一種杏鮑菇下腳料粗多糖，其是由如下方法制備得到的：
[0007] 粗多糖的提?。簩⑿吁U菇下腳料粉碎成納米級別粉末，沸水提取l_2h得到粗多糖 提取液；
[0008] 乙醇沉淀：粗多糖提取液中加入無水乙醇，至乙醇含量達到70% -80%，室溫靜置 12_15h，收集沉淀；
[0009] 透析及干燥：將沉淀加水溶解，用截留分子量為3500Da透析袋透析，將透析后的 溶液冷凍干燥，即得杏鮑菇下腳料粗多糖。
[0010] 具體的說，本發(fā)明的杏鮑菇下腳料粗多糖是通過如下方法制備得到的：
[0011] 粗多糖的提取：以杏鮑菇下腳料為原料，粉碎成納米級別粉末，加入15-20倍重量 的水中，常溫浸泡30-60min，加熱至沸騰，保持微沸60-120min，9700g離心10-15min ;上清 液減壓濃縮至料液比（質(zhì)量/體積）為1:6-1:7 ;
[0012] 乙醇沉淀：向濃縮液中緩慢加入無水乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇含量達到 70% -80%，室溫靜置12-15h，離心去除醇沉上清，收集沉淀。
[0013] 透析及干燥：沉淀加水溶解，用截留分子量為3500Da透析袋對粗多糖溶液4°C透 析3-4d，將透析后的溶液冷凍干燥，即得杏鮑菇粗多糖。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種制備杏鮑菇下腳料粗多糖的制備方法，其包括如下步驟：
[0015] 粗多糖的提?。簩⑿吁U菇下腳料粉碎成納米級別粉末，沸水提取l-2h得到粗多糖 提取液；
[0016] 乙醇沉淀：粗多糖提取液中加入無水乙醇，至乙醇含量達到70% -80%，室溫靜置 12-15h，收集沉淀；
[0017] 透析及干燥：將沉淀加水溶解，用截留分子量為3500Da透析袋透析，將透析后的 溶液冷凍干燥，即得杏鮑菇粗多糖。
[0018] 本發(fā)明制備得到的杏鮑菇下腳料粗多糖得率高，超過10%，多糖含量達到 60%以上，蛋白質(zhì)含量低，同時粗多糖中β-葡聚糖含量大大增加，含量超過30 %。 HPSEC-MALLS-RI分析顯示粗多糖主要有三個糖峰，單糖分析結(jié)果顯示粗多糖主要由葡萄糖 組成，且粗多糖對RAW264.7巨噬細胞株釋放Ν0有明顯的促進作用。所以本制備方法是一 種簡便、高效、成本低、粗多糖得率及含量高、廢棄物綜合利用的適合規(guī)?；a(chǎn)的方法。
[0019] 本發(fā)明通過將杏鮑菇下腳料納米級粉碎，使胞壁多糖大量釋放，從而提高了粗糖 得率，并使多糖含量和β-葡聚糖含量大大增加。同時，粗多糖表現(xiàn)出很好的細胞免疫活 性。
[0020] 因而，利用杏鮑菇下腳料提取杏鮑菇粗多糖，不但原料來源豐富、生產(chǎn)成本低，而 且節(jié)約資源、減少環(huán)境污染，達到杏鮑菇資源綜合利用的目的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1粗多糖的分子量分布
[0022] 圖2粗多糖的單糖組成
[0023] 圖3粗多糖促進RAW264. 7巨噬細胞株釋放的Ν0量

【具體實施方式】：
[0024] 實施例1 :
[0025] 1、杏鮑菇粗多糖的提取：以杏鮑菇下腳料（杏韓，上海國森生物科技有限公司）為 原料，粉碎成納米級別粉末（秦皇島太極環(huán)納米制品有限公司粉碎設(shè)備CJM-SY-B，粉碎時 間6h，粒度10-1000nm)，稱取10g，加入200mL蒸餾水，常溫浸泡60min，加熱至沸騰，保持微 沸120min，9700g離心12min。沉淀重復(fù)上述步驟，再提取1次，合并上清液。
[0026] 2、多糖粗提液的濃縮：上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至60mL。
[0027] 3、乙醇沉淀：向濃縮液中緩慢加入無水乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇含量達到70%， 室溫靜置12h，離心去除醇沉上清，收集沉淀。
[0028] 4、透析及干燥：沉淀加70mL水溶解，用截留分子量為3500Da透析袋（國藥集團 化學(xué)試劑有限公司）對粗多糖溶液4°C透析3d，去除小分子物質(zhì)。將透析好的粗多糖溶液 置于-20°C冰箱中凍存2h，然后再放到-80°C冰箱中冷凍3h，最后放入冷凍干燥機中冷凍干 燥，即得粗多糖干品。
[0029] 制備所得粗多糖得率為12.30%，多糖含量為61.55%，β-葡聚糖含量為 31. 63%。
[0030] 分析天平稱量粗多糖干品的重量。按以下公式計算粗多糖得率。
[0031] 粗多糖得率：％) = ^f!f^y.g)xi〇Q% 稱取樣品重量g)
[0032] 多糖和β -葡聚糖含量的檢測：
[0033] 多糖含量測定：用苯酚一硫酸法測定，精密稱取本品5mg置2ml離心管中，加蒸餾 水lml，加熱助溶后冷卻至室溫，離心。上清液稀釋100倍，精密吸取樣品1. 0ml，置15ml試 管中，分別加入苯酚、硫酸試劑，充分反應(yīng)后在490nm處測定吸光度值，以葡聚糖為標準品 計算樣品的糖含量。
[0034] β -葡聚糖含量測定：參照Megazyme公司的酵母和蘑燕β -葡聚糖檢測試劑盒中 的方法對多糖樣品中β_葡聚糖含量進行測定。
[0035] 實施例2 :
[0036] 1、杏鮑菇粗多糖的提?。阂孕吁U菇下腳料（杏韓，上海國森生物科技有限公司）為 原料，粉碎成納米級別粉末（秦皇島太極環(huán)納米制品有限公司粉碎設(shè)備CJM-SY-B，粉碎時 間6h，粒度10-1000nm)，稱取10g，加入150mL蒸餾水，常溫浸泡30min，加熱至沸騰，保持微 沸120min，9700g離心12min。沉淀重復(fù)上述步驟，再提取1次，時間為60min，合并上清液。
[0037] 2、多糖粗提液的濃縮：上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至70mL。
[0038] 3、乙醇沉淀：向濃縮液中緩慢加入無水乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇含量達到75%， 室溫靜置15h，離心去除醇沉上清，收集沉淀。
[0039] 4、透析及干燥：沉淀加50mL水溶解，用截留分子量為3500Da透析袋（國藥集團 化學(xué)試劑有限公司）對粗多糖溶液4°C透析3d，去除小分子物質(zhì)。將透析好的粗多糖溶液 置于-20°C冰箱中凍存2h，然后再放到-80°C冰箱中冷凍3h，最后放入冷凍干燥機中冷凍干 燥，即得粗多糖干品。
[0040] 制備所得粗多糖得率為10.97%，多糖含量為67.33 %，β-葡聚糖含量為 35. 60%。
[0041] 實施例3:
[0042] 1、樣品制備：稱取5mg實施例1制備得到的粗多糖，加入lmLHPLC流動相，充分溶 解，13200r/min離心10min，上清液經(jīng)0. 25 μ m的水相微孔膜過濾后進行HPSEC-MALLS-RI 分析。
[0043] 2、色譜分析條件：分析柱選TSK PWXL6000和TSK PWXL3000凝膠色譜柱串聯(lián)后分 析，流動相為含0.05111〇1/1的似托?04和0.15111〇1/1的似勵 3溶液（?!1=7,0.02%疊氮鈉）， 流速為0. 5mL/min，色譜柱溫用柱溫箱恒定在35°C ;激光檢測器光源波長選用623. 8nm。多 糖在溶液中的折光指數(shù)增量（dn/dc)按照0. 146mL/g計算。
[0044] 3、分子量計算：使用 Astra (version6. 1. 1，Wyatt Technology, Santa Barbara，CA)數(shù)據(jù)分析軟件對光散射數(shù)據(jù)進行采集和分析，計算分子量和其他多糖分子特 性。
[0045] HPSEC-MALLS-RI分析圖譜如圖1所示。杏鮑菇下腳料經(jīng)納米粉粉碎處理后所得粗 多糖組分主要含有3個峰，且分子量分布范圍較寬，為25萬到500萬道爾頓之間。實施例 4 ：
[0046] 1、樣品制備：稱取實施例2制備得到的粗多糖2mg加入帶蓋玻璃瓶，加入2mL的 2mol/L的三氟乙酸，110°C油浴4h，冷卻至室溫，50°C氮吹儀吹干，再加甲醇吹干，重復(fù)兩次 至無酸味，用2mL超純水沖洗玻璃瓶于離心管中，13200r/min離心10min，對上清液上高效 陰離子色譜（HPAEC)分析。
[0047] 2、色譜條件：色譜柱 CarboPac?PA20 (3X 150nm);流動相 0· 8% NaOH 溶液（pH = 12);時間 30min ;柱溫 30°C ;流速 0· 45mL/min ;進樣量 25 μ L。
[0048] 經(jīng)高效陰離子色譜檢測所得單糖組成如圖2所示。粗多糖組分經(jīng)水解后由阿拉 伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖五種單糖組成，其中葡萄糖所占比例最高，達到70%以 上，其次是甘露糖、半乳糖，約為10%，而木糖、阿拉伯糖比例很低。
[0049] 實施例5 :
[0050] 杏鮑菇下腳料粗多糖體外刺激巨噬細胞釋放N0的活性測定：
[0051] 1、樣品準備：分別精確稱取實施例1和實施例2制備得到的杏鮑菇下腳料粗多糖 樣品于滅過菌的eppendorf管中，用無菌的PBS配制成濃度5mg/mL的樣品液。充分溶解后 以15000r/min離心40min，無菌條件下將上清轉(zhuǎn)移至新的無菌eppendorf管中，將樣品稀釋 成 2mg/ml、0. 5mg/ml 待用。
[0052] 2、細胞培養(yǎng)：取對數(shù)生長期的RAW264. 7巨噬細胞株（購自中科院細胞所），用 DMEM完全培養(yǎng)基（Gibco公司）在37°C、含5% C02條件下傳代培養(yǎng)，用0. 05%胰酶（Gibco 公司）消化，混懸液l〇〇〇rpm/min離心3min后收集細胞，計數(shù)備用。
[0053] 3、試劑配制及標準曲線繪制
[0054] Griess試劑：在燒杯中加入6. 25ml Η3Ρ03，加入蒸饋水250ml，分別加入2. 5g磺胺 (sulfanilamide，Sigma公司）和 0· 25g萘基乙二胺二鹽酸鹽（naphthyl ethyylenediamine dihydrochloride，Sigma公司），用磁力攪拌器至全部溶解，棕色試劑瓶4°C冰箱保存。
[0055] 標準曲線繪制：配成不同濃度的亞硝酸鈉溶液，濃度梯度為0、5、10、15、20、25、 30、35、40 μ Μ共九個；取100 μ L于96孔板孔，加入50 μ L Griess試劑，測定543nm吸光 值，標準曲線每個濃度3個重復(fù)，根據(jù)吸光值繪制標準曲線。
[0056] 4、樣品刺激巨噬細胞釋N0量的測定：收集RAW264. 7細胞，用無色RPMI1640(10% 胎牛血清+1 %抗生素液體，Gibco公司）培養(yǎng)基將細胞稀釋至5 X 105/mL，加入96孔板，每孔 加入180μ L，然后再加入20μ L待測樣品，陽性對照為LPS(1 μ g/mL，Sigma公司），37°C培 養(yǎng)48h。取100 μ L上清于96孔板孔，加入50 μ 1 Griess試劑，室溫孵浴10min，測定543nm 吸光值。根據(jù)標準曲線計算細胞NO的釋放量。
[0057] 結(jié)果見附圖3,由此結(jié)果可以看出，實施例1和實施例2制備得到的杏鮑菇下腳料 粗多糖對RAW264. 7巨噬細胞株釋放N0有明顯的促進作用，可明顯增強巨噬細胞的吞噬殺 傷能力，從而增強機體的抗腫瘤能力。
【權(quán)利要求】
1. 一種杏鮑菇下腳料粗多糖的，其特征在于其是由如下方法制備得到的： 粗多糖的提取：將杏鮑菇下腳料粉碎成納米級別粉末，沸水提取l-2h得到粗多糖提取 液； 乙醇沉淀：粗多糖提取液中加入無水乙醇，至乙醇含量達到70 % -80%，室溫靜置 12-15h，收集沉淀； 透析及干燥：將沉淀加水溶解，用截留分子量為3500Da透析袋透析，將透析后的溶液 冷凍干燥，即得杏鮑菇下腳料粗多糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的杏鮑菇下腳料粗多糖，其特征在于其是通過如下方法制備得 到的： 粗多糖的提取：以杏鮑菇下腳料為原料，粉碎成納米級別粉末，加入15-20倍重量的水 中，常溫浸泡30-60min，加熱至沸騰，保持微沸60-120min，9700g離心10-15min ;;上清液 減壓濃縮至料液比（質(zhì)量/體積）為1:6-1:7 ; 乙醇沉淀：向濃縮液中緩慢加入無水乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇含量達到70% -80%， 室溫靜置12-15h，離心去除醇沉上清，收集沉淀； 透析及干燥：沉淀加水溶解，用截留分子量為3500Da透析袋對粗多糖溶液4°C透析 3-4d，將透析后的溶液冷凍干燥，即得杏鮑菇粗多糖。
3. -種制備權(quán)利要求1或2所述杏鮑菇下腳料粗多糖的方法，其特征在于其包括如下 步驟： 粗多糖的提?。簩⑿吁U菇下腳料粉碎成納米級別粉末，沸水提取l_2h得到粗多糖提取 液； 乙醇沉淀：粗多糖提取液中加入無水乙醇，至乙醇含量達到70% -80%，室溫靜置 12-15h，收集沉淀； 透析及干燥：將沉淀加水溶解，用截留分子量為3500Da透析袋透析，將透析后的溶液 冷凍干燥，即得杏鮑菇粗多糖。
【文檔編號】C08B37/00GK104059161SQ201410293210
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】張勁松, 薛令坤, 劉艷芳, 唐慶九, 周帥, 楊焱, 吳迪, 顏夢秋, 馮娜, 賈薇, 唐傳紅, 汪雯翰, 馮杰 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院