專利名稱：一種從肝素廢液中分離天然低分子肝素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種從肝素廢液中分離天然低分子肝素的方法。
背景技術(shù)：
肝素(普通肝素即未分級肝素)，是一種高度硫酸化的糖胺聚糖，在體內(nèi)和體外都有抗凝血作用，其分子量范圍為300(T30000 Da。在臨床上主要用于血液透析、血栓栓塞性疾病、心血管手術(shù)、心臟導(dǎo)管檢查、體外循環(huán)等。肝素的抗凝血活性分為抗栓活性(FXa)和抗凝(FIIa)活性兩大類。其最大的副作用是引起出血，有時甚至?xí)?dǎo)致出血性死亡，因此，為了解決其出血的問題，人們研制了新型的抗凝血藥物——低分子肝素。這類藥物是普通 肝素的一種升級產(chǎn)品，具有鏈短、結(jié)合部位少、生物利用度高、半衰期長等優(yōu)點。在抗血栓形成的過程中，抗FXa活性與抗FIIa活性的作用都是必需的，抗血栓作用的衡量標(biāo)準(zhǔn)用抗FXa / FIIa值表示,其值越大,表示抗血栓作用越強，出血傾向越小。當(dāng)皮下注射低分子肝素時，其在體內(nèi)的抗FXa作用要比普通肝素強得多，而抗FIIa活性較弱，還具有體內(nèi)半衰期延長、生物利用度高等優(yōu)點，目前已逐漸取代肝素成為主流的抗血栓類的藥物。由于低分子肝素在未分級肝素中的含量較低，目前市場上低分子肝素都是由未分級肝素經(jīng)化學(xué)降解或酶降解方法制備的鈉鹽或鈣鹽。其平均分子量約為5000 Da分子量分布為300(T8000 Da。在降解的過程中，部分戊糖抗凝血活性中心被破壞，只有約20%的組分具有戊糖活性中心。低分子量肝素與肝素相比，抗栓活性降低了約30%，抗凝活性則更低。降解后所制備的低分子肝素與天然低分子肝素相比，除了效價偏低以外，還會有雜質(zhì)過多、質(zhì)量難以控制以及結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定等缺點。目前還無法人工合成在效果和結(jié)構(gòu)上能與天然低分子肝素想媲美的產(chǎn)品。另外，在肝素制備的過程中，為了獲得更高的效價，往往采取低倍乙醇分級沉淀的方式除去天然低分子肝素，因此會有大量的天然低分子肝素溶解于乙醇中。平均每生產(chǎn)I kg普通肝素所消耗的醫(yī)用乙醇約為100 kg，而這些醇沉液最終被排放至乙醇回收塔中，再乙醇回收完畢以后最終被作為廢液排放到自然界中。這種處理方法不僅會導(dǎo)致對環(huán)境造成極大的污染，而且會導(dǎo)致天然低分子肝素資源的極大的浪費。目前還缺少對這類廢液最合適的處理方法。隨著技術(shù)的進(jìn)步和加工工藝的發(fā)展，各種膜材料逐漸用于生物分離工藝，從而使原本復(fù)雜的分離工藝變得簡單易行。與傳統(tǒng)分離方法相比，膜分離方法具有效率高、工作條件溫和、可連續(xù)操作等優(yōu)點，因此在工業(yè)上得到了越來越廣泛的應(yīng)用。超濾技術(shù)是利用膜的選擇性透過原理，將大分子截留于膜上而允許小分子物質(zhì)透過。在傳統(tǒng)的超濾過程中隨著超濾的進(jìn)行，由于濃差極化現(xiàn)象而使大分子物質(zhì)在膜介質(zhì)表面不斷堆積，造成超濾膜的通量大大降低，影響分離效率，因此在實際應(yīng)用中常采用錯流過濾或切向流過濾來提高超濾效率。在切向流超濾技術(shù)中，原料液的流向平行于超濾膜，從而可以及時將沉積在超濾膜表面的大分子溶質(zhì)隨著料液的流動而轉(zhuǎn)移，有效緩解膜通量下降過快的問題。通過濾液回流和重復(fù)超濾，可對濾液中溶質(zhì)進(jìn)行快速濃縮和分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是根據(jù)上述現(xiàn)有技術(shù)的狀況而提供一種從肝素廢液中分離天然低分子肝素的方法；該方法通過對肝素廢液進(jìn)行酶水解、堿氧純化、濾膜過濾除雜后，再采用多膜分級切向超濾法，使用200(T10000 Da多種規(guī)格超濾膜作為手段，從預(yù)處理過的肝素廢液中分尚得到分子范圍為3000 8000 Da的天然低分子肝素組分；分尚成本低，分尚效率聞，所制備的低分子肝素是純天然的產(chǎn)物，保持著天然的構(gòu)象，無有機試劑殘留。本發(fā)明的一種從肝素廢液中分離天然低分子肝素的方法，包括以下步驟
1)酶水解，除去小分子蛋白取肝素廢液，用NaOH溶液調(diào)整pH為擴(kuò)11之間，在4(T50°C加入胰蛋白水解酶攪拌15 24小時，然后將溫度升至9(T95°C保溫疒3個小時，離心，棄去沉淀，向上清液中加入NaCl和乙醇，沉淀12 18小時，得沉淀物；其中胰蛋白水解酶及NaCl的用量按kg/L計，分別為肝素廢液體積的O. 1%和1%，乙醇的用量為上清液體積的2-3倍；
2)堿氧純化，脫色在步驟I)所得的沉淀物中加入其重量3(Γ60倍的純化水，攪拌溶 解，得溶解液；控制溶解液溫度為40°C ^50°C，調(diào)整溶解液pH為9 11之間，加入溶解液體積
O.Γ0. 5%的過氧化氫，室溫攪拌反應(yīng)6-8小時，得純化液；
3)濾膜過濾除雜將步驟2)所得的純化液，用O.45 μ m微孔濾膜過濾，以除去溶液中懸浮的顆粒，得濾液；
4)切向流超濾將步驟3)所得到的濾液進(jìn)行切向流超濾，先選擇截留分子量為8，000-10，000 Da的超濾膜超濾，除去大分子肝素，收集透過液；再選擇截留分子量為2000^3000的超濾膜對所收集的透過液超濾，除去小分子肝素，收集截留液；
5)分段醇沉除雜，除去截留液中的硫酸皮膚素和硫酸乙酰肝素等雜質(zhì)向4)所得的截留液中加入O. 7 O. 8倍體積的甲醇，IO0C以下沉淀12 18小時，分離得沉淀物；在沉淀物加入其重量3飛倍的純化水，待沉淀完全溶解后，向溶液中加入O. 7 O. 8倍體積的甲醇，IO0C以下沉淀12 18小時，分離得沉淀物；將沉淀物真空干燥后，在干燥的沉淀物中加入其重量2^4倍的純化水溶解，得待檢測液；
6)檢測對5)中待檢測液的效價、平均分子量及分子量分布進(jìn)行測定，若平均分子量和分子量分布不符合低分子肝素的標(biāo)準(zhǔn)，則繼續(xù)按步驟4)的操作對待檢測液進(jìn)行循環(huán)超濾，至達(dá)到或高于低分子肝素標(biāo)準(zhǔn)為止；將超濾后的溶液，經(jīng)O. 22 μ m的濾膜過濾，得濾液；再用HCl溶液調(diào)節(jié)濾液pH值至6. 5^7. 4之間；
7)凍干將濾液凍干，即得到天然低分子肝素；其平均分子量為350(T5500Da，其中< 3000 Da的低分子肝素比例彡5. 0%，> 8000 Da的低分子肝素比例彡10. 0%
為6 9，其中抗FXa效價為145-180 IU/mg，抗FIIa效價為20 30 IU/mg。所述的肝素廢液，是指在普通肝素制備過程中的所產(chǎn)生的廢液。所述的切向流超濾，其進(jìn)料液流速控制為1-2 L/min、料液進(jìn)口壓力為O. 9-1. 2bar、回流排放壓力為O. 5-0. 7 bar,超濾溫度為室溫。以下是本發(fā)明產(chǎn)品的檢測結(jié)果與低分子肝素標(biāo)準(zhǔn)(EP)對照表
權(quán)利要求
1.一種從肝素廢液中分離天然低分子肝素的方法，其特征在于包括以下步驟 1)酶水解，除去小分子蛋白取肝素廢液，用NaOH溶液調(diào)整pH為9 11之間，在4(T50°C加入胰蛋白水解酶攪拌15 24小吋，然后將溫度升至9(T95°C保溫3個小時，離心，棄去沉淀，向上清液中加入NaCl和こ醇，沉淀12 18小時，得沉淀物；其中胰蛋白水解酶及NaCl的用量按kg/L計，分別為肝素廢液體積的O. 1%和1%，こ醇的用量為上清液體積的2-3倍； 2)堿氧純化，脫色在步驟I)所得的沉淀物中加入其重量3(Γ60倍的純化水，攪拌溶解，得溶解液；控制溶解液溫度為40°C ^50°C，調(diào)整溶解液pH為9 11之間，加入溶解液體積O.Γ0. 5%的過氧化氫，室溫攪拌反應(yīng)6-8小時，得純化液； 3)濾膜過濾除雜將步驟2)所得的純化液，用O.45 μ m微孔濾膜過濾，以除去溶液中懸浮的顆粒，得濾液； 4)切向流超濾將步驟3)所得到的濾液進(jìn)行切向流超濾，先選擇截留分子量為8，000-10，000 Da的超濾膜超濾，收集透過液；再選擇截留分子量為200(Γ3000的超濾膜對所收集的透過液超濾，收集截留液； 5)分段醇沉除雜，除去截留液中的硫酸皮膚素和硫酸こ酰肝素等雜質(zhì)向4)所得的截留液中加入O. 7 O. 8倍體積的甲醇，10°C以下沉淀12 18小時，分離得沉淀物；在沉淀物加入其重量3飛倍的純化水，待沉淀完全溶解后，向溶液中加入O. 7 O. 8倍體積的甲醇，IO0C以下沉淀12 18小時，分離得沉淀物；將沉淀物真空干燥后，在干燥的沉淀物中加入其重量2^4倍的純化水溶解，得待檢測液； 6)檢測對5)中待檢測液的效價、平均分子量及分子量分布進(jìn)行測定，若平均分子量和分子量分布不符合低分子肝素的標(biāo)準(zhǔn)，則繼續(xù)按步驟4)的操作對待檢測液進(jìn)行循環(huán)超濾，至達(dá)到或高于低分子肝素標(biāo)準(zhǔn)為止；將超濾后的溶液，經(jīng)O. 22 μ m的濾膜過濾，得濾液；再用HCl溶液調(diào)節(jié)濾液pH值至6. 5^7. 4之間； 7)凍干將濾液凍干，即得到天然低分子肝素；其平均分子量為350(T5500Da，其中< 3000 Da的低分子肝素比例彡5. 0%，> 8000 Da的低分子肝素比例彡10. 0%為6 9，其中抗FXa效價為145-180 IU/mg，抗FIIa效價為20 30 IU/mg。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種從肝素廢液中分離天然低分子肝素的方法，其特征在于所述的肝素廢液，是指在普通肝素制備過程中的所產(chǎn)生的廢液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的ー種從肝素廢液中分離天然低分子肝素的方法，其特征在于所述的切向流超濾，其進(jìn)料液流速控制為1-2 L/min、料液進(jìn)ロ壓カ為O. 9-1. 2 bar、回流排放壓カ為O. 5-0. 7 bar，超濾溫度為室溫。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從肝素廢液中分離低分子肝素的方法；本發(fā)明方法在對肝素廢液進(jìn)行酶水解、堿氧純化、濾膜過濾除雜等預(yù)處理的基礎(chǔ)上，采用多膜分級切向超濾法，使用2000~10000Da多種規(guī)格超濾膜，從預(yù)處理過的肝素廢液中分離天然低分子肝素組分；所得到的天然低分子肝素分子量分布范圍為3000~8000Da，平均分子量為3500~5500Da，其中＜3000Da的低分子肝素比例≤5.0%，＞8000Da的低分子肝素比例≤10.0%；抗FXa/FIIa為6~9，其中抗FXa效價為145-180IU/mg，抗FIIa效價為20~30IU/mg，有望成為抗血栓的候選藥物；本發(fā)明方法分離成本低，分離效率高，所制備的低分子肝素是純天然的產(chǎn)物，保留了天然構(gòu)象，無有機試劑殘留。
文檔編號C08B37/10GK102731683SQ201210245959
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月17日
發(fā)明者周霞, 郭恩中, 郭維, 雷曉剛 申請人:湖北億諾瑞生物制藥有限公司