專利名稱：大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海藻酸鈉凝膠的制備方法，尤其涉及一種大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法。
(二).
背景技術(shù)：
近年來，生物技術(shù)的發(fā)展非常迅速。運用基因工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)，已能設(shè)計、制造、生產(chǎn)人們急需的多種蛋白質(zhì)。和其它生物產(chǎn)品的生產(chǎn)過程一樣，蛋白質(zhì)的生產(chǎn)過程一般也分為上、中、下游過程。下游技術(shù)在生物技術(shù)產(chǎn)品成本中占有很大比例，整個分離純化過程所需費用約占成本的60% 80%，是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵所在。 離子交換吸附劑是目前在蛋白質(zhì)分離純化中應(yīng)用最為廣泛的分離介質(zhì)。適用于蛋白質(zhì)分離純化的層析介質(zhì)必須滿足如下要求(1)大的孔徑以便大分子量的活性蛋白擴散進出，通過表面作用或體積排阻實現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。(2)應(yīng)具有良好的親水性避免活性蛋白發(fā)生不可逆吸附或吸附變性失活?，F(xiàn)在應(yīng)用較為廣泛的蛋白分離介質(zhì)是交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖凝膠等。但其價格昂貴，嚴重制約著生物下游技術(shù)的發(fā)展。海藻酸鈉是由3-D-甘露糖醛酸和α -L-古羅糖醛酸組成的聚陰離子多糖(海藻酸)的鈉鹽，具有良好的生物相容性，由于含有豐富的羥基和羧基，具有高度的親水性，價格低廉，比較容易衍生化，是一種理想的蛋白吸附介質(zhì)的骨架材料。但有關(guān)海藻酸糖的研究主要集中在緩釋給藥系統(tǒng)、環(huán)境保護及負載催化劑等方面。利用其本身具有的羧基，通過交聯(lián)制備具有良好蛋白吸附能力的大孔凝膠球的技術(shù)未見報道。
(三).

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法。該方法操作簡便，制得的大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球?qū)εＱ灏椎鞍拙哂辛己玫奈侥芰?。本發(fā)明所述大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法，步驟是第一步將重量比為1 1-1 8的海藻酸鈉和硫酸鈉的混和物溶于去離子水中， 并使海藻酸鈉的濃度以g/mL計為-4% ；第二步將上述溶液通過直徑0. 1-1.0毫米的針孔滴加入濃度以g/mL計為 0. 5% -10%的氯化鈣溶液中，其中氯化鈣的總重量大于海藻酸鈉和硫酸鈉混合物總重量的 3倍；同時攪動氯化鈣溶液，待滴加完成后，繼續(xù)攪動0. 5-36小時，得海藻酸鈉凝膠球；第三步將第二步制得的海藻酸鈉凝膠球用紗布濾出，并用乙醇洗凈；第四步將上述洗凈的海藻酸鈉凝膠球于反應(yīng)器中，加入其體積量1-2倍的乙醇或異丙醇，攪拌后再加入其體積量0. 2-2倍的環(huán)氧氯丙烷和以g/mL計5 % -20 %的NaOH，攪拌，升溫至40-110°C，反應(yīng)4- 小時，冷卻至室溫，用紗布濾出交聯(lián)后的海藻酸鈉凝膠球， 再用乙醇洗凈；第五步用0. 05-0. 2M的乙二胺四乙酸鈉(EDTA)溶液或者2-5M的硝酸或者醋酸溶解步驟四方法制得的交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球中的硫酸鈣，再用去離子水洗凈，得大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球。上述大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法中步驟一所述海藻酸鈉和硫酸鈉的混和物中，海藻酸鈉與硫酸鈉的重量比優(yōu)選為1 2-1 6。上述大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法中步驟二所述氯化鈣溶液的濃度以 g/mL計優(yōu)選為2-5%，繼續(xù)攪動的時間優(yōu)選為8-16小時。上述大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法中步驟四所述環(huán)氧氯丙烷的加入量優(yōu)選是海藻酸鈉凝膠球乙醇或異丙醇溶液體積的0. 5-1倍。上述大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法中步驟四所述NaOH的加入量以g/mL 計，優(yōu)選是5-10g/100mL海藻酸鈉凝膠球乙醇或異丙醇溶液。上述大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法中步驟四所述反應(yīng)溫度優(yōu)選是 50-80 "C。上述大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法中步驟五所述乙二胺四乙酸鈉 (EDTA)溶液的濃度優(yōu)選是0. 1-0. 15M ；所述硝酸或者醋酸溶液的濃度優(yōu)選是2-3M。上述大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法中，在優(yōu)選的制備條件下制得的大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球?qū)Φ鞍拙哂辛己玫奈侥芰?，其吸附能力通過對牛血清蛋白的吸附能力進行了表征。該交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球在生物活性物質(zhì)的提取和純化方面具有廣闊的應(yīng)用前
旦
ο
(四).


圖1 實施實例1第三步制得的海藻酸鈉凝膠球的形狀。隨機取20個凝膠球，統(tǒng)計結(jié)果是直徑為2. 25mm ；標準偏差0. 090mm。圖2 實施實例1制得的交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球冷凍干燥后的掃描電鏡照片?？梢钥闯霎a(chǎn)品具有明顯的大的深孔。圖3 實施實例2制得的交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球冷凍干燥后的掃描電鏡照片?？梢钥闯霎a(chǎn)品表面具有大的皺褶，但深孔較少。圖4 實施實例3制得的交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球冷凍干燥后的掃描電鏡照片。可以看出產(chǎn)品表面具有大的皺褶，深孔稀少。
(五).
具體實施例方式實施例1 第一步稱取8g海藻酸鈉和32g硫酸鈉溶于400mL去離子水中。第二步將上述溶液通過0. 5mm的針孔滴加入500ml 5%的氯化鈣溶液中，同時攪動氯化鈣溶液。滴加完成后，攪動8小時。第三步將第二步制得的海藻酸凝膠用紗布濾出，乙醇洗凈。第四步量取50mL上述海藻酸凝膠球于250mL三口燒瓶中，加入50mL環(huán)氧氯丙烷和5gNa0H，攪拌，升溫至60°C，反應(yīng)8小時。冷卻至室溫，用紗布濾出交聯(lián)后的海藻酸凝膠球，乙醇洗凈。第五步將上述制得的交聯(lián)海藻酸凝膠球置于IOOmL 0. IM EDTA溶液中4小時，溶解交聯(lián)海藻酸凝膠球中的硫酸鈣，重復(fù)操作三次。再用去離子水洗凈，得交聯(lián)海藻酸凝膠。1.產(chǎn)品的形貌觀察取制得的交聯(lián)海藻酸凝膠10mL，加入20mL水。冷凍真空干燥后，用奧林巴斯顯微鏡和日立S-4800掃描電鏡觀察其形狀(見圖1)和形貌(見圖2)。2.產(chǎn)品對牛血清白蛋白的吸附量測定將交聯(lián)海藻酸凝膠用200mL 50mM的pH4. O的醋酸-醋酸鈉緩沖液浸泡2小時，傾析出上清液，重復(fù)操作三次。然后稱取多份約1.5g濕交聯(lián)海藻酸凝膠球分別加入不同的 IOmL的離心管中，在每個離心管中加入6mL 3mg/mL BSA (50mM, pH4. O的醋酸-醋酸鈉緩沖液)溶液，置于搖床中，25°C下，搖床轉(zhuǎn)速60轉(zhuǎn)/分，12小時后根據(jù)方程(1)計算交聯(lián)海藻酸凝膠的吸附量。
權(quán)利要求
1.一種大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法，步驟是第一步將重量比為1 1-1 8的海藻酸鈉和硫酸鈉的混和物溶于去離子水中，并使海藻酸鈉的濃度以g/mL計為-4% ；第二步將上述溶液通過直徑0. 1-1.0毫米的針孔滴加入濃度以g/mL計為 0. 5% -10%的氯化鈣溶液中，其中氯化鈣的總重量大于海藻酸鈉和硫酸鈉混合物總重量的 3倍，同時攪動氯化鈣溶液，待滴加完成后，繼續(xù)攪動0. 5-36小時，得海藻酸鈉凝膠球；第三步將第二步制得的海藻酸鈉凝膠球用紗布濾出，并用乙醇洗凈；第四步將上述洗凈的海藻酸鈉凝膠球于反應(yīng)器中，加入其體積量1-2倍的乙醇或異丙醇，攪拌后再加入其體積量0. 2-2倍的環(huán)氧氯丙烷和以g/mL計5% -20%的NaOH，攪拌， 升溫至40-110°C，反應(yīng)4- 小時，冷卻至室溫，用紗布濾出交聯(lián)后的海藻酸鈉凝膠球，再用乙醇洗凈；第五步用0. 05-0. 2M的乙二胺四乙酸鈉溶液或者2-5M的硝酸或者醋酸溶解步驟四方法制得的交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球中的硫酸鈣，再用去離子水洗凈，得大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法，其特征在于步驟一所述海藻酸鈉和硫酸鈉的混和物中，海藻酸鈉與硫酸鈉的重量比為1 2-1 6。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法，其特征在于步驟二所述氯化鈣溶液的濃度以g/mL計為2-5%，繼續(xù)攪動的時間為8-16小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法，其特征在于步驟四所述環(huán)氧氯丙烷的加入量是海藻酸鈉凝膠球乙醇或異丙醇溶液體積的0. 5-1倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法，其特征在于步驟四所述NaOH的加入量以g/mL計，是5_10g/100mL海藻酸鈉凝膠球乙醇或異丙醇溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法，其特征在于步驟四所述反應(yīng)溫度是50-80°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法，其特征在于步驟五所述乙二胺四乙酸鈉溶液的濃度是0. 1-0. 15M ；所述硝酸或者醋酸溶液的濃度是2-3M。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球的制備方法，是將海藻酸鈉和硫酸鈉混合物的水溶液滴加于氯化鈣溶液中，海藻酸鈉形成凝膠球的同時，硫酸鈉形成硫酸鈣沉淀，將海藻酸鈉凝膠球用乙醇洗凈，然后，海藻酸鈉凝膠球和環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)形成交聯(lián)海藻酸鈉凝膠，溶解交聯(lián)海藻酸鈉凝膠中的硫酸鈣，洗凈，制得大孔徑的交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球。此法制的大孔交聯(lián)海藻酸鈉凝膠球具有良好的牛血清白蛋白吸附能力，在生物活性物質(zhì)的提取和純化方面具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C08J3/14GK102226012SQ20111010949
公開日2011年10月26日 申請日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者盧雪梅, 張為燦 申請人:山東大學