專利名稱：川牛膝果聚糖、制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從中藥川牛膝中提取川牛膝果聚糖及其總多糖、制備方法及用途。
本發(fā)明提供了從中藥材川牛膝中提取獲得的果聚糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下 本發(fā)明還提供了所述的川牛膝果聚糖的總多糖，其是由如下方法制備將干燥后的中藥材川牛膝用水浸泡，用或不用有機(jī)溶劑沉淀，沉淀用水溶解，上清液經(jīng)透析或膜分離后，濃縮干燥獲得總多糖。推薦的川牛膝果聚糖的總多糖中含有60～99％的川牛膝果聚糖CoPS，尤其推薦的川牛膝果聚糖的總多糖中含有95％的川牛膝果聚糖CoPS。
本發(fā)明的制備方法是將川牛膝切片用冷水浸泡或熱水煮，采用有機(jī)溶劑沉淀，透析或膜分離，濃縮干燥獲得總多糖。總多糖經(jīng)離子交換柱和凝膠柱層析得到川牛膝果聚糖純品CoPS。
該果聚糖經(jīng)完全酸水解，HPLC分析得知由果糖和葡萄糖組成。由ESI-MS及HPLC測(cè)得其分子量分布為1000～10000Da。其紅外圖譜的數(shù)據(jù)如下3700～3000cm-1的強(qiáng)寬峰為分子間及分子內(nèi)羥基吸收，2950～2870cm-1為C-H鍵伸縮振動(dòng)，1400～1200cm-1為C-H的變角振動(dòng)，1000～1200cm-1為糖環(huán)上C-O-C醚鍵不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，929cm-1為呋喃環(huán)的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，815cm-1為呋喃環(huán)的C-H變角振動(dòng)。
其核磁共振譜圖數(shù)據(jù)如下δ(ppm)1H-NMR5.307為α-Glc(1→。13C-NMR果糖呋喃環(huán)上的化學(xué)位移數(shù)據(jù)δ62.6～63.9、105.8～106.8、78.9～79.8、76.8～77.9或82.9～83.7、64.9～66.0ppm，葡萄糖吡喃環(huán)上的碳的化學(xué)位移數(shù)據(jù)δ95.1、73.8、75.0、71.8、73.7、62.6ppm。(其誤差為±0.5ppm)本發(fā)明的制備方法包括將川牛膝藥材用水浸泡，采用有機(jī)溶劑沉淀，透析或膜分離，濃縮干燥獲得川牛膝總多糖。川牛膝總多糖經(jīng)離子交換柱和凝膠柱層析純化可得川牛膝果聚糖純品CoPS。
具體來(lái)說(shuō)，將干燥后的川牛膝藥材粉碎或切片，用水浸泡，其中川牛膝藥材與水浸泡的重量比推薦是川牛膝∶水＝1∶8～15，尤其推薦用10～12倍重量或更多的水，浸泡36～48小時(shí)。所述水推薦為無(wú)離子水。浸泡液的pH值推薦保持在6.0～8.0。
過(guò)濾，濾液經(jīng)或不經(jīng)濃縮，用有機(jī)溶劑沉淀后離心。離心所得沉淀用水溶解，推薦用1-5倍重量的水溶解。
離心，上清液透析或膜分離，透析時(shí)間推薦為24-72小時(shí)，透析用透析膜、透析袋，其孔徑推薦截留分子量在1000以下，尤其推薦截留分子量為500～1000。
濃縮干燥獲得總多糖，其中干燥或減壓濃縮溫度推薦低于60℃進(jìn)行，最好采用低溫真空濃縮或冷凍干燥，例如在30～60℃干燥或濃縮，壓強(qiáng)推薦控制在0.08～0.10MPa。
所述川牛膝總多糖加水溶解，其中推薦1～5倍重量的水溶解。經(jīng)CM-Sephadex C-50柱層析，純度可達(dá)到95％。再經(jīng)凝膠柱層析作進(jìn)一步純化，用水或稀鹽溶液洗脫，收集糖峰，冷凍干燥獲得川牛膝果聚糖純品CoPS，純度可達(dá)99％。凝膠柱層析所采用的凝膠為Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose型、Bio-Gel P型或Superdex，選用的分離范圍為1×102-5.0×104道爾頓。推薦凝膠用Sephadex G-50，用0.1mol/L NaCl洗脫。
前述的用有機(jī)溶劑沉淀，所述有機(jī)溶劑推薦與水互溶的有機(jī)溶劑，可以是低碳鏈的醇或酮，例如C1～C6的醇或酮等，尤其推薦丙酮，例如用2～6倍體積的75％～95％的丙酮；沉淀時(shí)間推薦為12～36小時(shí)。
本發(fā)明首次從川牛膝中提取川牛膝果聚糖CoPS。本發(fā)明的提取分離方法簡(jiǎn)便，產(chǎn)率高，適于工業(yè)化生產(chǎn)。經(jīng)生物活性試驗(yàn)，研究結(jié)果表明川牛膝果聚糖CoPS具有較好的抑制Lewis肺癌的效果，并具有增強(qiáng)免疫活性的作用。
圖2是川牛膝果聚糖CoPS的CE圖。洗脫液100mmol/LH3BO3-KOH(pH＝10)，電壓12KV，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，分析亦得到單一對(duì)稱峰，表明其具有均一性。
圖3是川牛膝果聚糖CoPS的IR圖。儀器為Bio-Rad公司的FTS185型紅外光譜儀。
圖4是川牛膝果聚糖CoPS的1H-核磁共振(NMR)圖譜。儀器是Bruker-MX-400核磁共振儀。溶劑為重水。
圖5是川牛膝果聚糖CoPS的13C-核磁共振(NMR)圖譜。儀器是Bruker-MX-400核磁共振儀。溶劑為重水。
圖6是川牛膝果聚糖CoPS單糖組成分析的HPLC圖。分析柱為Carbohydrate Analysis，洗脫液乙腈∶水(82∶18)，檢測(cè)器RI。
圖7是川牛膝果聚糖CoPS甲基化產(chǎn)物的氣相(GC)圖譜。儀器是Shimadzu QP5000色質(zhì)聯(lián)用儀。
圖8、9、10、11、12、13、14、15是川牛膝果聚糖CoPS甲基化產(chǎn)物的質(zhì)譜(MS)圖。其中圖8對(duì)應(yīng)于圖7中3.22min的峰，表明有末端葡萄糖；圖9、10分別對(duì)應(yīng)于圖7中3.27min和3.40min的峰，表明有末端果糖；

圖11、13分別對(duì)應(yīng)于圖7中5.41min和5.74min的峰，表明有1，2連接的果糖；圖12對(duì)應(yīng)于圖7中5.63min的峰，表明有2，6連接的果糖；圖14、15分別對(duì)應(yīng)于圖7中8.13min和8.58min的峰，表明有支鏈的果糖。
實(shí)施例2將川牛膝藥材100g洗凈干燥，切片，用1.2升無(wú)離子水室溫浸泡48小時(shí)，過(guò)濾。殘?jiān)?升無(wú)離子水繼續(xù)浸泡12小時(shí)，過(guò)濾，合并濾液，50℃減壓濃縮，然后用3倍體積95％的丙酮沉淀，沉淀靜置24小時(shí)。離心，沉淀用100毫升水溶解，離心，無(wú)離子水透析72小時(shí)。50℃減壓濃縮后冷凍干燥，即獲得川牛膝總多糖13～15g。
實(shí)施例3將川牛膝藥材100g洗凈干燥，切片，用0.8升無(wú)離子水室溫浸泡48小時(shí)，過(guò)濾。殘?jiān)?.5升無(wú)離子水繼續(xù)浸泡12小時(shí)，過(guò)濾，合并濾液，50℃減壓濃縮，無(wú)離子水透析72小時(shí)，離心。50℃減壓濃縮后冷凍干燥，即獲得川牛膝總多糖15～17g。
實(shí)施例4將川牛膝藥材100g洗凈干燥，粉碎，用1.5升無(wú)離子水沸水煮6小時(shí)，過(guò)濾。殘?jiān)?升無(wú)離子水繼續(xù)煮6小時(shí)，過(guò)濾，合并濾液，50℃減壓濃縮，然后用2倍體積95％的丙酮沉淀，沉淀靜置24小時(shí)。離心，沉淀用100毫升水溶解，離心，無(wú)離子水透析72小時(shí)。50℃減壓濃縮后冷凍干燥，即獲得川牛膝總多糖13～15g。
實(shí)施例5川牛膝總多糖經(jīng)CM-Sephadex C-50柱層析精制，純度為95％，再經(jīng)Sephadex G-50柱層析，即獲得純度為99％的川牛膝果聚糖CoPS。具體的分離方法稱取川牛膝總多糖100mg，溶于2～3mL蒸餾水中，離心(4500r/min，10min)。取上清液上玻璃柱(1.5cm×120cm)，用0.1M NaCl洗脫，流速為0.5mL/min，每管收集3～5mL并檢測(cè)糖峰。收集后脫鹽，冷凍干燥，即獲得純果聚糖CoPS 80～90mg。
實(shí)施例6川牛膝果聚糖CoPS的元素分析將川牛膝果聚糖CoPS在110℃干燥5小時(shí)后，進(jìn)行碳、氫、氮元素分析。元素分析儀為CARIO-ERBA元素自動(dòng)分析儀。結(jié)果如下碳百分含量41.36％(±0.8％)氫百分含量6.63％(±0.3％)不含氮元素。
實(shí)施例7川牛膝果聚糖CoPS的生物活性研究我們對(duì)不同劑量的川牛膝果聚糖CoPS送檢生物活性測(cè)定，其結(jié)果如下1.川牛膝果聚糖CoPS對(duì)小鼠Lewis肺癌足趾接種的療效試驗(yàn)之一樣品劑量給藥動(dòng)物數(shù) 動(dòng)物體重 瘤重 抑制率mg/kg方案始/終始/終 X±SD ％CoPS200 ip×10qd 8/8 20.4/24.1 0.488±0.04 49.17**對(duì)照組 NSip×10qd 16/16 20.4/24.3 0.960±0.15/**表示試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比p＜0.012.川牛膝果聚糖CoPS對(duì)小鼠Lewis肺癌足趾接種的療效試驗(yàn)之二樣品劑量給藥 動(dòng)物數(shù) 動(dòng)物體重瘤重抑制率
mg/kg 方案 始/終 始/終 X±SD ％CoPS 100ip×10qd8/8 20.9/25.1 0.620±0.04 40.95**對(duì)照組 NS ip×10qd16/16 21.0/25.5 1.05±0.16 /**表示試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比p＜0.0權(quán)利要求
1.一種川牛膝果聚糖CoPS，其特征結(jié)構(gòu)如下
2.如權(quán)利要求1所述的川牛膝果聚糖，其特征是分子量范圍為1000～10000。
3.如權(quán)利要求1所述的川牛膝果聚糖的總多糖，其特征是由如下方法制備將干燥后的中藥材川牛膝用水浸泡，用或不用有機(jī)溶劑沉淀，沉淀用水溶解，上清液經(jīng)透析或膜分離后，濃縮干燥獲得總多糖。
4.如權(quán)利要求3所述的川牛膝果聚糖的總多糖，其特征是含有60～99％的川牛膝果聚糖CoPS。
5.如權(quán)利要求1或3所述的川牛膝果聚糖及其總多糖的生產(chǎn)方法，其特征是包括將干燥后的中藥材川牛膝用水浸泡，用或不用有機(jī)溶劑沉淀，沉淀用水溶解，上清液經(jīng)透析或膜分離后，濃縮干燥獲得總多糖。
6.如權(quán)利要5所述的川牛膝果聚糖的生產(chǎn)方法，其特征是川牛膝總多糖加水溶解后，柱層析純化可得川牛膝果聚糖純品CoPS。
7.如權(quán)利要求5所述的川牛膝果聚糖的生產(chǎn)方法，其特征是藥材川牛膝與水浸泡的重量比川牛膝∶水＝1∶5～15，水浸泡時(shí)間24～48小時(shí)，浸泡液的pH＝6～8。
8.如權(quán)利要求5所述的川牛膝果聚糖的生產(chǎn)方法，其特征是所述的有機(jī)溶劑是與水互溶的有機(jī)溶劑。
9.如權(quán)利要求5所述的川牛膝果聚糖的生產(chǎn)方法，其特征是所述的凝膠柱層析所采用的凝膠為Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose型、Bio-Gel P型或Superdex，選用的分離范圍為1×102-5.0×104道爾頓。
10.如權(quán)利要求1或3所述的川牛膝果聚糖及其總多糖的用途，其特征在于所述的川牛膝果聚糖用于制備具有抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能的藥物或保健品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從中藥材川牛膝中提取的果聚糖的生產(chǎn)方法和用途。本發(fā)明采用水浸泡獲得川牛膝水提液，用有機(jī)溶劑沉淀、沉淀用水溶解，上清液經(jīng)透析或膜分離，濃縮干燥獲得總多糖，川牛膝總多糖經(jīng)柱層析純化獲得川牛膝果聚糖CoPS，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為上式本發(fā)明方法工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高，適于工業(yè)化生產(chǎn)。經(jīng)生物活性試驗(yàn)表明，該果聚糖無(wú)毒副作用，可用于制備具有抗腫瘤及增強(qiáng)免疫功能的作用的藥品和保健品。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1434058SQ03115429
公開(kāi)日2003年8月6日 申請(qǐng)日期2003年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月14日
發(fā)明者田庚元, 陳曉明 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所