專利名稱：含雙鏈rna的局部活性組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到可局部應用的藥物組合物，其含有失配的雙鏈核糖核酸(dsRNA)和因與表面活性劑結合成三元復合物而穩(wěn)定的失配dsRNA的生物活性片斷。本組合物具有層穩(wěn)定性及具有抗病毒局部活性并可作其它藥用。
非離子表面活性劑(表面活性劑)已證明有殺精子活性，并且是各種柜臺上(非處方)避孕乳膏和泡沫劑中的活性成份。在高濃度時。表面活性劑對細胞表現(xiàn)有明顯的毒性作用，這限制了它們的潛在應用;但這些濃度對于有效地抗皰疹病毒是必要的，因為它們可造成這種病毒膜的破裂。已有報道，表面活性劑可滅活一些種類的人體免疫缺陷病毒(HIV)，至少在體外是如此。
另一類在體內抗病毒，癌癥和炎癥細胞的活性大分子是相對無毒的dsRNA，它們在體溫(37℃)生物性質是不穩(wěn)定的，這限制了對它們的應用及掌握。例如，在液態(tài)，一些dsRNA一定要在4℃小心貯存從而防止它們的分子破裂。由于這些原因，dsRNA服用時，要注射進病人的血流中。本發(fā)明人現(xiàn)通過在生理可用載體中將表面活性劑和dsRNA混合起來可產生許多出乎意料的性質。這些特性包括(a)dsRNA抗受溫度影響的酶破裂的穩(wěn)定性，(b)協(xié)同生物活性，結合物與每一單一化合物比較確實拓展了抗微生物譜，(c)由于橫跨膜穿過在帶負電荷dsRNA核心分子周圍形成的三元或四元復合物容易，使局部細胞吸收更易，從而導致細胞內生物活性物質濃度更高。最重要的是，結合物對HIV及一些其它性交傳染的疾病(包括皰疹病毒家族成員)顯示出高度專一生物活性。因此，本發(fā)明人引出了一系列新的三元復合物(雙鏈互補失配的RNA加表面活性劑，它在dsRNA周圍形成分子團)，它們具有新的生物物理和生物學性質。單獨復合物，或帶有輔助淋巴因子和/或逆向轉錄酶抑制劑的產物在所有各種病原體入口產生了更高的宿主保護能力。本發(fā)明的這些和其它性質在下面做更詳細介紹。使用的表面活性劑可是天然陰離子，陽離子或非離子表面活性劑。一般來說，在局部應用中的這些制劑的有效性應歸屬于它們溶解各種含脂質膜的能力，因此可根據(jù)它們的這種能力來作殺精子劑及用來溶解皰疹病毒-1和-2的病毒粒子結構，見Asculai等人的美國專利，號4，507，281，這里引用的專利用作參考。
更具體來講，已發(fā)現(xiàn)在陰道避孕藥中非離子表面活性劑已大量用作殺精子劑，一種具體叫壬苯聚醇-9的非離子表面活性劑已廣泛用于避孕乳膏和泡沫劑中?？墒?，在應用這些表面活性劑時必須小心，因為它們對正常細胞能造成毒性(Asculai等人，《AntimicrobialAgentsandChemo.》，13卷，686頁，1978)。Rapp等人觀察到人體α干擾素(一種蛋白質)與壬苯聚醇-9的協(xié)同作用，即專一抑制HS-2型(Rapp等人，《AntimicrobialAgentsandChemo.》，28卷，449頁，1985)。Hicks等人(Lancet，2卷，十二月，21/28，1442頁，1985)還談到用壬苯聚醇-9的濃縮物(單獨使用)在體外對HTLV-Ⅲ(HIV，形成的HIV病毒)的滅活，壬苯聚醇-9濃度為0.05%或更高。Hicks還觀察到，當壬苯聚醇-9濃度高于1%時，對正常淋巴因子的毒性作用。應注意到由于壬苯聚醇-9在商業(yè)上可用殺精子濃度范圍是1%-5%(Voeller，Lancet，1卷，1153頁，1986，5，17)，則當壬苯聚醇-9進攻游離的HIV的淋巴細胞中的HIV時，它也可損害正常的生殖泌尿細胞。愛滋病疫苗可望在未來幾年中有所進展(見Fauei，Proe.Natl.Acad.Sci.USA，83卷，9278頁，1986)，控制傳播的各種步驟應迅速實施。Fauci指出“如果志愿者證明是安全和有效的主要的問題集中在誰來試驗這種疫苗，即使在男性同性戀者中，這項研究也是困難的”。這強調了拓展重要性，即馬上采取一些局部有效的步驟以減少在性接觸中病毒和其它微生物傳染的風險，從而防止它們進一步傳播給大眾。例如，F(xiàn)auci估計單在美國這種潛在的帶菌者有150，000人(HIV)。
治療病毒疾病的局部應用組合物見專利文獻。治療皰疹單一傳染病的組合物含有人體干擾素，抗病毒非離子表面活性劑(壬苯氧基聚乙氧乙醇)和載體，見Asculai等人的美國專利4，507，281。誘導干擾素的多聚核苷酸，如dsRNA多核肌苷酸多聚核糖胞苷酸(polyribocytidylicacid)，或多聚I.C，在Field等人的美國專利4，283，393中有介紹，其中干擾素誘導物(多聚I.C)與水溶性聚合物均一混合以治療對干擾素治療敏感的、由病毒感染的皮膚，眼睛和粘膜組織。Levy在美國專利4，024，241中談到抗核酸酶的polyI.C的親水復合物，它與多聚-1-賴氨酸和羥甲基纖維素復合。多聚I.C簡單的混合物可制成水溶液，軟膏，乳膏或液體制劑，見Lampson等人的美國專利4，124，702。
多聚I.C的毒性在文獻中有報道(Adamson，Nataoe，卷223，1969，8，16)，由于這個原因，多聚I.C的治療用途已很大程度上擯棄了。相反，用于本發(fā)明藥物組合物的失配dsRNA毒性相對是低的或是沒有的。本發(fā)明在這里進一步談到失配dsRNA的降解產物(碎片)，由于它可長期貯存，故它能長期保留生物活性并在一些條件下比母化合物更有活性。
綜上所述，應注意到存在的HIV病毒至少有兩種不同的命名;LAV是由法國巴黎的巴斯德研究所分離出的HIV病毒，HILV-Ⅲ是由美國MarylandBetheda的國家衛(wèi)生研究所分離出的HIV病毒。在本文中，時常提到的病毒通指或特指HIV或HILV-Ⅲ或LAV(無意區(qū)別它們)。進一步來講。本發(fā)明說明書和權項中的術語“HIV”包括所有其它病毒，這些病毒可對人產生HIV傳染病，病人包括血清陽性無癥狀的帶菌者，帶有綜合癥的愛滋病患者，ARC和患免疫缺陷疾病綜合癥患者和愛滋病患者，它們已從人群中隔離和沒隔離。
在1987，3，11公布的歐洲專利0，213，921中，專利標題為“用雙鏈RNA治療病毒感染疾病，該發(fā)明談到專門用Ampligen作原型dsRNA來抑制在人體細胞培養(yǎng)中的HIV。
陽離子表面活性劑是更好的表面活性劑;但非離子和陰離子表面活性劑也可使用。適宜的陰離子表面活性劑包括烷基硫酸鈉和烷苯基硫酸鈉。適宜的陽離子表面活性劑包括季銨洗滌劑，如十六烷基吡啶翁氯化物和苯并烷氧翁氯化物(benzoalkoniumchlorides)。與陽離子和陰離子表面活性劑相反，非離子表面活性劑不含離子基團并不帶分子電荷;它們通?？克鼈兊恼麄€分子顯示表面活性。
然而，幾乎所有疏水化合物在結構上都有帶游離氫的羧基，羥基、酰胺和氨基，游離氫連在氮上，該疏水化合物與環(huán)氧乙烷反應形成非離子洗滌劑。在本發(fā)明中，介紹了失配dsRNA與表面活化劑復合的新的三元復合物;dsRNA也有疏水性，它導致兩條互補鏈中的核苷酸堿基形成緊密的雙螺旋結構。在本發(fā)明中，能形成三元復合物，即RNA鏈“1”加互補RNA鏈“2”加表面活性劑生成三元(或三員)復合物，它具有完全新的生物物理和有治療作用的主要生物性質。


圖1表示單獨的失配dsRNA，兩個RNA鏈的二元復合物表示在dsRNA體表面上帶有整個負電荷。
圖2表示本發(fā)明的失配dsRNA三元復合物(兩條互補的但失配的RNA鏈由陽離子表面活性劑包圍)，帶有帶正電的陽離子表面活性劑顆粒朝著帶負電的dsRNA表面，表面沒極性的殘基朝著遠離dsRNA體一邊。
表面活性劑的相對濃度(此例中為陽離子)將控制生成的復合物相對極性，極性可根據(jù)不同的治療用途變化。通過提供過量的表面活性劑，一旦三元復合物形成，則復合物的沉淀也就形成了，并能達到作局部應用的理想性質。
本發(fā)明關鍵之一是在dsRNA或周圍形成分子團(與中性，陽離子，陰離子表面活性劑)以便強化新的治療特性一也就是高(局部的)生物活性。分子團定義為將帶有雙官能度分子加到另外的水溶性(水相容)底物(如dsRNA)中形成的結構。本發(fā)明中的雙官能度是指分子一端是極性的(如，與水互溶的是極性的)，另一端是非極性的(如，更親和脂質的一象細胞膜的基本組分)。生成理想的三元復合物(即生成分子團)是指復合物具有兩個以上優(yōu)點從而有更好的治療活性，這些優(yōu)點幫助復合物更快地通過靶細胞的細胞膜(癌細胞，病毒感染細胞，免疫細胞等)。
性質1使橫跨膜轉移容易的關鍵特性是要使三元復合物(分子團)達到理想的表面負荷(與沒復合的(二元的)dsRNA比較)并提高疏水性，這將使到達細胞膜并與細胞膜有效的融合容易并促進吸收。
性質2下面介紹的三元復合物的具體性質(包括，但不限于分子團復合物)將使細胞吸收更容易，它是通過細胞吞實噬作用附加的性質使分子團形成最大程度產生。吞噬作用這里是指細胞的外突(術語叫胞飲空泡等)自然地吞食dsRNA的三元(或四元)復合物顆粒。由此促進它們轉移到內細胞(相對外細胞)腔隙的過程，它是在人體上產生最大生物活性的必要步驟。吞噬作用過程也可存在于生物破裂的dsRNA，如，失配的dsRNA。
表面活性劑的克分子份數(shù)(相對濃度)將控制生成的復合物相對極性，復合物極性可根據(jù)不同治療用途改變。通過加過量表面活性劑，一旦三元復合物形成，復合物的沉淀就生成，并能達到用于局部用途的理想性質。
描述本發(fā)明應用的具體例子是陽離子表面活性劑如十六烷基三甲基溴化銨(縮寫為CTAB)與dsRNA之間形成的三元復合物。由于它的極性殘基的基本性質，它將以這樣的方式朝向dsRNA，該方式指dsRNA在帶正電荷洗滌劑(帶有酸基)周圍提供負電荷(見圖表)。任何堿性(陽離子)洗滌劑可替代CTAB并生成分子團，它比將dsRNA放在簡單脂質結構(如脂質體)中更穩(wěn)定，生物活性更高，因為在這種簡單脂質結構中ds RNA是由很弱的疏水鍵連接在一起的。由于這種結果，在調節(jié)分子團時，洗滌劑極性應使ds RNA表面的負電荷盡量減少，這樣大量無極性三元復合物通過細胞膜將會容易。分子團聶入的其它特性可通過提供對靶細胞的附加特性來實現(xiàn)，如形成四元復合物，其中第四個成份提供專一向性或對一些細胞種類有吸引，例如，通過結合HIV蛋白質，gp120，將生成的復合物射向T4淋巴細胞，如果初始目標要處理或預防逆病毒的話。
以三元復合物，尤其以分子團為代表的dsRNA不僅穩(wěn)定，而且保護了對熱不穩(wěn)定的dsRNA，如上解釋，它促進了dsRNA吸收并增強了失配dsRNA的作用。提供的分子團結構改善了藥物與細胞表面的連接。分子團上凈表面電荷對大多數(shù)細胞更具吸引力并/或更相溶。相反“裸露的”失配dsRNA有高的負電荷并自然受細胞排斥。dsRNA三元復合物分子團通過電荷吸引為細胞所接納。第二，分子團結構使dsRNA形成微粒復合物，接著提供了如上面詳細解釋的吞噬作用的機制。無論載體/三元復合物什么時侯形成，都不可避免地形成失配dsRNA的獨特生物活性片斷，并且這些生物活性片段是理想的。這原因是這一核糖核苷酸酶，這些片段為什么形成的化學原因是廣泛處在的，并且無論復合物形成什么，片段都或多或少地形成。形成具有這些生物活性片段的分子團的能力提供了擴大本發(fā)明用途的一個關鍵實施方案。
當藥物制劑(乳膏，洗劑等)放在藥房架上等著調配時，不可避免地有生物物理性質的變化。貯存可在-4℃，7℃或室溫(通常為20℃)。
拋開負電特征，這些變化已在本發(fā)明前存在，即在更好的實施方案中，產物由失配的dsRNA核開始，目標是由起始物生成三元或四元復合物。具體來講，這意味著大分子RNA不可避免的衰變將放出生物活性殘基，分子量低的物質，它們與表面活性劑復合生成與類似理想的藥物性質有輕微不同的分子團復合物。
整個過程中，該產物不斷表示有生物治療活性，即使RNA核的數(shù)目繼續(xù)減少，因為當RNA核被消化時，dsRNA母體的生物活性碎片將不斷增加。因此，生物效果在整個時間持續(xù)或略微增加，因為dsRNA的強生物活性碎片不斷釋放。因此，這里用的“穩(wěn)定”意指產品在整個過程中保留治療活性。
本發(fā)明應用的非離子表面活性劑可至少歸納為三類(1)醚連接的(如分子的親水和疏水部之間)如聚氧乙烯乙醇，脂肪酸的聚氧乙烯酯，聚氧乙烯烷基苯酚或硫醇或烷基胺;(2)由酯或醚-酯連接的;(3)由酰胺連接的。離子洗滌劑也可使用，見本發(fā)明在其它應用中的介紹，尤其在形成新的分子團中，它可導致快速產生細胞內dsRNA和其生物活性片段的高濃度。醚和酰胺連接的表面活性劑在本發(fā)明中是更好的實施例，例子有壬苯聚醇-9;曲通-100(對-二異丁基苯氧基聚乙氧乙醇);聚氧乙烯油醚(也稱Brij97);Onyx-OL(也稱Onyx-OL345)。在發(fā)明的下面描述中，使用的表面活性劑量在0.01%-20%，雖然更好的范圍是在12%(重量)以下，最終組成隨相關失配dsRNA的含量、治療對象和特定的給藥方式而變化(如，在某種程度上衣原體比HSV-2更能夠抗三元復合物)。失配的dsRNA含量范圍最好占組合物重量的0.01%至10%或更多依賴具體組成(例，dsRNA溶解度在懸浮液不是限制因素)和產物打算處理的條件。當使用dsRNA碎片時，濃度上限可仍高，因為任何溶解度限制已解除了。無論組合物中dsRNA對表面活性劑的相對量是多少，藥物組合物的平衡通常可簡單由惰性，生理相容，藥物可用的載體組成。
本發(fā)明現(xiàn)從歷史角度介紹一下本領域(卡特等人，J.Biol.Resp.Modifiers，4卷，P495-613，這里用作參考)。dsRNA在臨床上作為潛在抗癌的抗病毒藥過去被大大忽略了，這是因為首次臨床試驗dsRNA-多聚肌苷酸多聚胞苷酸(多聚I.C或rIn·rCn)產生了更多臨床毒性和缺乏效果所致。然而，本發(fā)明前面談到的失配dsRNA雙螺線很少造成導致惡病質的腫瘤壞死因子(TNF)(一種高毒性淋巴因子(蛋白質)的誘導。從而提高了治療活性也降低了毒性。dsRNA確實比干擾素抗各種腫瘤和各種病毒(包括HIV)更有活性(卡特等人，Lancet，1987，6，6，這里用作參考)。然而，藥物“組成”和失配dsRNA的貯存，即具有最佳治療效果的dsRNA形式與它體內作用時間已表明是一麻煩的問題，而本發(fā)明克服了這一障礙。數(shù)據(jù)表明，一旦失配dsRNA置于水溶液中，它就一定要在4小時內注射進患者或動物中，否則就失效。這種“失效快速用途”步驟是肯定的，因為在4℃左右的藥物不斷地進行降解，部分是由于各種核糖核酸酶的廣泛存在，如，使dsRNA降解為失配dsRNA的酶尤其敏感。這些酶本身是到處存在的，在玻璃皿的無菌水里，可檢測手上的汗中就存在這種酶。按照本發(fā)明介紹的操作法可以將失配的dsRNA產物冷凍干燥(真空冷凍干燥)成粉末加以安全地保護。
本發(fā)明在室溫通過形成具有高穩(wěn)定性的新型三元復合物已有效地克服了長期貯存障礙。失配的dsRNA對核苷酸酶的進攻是脆弱的，但周圍通過與表面活性劑復合(形成三元復合物，使dsRNA的降解產物保留了活性，并且通常比母化合物活性更高，見下面介紹。
在本發(fā)明人最近公布的另一篇文章中(Brodsky，卡特等人，J.Biol.Res.Mod，4卷，P669，1985);尤其見P673圖1，本發(fā)明人注意到(a)核糖核酸酶抑制劑可加到管中，在管中，失配的ds RNA處于易變的/不穩(wěn)定狀態(tài)，(b)體內ds RNA穩(wěn)定性是非常短暫的，它是由分鐘計算的，即注射的ds RNA T1/2(半衰期)(例，r In·r(C U)n也稱為Ampligen ，HEM研究用的商標公司)，人體血清中的T1/2估計為20分鐘±15分鐘。不同人的水解酶含量是不同的，這在前面關于這問題的研究中已提到本發(fā)明對群體(大約115個人)dsRNA代謝的時間研究表明他們都有快速降解dsRNA的足夠酶水平(內或外核苷酸酶)。
本發(fā)明是局部應用的藥物的化合物，用于治療對用失配dsRNA治療敏感的疾病，如病毒傳染病，皮癌等，其中dsRNA以生物活性形式局部應用。在雙鏈RNA的三元復合物中，失配的dsRNA表現(xiàn)正常的熱變性，這里定義的失配dsRNA與陰離子，非離子或陽離子表面活性劑或洗滌劑復合。通常活性成份與表面活性劑形成分子團，也可以母化合物(失配的dsRNA)或母化合物的生物活性碎片存在。
用本發(fā)明局部使用組合物治療的疾病包括那些對失配dsRNA治療敏感的和那些以失配dsRNA為唯一給藥途徑的疾病。這些疾病包括，但不限于(1)人體逆病毒傳染病(包括HIV)，(2)皰疹病毒家族，如單一皰疹和大葉藻皰疹;(3)巨細胞病毒或CMV(有時分類為皰疹病毒)，(4)局部皮癌并且不帶病毒病因體，(5)敏感的，由性接觸傳播的病毒疾病和性傳染病，包括衣原體(上列許多疾病是性接觸傳染的)，(6)性傳染病，其中正選病毒藥對于另一種性病治療是首選或次選的，而該性病本身對用失配dsRNA治療是不敏感的或不能控制的，那么該性病可用另一治療方式治療(如并發(fā)淋病患者用四環(huán)素治療)。
本發(fā)明組合物包括藥物制劑，如液體溶液如，等滲眼藥水，等滲滴鼻劑，噴霧劑，洗劑，乳膏，泡沫劑，膠丸和粘液劑，粘液劑包括對生殖泌尿系統(tǒng)有良好耐受的潤滑劑和/或對生殖泌尿系統(tǒng)有良好耐受的殺精子劑;固體和半固體制劑有軟膏，眼用軟膏或乳膏，乳膏，油膏，栓劑(直腸和陰道)，棒狀劑如用于治療單一皰疹疾病的唇膏，眼插入物(eyeinsrts)。
“失配dsRNA是指那些失配dsRNA雙鏈之間的氫鍵(堿基層)是相對無損傷的，即，在29個連續(xù)堿基平均斷裂少于1個。失配是指由于鏈的內陷(或外突)使RNA雙螺旋的正常幾何結構打斷，鏈內陷(或外突)表示核糖核酸酶的消化造成的dsRNA易斷點。由此可理解術語“失配dsRNA”。
ds RNA可是多聚肌苷酸與多聚胞苷酸復合物，該復合物含尿嘧啶堿基或胍堿基的比例為由1∶5到1∶30(多聚I.多聚(C4-29X＞U或G)。
ds RNA的通式為r In.(C12U)n。其它ds RNA的適宜例子見下面。
在較好的失配ds RNA中，r In·(C12′U)n′，一個區(qū)域含6至12堿基對的連續(xù)鏈，也就是該鏈為整個RNA螺旋鏈的一半。這即可以生物觸發(fā)淋巴因子的釋放，也可促使細胞內輔助因子生成含天然抗病毒的酶。含尿嘧啶基的失配區(qū)域定期加入到多聚嘧啶鏈中以加速ds RNA水解，從而防止了毒性。
用于本發(fā)明較好的失配ds RNA產生于選自多聚(Cn′G)的(其中n 4到29的整數(shù))的其聚核苷酸，它是多聚核糖核酸與多聚核糖胞苷酸形成復合物的失配類似物，它是通過修飾r In·r Cn，沿多聚核糖胞苷酸鏈加進不配對堿基(尿嘧啶和胍)形成的。另外，ds RNA也可以從多聚(I)，多聚(C)ds RNA中衍生得到，它是通過修飾多聚核糖核酸(r In)的核糖基骨架形成的，例，2′-氧-甲基核糖基。在這些r In·r Cn的失配類似物中，較好一類是通式為r In·r(C11-14U)n和r In·r(C29′G)n，見Carfer和Ts′o的美國專利4，130，641和4，024，222，這里用作參考。因此，根據(jù)本發(fā)明，通常提到的ds RNA都適合于使用。
用于本發(fā)明的失配dsRNA的例子還有poly(I)·poly(C4，U)
poly(I)·poly(C7，U)poly(I)·poly(C13，U)poly(I)·poly(C22，U)poly(I)·poly(C20，G)poly(I)·poly(C29，G)和poly(I)·poly(Cp)23G＞p本發(fā)明可通過向三元復合物中加進另一種淋巴細胞活素來實施-這一添加物的目的在于進一步調節(jié)可與局部使用雙鏈RNA反應的細胞數(shù)目及其特性。例如，向三元復合物中加入白細胞介素將帶來T-淋巴細胞的進一步吸收，如圖與雙鏈RNA產生協(xié)同治療作用。附加用途的類似原理可來自與其它淋巴細胞活素的結合，如干擾素和腫瘤壞死因子等，但不僅限于此。這些淋巴細胞活素在局部癌癥和某些病毒傳染病治療上可能具有特殊用途。在某些情況下，也可以加進偶氮二胸苷或gangclovir等特定的病毒抑制劑。
為了證實產生的四元絡合物的潛力，本發(fā)明人制備了含有5，000-20，000單位IL-2和10毫克雙鏈RNAD藥用洗液(在本文中稱作A)。將該洗液的濃縮部分立即施用到(無毛)小鼠的已被人黑素瘤(皮膚癌)細胞感染的區(qū)域上。未處理的如皮下注射的腫瘤細胞生長，其結果是實際上該動物被腫瘤塊損害表面。但是，接受了IL-2/dsRNA/表面活性劑洗液的動物比它們的未處理對應物顯示出迅速的腫瘤消退和旺盛生長。
通過使用能夠測定具體的免疫活性相關細胞數(shù)的流動血細胞計數(shù)技術，分析免疫細胞的脾下繁殖，本發(fā)明人也能夠證明此復合物團的增效作用。與未處理的相比，其增長是NK(自然殺傷)細胞一單獨使用dsRNA時的63%對與白細胞介素-2結合使用時的87%[用于流動血細胞計數(shù)器的抗體標記物是ASGMI];LAK(淋巴因子活性殺傷劑)細胞一單獨使用dsRNA時為228%與白細胞介素-2結合使用時為412%(用于流動血細胞計算器的抗體標記物是Thy1，2)T淋巴細胞一單獨使用dsRNA時無明顯增長，而與白細胞介素-2結合使用時為263%[用于流動血細胞計數(shù)的抗體標記物是L3T4]。作為陰性對照，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)沒有一種局部使用的洗液能影響在脾中測得的T8(抑制)淋巴細胞的數(shù)目。
如此所述，淋巴細胞活素包括干擾素(最好是α-干擾素)、白細胞介素[尤其是白細胞介素-2(IL-2)和重組白細胞介素-2(rIL-2)]和腫瘤壞死因子(TNF)。還包括淋巴細胞活素活化的殺傷(LAK)細胞，它是對淋巴細胞活素的暴露應答而于動物內產生的。在配制過程中除淋巴細胞活素外可能包括逆轉錄酶抑制劑，如3′-3′-脫氧胸苷(AZT)，或以其代替淋巴細胞活素。
當使用干擾素(α)作為淋巴細胞活素時，其劑量為所用的病人體液量的每毫升0.01至100，000 IRU。當淋巴細胞活素是IL-2(最好是r IL-2)時，服用的劑量范圍從約每千克病人體重102IL-2單位直至接近該病人的毒性不可接受水平值，它可能高達106IL-2單位。但是，最有效的毒性反應劑量范圍是從每千克體重約103至104IL-2。
常服用的dsRNA的量范圍從每毫升病人體液0.1至1，000微克dsRNA。術語體液意指血清，鹽，維生素等溶液，它在抗體中循環(huán)且浸潤組織。當服用兩種試劑(dsRNA和一種淋巴細胞活素和/或逆轉錄酶抑制劑)時，它們通常是作為一種混合物被服用，但可以單獨服用，同時或依次進行。
dsRNA和淋巴細胞活素的“結合”服法包括提供作為治療混合物一起服用的兩種試劑，還包括兩種藥劑單獨但同時服用的步驟?！敖Y合”服法也包括一種藥物的單獨服用，即先給服用其中一種，緊接著再服用另一種。
本發(fā)明人曾觀察到一種預先未測得的生物化學異常，其中，一種與機體抗癌癥和病毒疾病防疫機制相關的關鍵酶(RNaseL)是以一種加速的和明顯的未控制方式起作用。以上這些觀察結果以及其它的觀察結果在本發(fā)明人1987年7月17日遞交的系列申請(序列號為074，649)中已有所述，其題目為“雙鏈RNA對與非控腫瘤細胞和病毒生長周期相關的異常代謝途徑的校正”，其公開在此作為參考文獻使用。在單獨實驗中，本人比較了這兩種不同細胞(帶有異常RnaseL的細胞)低抗病毒攻擊的相對能力。發(fā)現(xiàn)在那些具有異常RNaseL活性(它如此迅速地產生NCP)的細胞中子代逆病毒的滴度(產量)明顯增高。
如上所述，在本發(fā)明人1987年7月17的美國專利申請中已報道，雙鏈RNA(尤其是失配dsRNA)使RNaseL的催化和降解產物恢復到了正常狀態(tài)。而且，被雙鏈RNA所恢復的正常狀態(tài)恢復率可通過預先暴露于淋巴細胞活素而提高。
在下面所述的實驗中，首先從凍干粉末中重建dsRNA，然后與各種表面活性劑(重點是使用非離子表面活性劑)混合。在一些實驗中，尤其是當將產生的復合物應用于表面或生物腔等時，本發(fā)明人使用于惰性載體。將dsRNA/表面活性素復合物過夜保溫，該混合物用標準介質鹽稀釋以用于表1和表2中的一些性質檢測。
這些新的藥用組合物將有很多種局部服用方法。如，可將組合物引入到感染區(qū)域，或還未感染的區(qū)域，但以預防模式引入，微膠囊形式，如使用脂質體或類脂質體。也可以將它們以泡沫、噴霧劑、塞棉陰道或直腸栓劑引入，或在制造過程中直接加到避孕套內或避孕套上。沒有本發(fā)明，后一種方法(避孕套引入)將不可能，本發(fā)明能夠延長失配dsRNA或其生物活性片段在室溫(20℃-23℃)下的穩(wěn)定性和連續(xù)生物活性，且提供可靠的產物貯藏壽命。例如，使用Reddy在美國專利4，415，548號中所述的機械方法插入dsRNA/表面活性素復合物，可以很容易的實施本發(fā)明(該專利敘述的是制備一種經潤滑的殺精子男性避孕藥)。
尤其是，本發(fā)明也克服了某些殺精子劑如普通的壬苯聚醇-9(壬苯氧基聚乙氧乙醇)的某些不利作用，因為本發(fā)明使壬苯聚醇-9的有效濃度減少了。如下詳述(見表2)。用本殺精子劑可證實陰道炎和胚胎壞死及胚毒性[Tryphones等《Toxicology》39卷(2)，1986年5月，177頁]。本發(fā)明人也使用其它殺精子劑進行過類似實驗，這些殺精子劑包括精子精蟲頭粒蛋白的芳基-4-胍基苯甲酸酯(NPGB)抑制劑，在生育過程中具有基本作用的一種酶;這種NPGB分子可依照Kamcnski等[《J.Med.Chem.》(Apr)29卷(4)，514頁1986]所述的方法從FDA證實的苯酚合成。與本發(fā)明相適合的其它殺精子劑包括醋酸洗必太[由Sharman等所述，《Fertil.Steril》45(2).Feb.，P259，1986];孟苯聚醇[見Lamptey等《Contraception》32(5)卷，11月，445頁，1985];潔爾滅[不是壬苯聚醇-9一樣通過鞘壁吸收，如Zufferey所述，見《J.Gynecol.Obster.Biol.Reprod.》(巴黎)14(3)卷，359頁，1985);和最近所述的兩相同壬苯聚醇-9系統(tǒng)，其中潤滑系統(tǒng)含有硅膠、壬苯聚醇-9和殺精子膏[見Rodgers-Meeme等《Fertiliz.Steril.》43(6)卷，6月，931頁，1985]。在后一種情況下，很顯然可以將大約2.0毫克的dsRNA加到0.45±0.1毫升硅膠液(含有6.6%±0.5%表面活性劑)的潤滑系統(tǒng)中，或加到0.45%±0.1%毫升(聚乙烯乙二醇400(大約63%)和聚乙烯乙二醇3350(大約30%))的殺精子膏基質中。以上都是一些簡單的非限定實例，適用于輔助各種避孕模式。
重要的是，本發(fā)明人所述的藥用組合物既具有抗微生物活性，也具有抗病毒活性(如見表2)，在Asculai和Rapp的美國專利4，507，281號中也指出了這一點是可行的(在該申請中他們將干擾素與壬苯聚醇-9結合)，現(xiàn)在的情況是，干擾素(單獨的或與某些表面活性劑混合的)對許多病毒相對無活性，尤其是對人免疫缺陷病毒。至今沒有提出一種象本發(fā)明人所述的那樣新型大分子聚集物，在兩種生物特性中明顯變化及在某些生物物理性中相應變化。在使用低角激光散射(且用studier方式校正到S20W)觀察到表現(xiàn)分子量增加的同時，本發(fā)明人也觀察到在分析超離心時表觀分子量沒有改變，這可能是由于三元復合物的新水化膜的“障礙物”作用抵銷了質量上的明顯增加。
表1和表2顯示了本發(fā)明的典型結果。該結果在新生物物理特性(增加了三元復合物的熱穩(wěn)定性)和新的生物特性(擴大了抗病毒和抗微生物的范圍)方面表現(xiàn)極為明顯。
表1與表面活性劑復合的dsRNA的生物物理如生物化學特性的穩(wěn)定作用組成/濃度時間(37℃)1分子量(est)2專一活性3(在25%的人 (S20W) (2′-5′oligo A血清中)合成)%1.失配dsRNA010.5100(2.5毫克/毫升)1小時6.3906小時2.1＜524小時不可測＜348小時不可測＜372小時不可測＜390小時不可測＜32.失配dsRNA010.5100(2.5毫克/毫升)1小時10.5100加上壬苯氧多乙6小時10.0100氧乙醇(壬苯聚24小時8.390醇-9以1%溶于48小時4.540生理緩沖液)72小時3.02590小時不可測＜3
表1與表面活性劑復合的dsRNA的生物物理如生物化學特性的穩(wěn)定作用組成/濃度時間(37℃)分子量(est)專一活性(在25%的人(SW)(2′-5′oligoA血清中)合成)%3.失配dsRNA010.5100(2.5毫克/毫升)6小時10.095加上聚氧乙烯24小時8.58.8油醚(1%)48小時6.070說明①得自捐獻者的庫存血清是用作內-外溶核酶源;
②2分子量的測定如前所述(Carter等，《J.Mol.Biol.》70卷，567頁，1972);
3.低聚2′-5′A合成酶誘導如前所述是以多聚IC作為對照(100%)在二倍體人成纖維細胞提取物中測得(Cartes等，《J.Biol.Resp.Mod.》，4卷，613頁，1985)。
表2dsRNA/表面活性劑復合物的組成擴大了抗包括病毒在內的病原的范圍組成濃度 HIV滴度1HSV-2滴度2衣原體(原生小體數(shù))1.ds RNA 0 微克 1×1065×10610810 微克 5×1053×10610530 微克 1×1055×10410550 微克 1×1032×10495200 微克 ＜10 8×103802.壬苯聚醇-9 0% 1×1065×1061105% 3×1033×1031101% 3×1034×1051100.05% 2.5×1038×1051080.01% 3×1035×1061103.dsRNA/01×105×10108壬苯聚醇-930微克/5%＜101×102030微克/1%＜102×102530微克/0.05%＜101×104030微克/0.01%＜105×1055
說明1使用Hicks(出處同上)所述的ID檢測。簡單地說就是，在上述形成物存在或缺乏的情況下暴露于正常個體的外周血細胞，然后用一微培養(yǎng)物系統(tǒng)滴定感染HIV;在第21天終止培養(yǎng)，收集上清液，用標準方法測定HIV逆轉錄酶。2HS-2是在甲基纖維素涂布后利用噬菌斑的形成在融合HEL細胞中測得;3，在96孔微滴定平板中通過使用在Mc Coy細胞單層中的計數(shù)檢測原生小體;將含有已知數(shù)目的內含物(形成單位/毫升)的標準化接種物加到每孔中，且與各種形成物一起保溫60分鐘(Kappres等Sexully Transmitted Diseases》13卷，134頁，1986)。
下面是含有非表面活性劑1，2，3和ds RNA的合適組成的典型例子藥膏A純水41.00克晶形蠟3.00克羊毛脂10.00克礦脂41.00克脫水山梨醇含油酸基化合物4.75克多乙氧基醚0.25克dsRNA10-180毫克藥用洗液純水7.00毫升油酸1.50克聚乙烯二醇-硬脂酸10.50克Carbpol-93442.25丙二醇24.75毫升三乙醇胺1.00毫升硅流體10.00毫升dsRNA10-180毫克藥膏B鯨蠟7.5%蠟12.0%礦物油56.0%硼酸鈉0.5%脫水山梨醇含油酸基化合物5.0%水19.0%dsRNA1-200毫克所用表面活性劑的類型如下1，典型的酯或醚-酯膠連接物，如脫水山梨醇(單或三-硬脂酸鹽)、脫水山梨醇含油酸基化合物、倍半油酸鹽、三油酸鹽、聚氧乙烯、脫水山梨醇甘油-月桂酸酯脫水山梨醇甘油-棕櫚酸酯。2，典型醚-酰胺連接霧，如脂肪鏈烷醇酰胺，包括onyx-ol、unamide、單胺和月桂二乙醇胺，如聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、onyx-ol對-二異丁基苯氧-聚乙氧乙醇、壬苯氧基聚乙氧乙醇、聚氧乙烯油醚等。3醚連接物在本文中已述，且包括聚氧乙烯烷基酚、聚氧乙烯醇、脂肪酸的聚氧乙烯、聚氧乙烯硫醇和聚氧乙烯烷基胺等。
本人也評估過多種復雜組合物，包括那些含有淋巴細胞活素或相關介體物的物質，以測定它們對本發(fā)明的適合性。尤其是，例如洗液，本發(fā)明人向局部制劑中加入了干擾素和/或某些2′-5′A核心分子，它包括帶有RpRp、SpRp、和RpSp核苷酸間連接物的三種2，5-硫代磷酸酯三聚體核，本人最近已證實該連接活化與細胞間宿主防疫途徑相關的RNaseL。具有合適載體的某些產物(如單層脂質體、單克隆抗體、重組病毒被膜等)也可細胞內引入，以提供一種輔助的抗病毒、免疫和抗癌癥特性。
權利要求
1.局部應用的藥物組合物用于治療對用失配的dsRNA治療敏感的疾病，組合物含在藥物可用局部載體中，有效量的失配dsRNA存在失配雙鏈dsRNA與表面劑形成的三元絡合物中。
2.權項1的局部應用藥物組合物，其中三元復合物是分子團，分子團中的失配ds RNA由表面活性劑環(huán)繞。
3.具有殺精子和抗病毒活性的局部藥物組合物含有殺精子有效量的殺精子劑，在藥物可用載體中，失配ds RNA占組合物的0.001%至10%(重量)。
4.權項3的殺精子和抗病毒活性局部藥物組合物，還包括對人體生殖泌尿系統(tǒng)無刺激的潤滑劑。
5.用權項3或4藥物組合物包衣的避孕套。
6.治療對失配ds RNA給藥敏感的皮膚，眼和粘膜組織病毒傳染病的方法，其特征是，將含治療有效量的失配ds RNA的穩(wěn)定藥物組合物局部用于病毒感染的皮膚，眼和粘膜組織，其中失配ds RNA的形式為雙鍵RNA與表面活性劑形成的三元復合物。
7.權項1的組合物，其中ds RNA量為占整個組合物的0.001%至10%(重量)，表面活性劑量為占整個組合物的0.005%至20%(重量)。
8.權項1組合物，其中失配ds RNA是多聚核糖核酸與多聚胞苷酸的復合物，此復合物含尿嘧啶堿基或胍堿基的比例為1∶5～1∶30。
9.權項1組合物，其ds RNA含鍵斷裂區(qū)域，并且這種ds RNA展現(xiàn)出良好治療效果，如r In·r(C11-14)Un。
10.權項1組合物，其中ds RNA是r In·r(C11-14U)n。
全文摘要
局部應用藥物組合物中的用表面活性劑穩(wěn)定的dsRNA三元復化物，也可包括淋巴因子和/或逆轉錄酶抑制劑，局部應用于感染的或裸露區(qū)的治療或預防病毒傳染病，如皰疹病毒和其它傳染病，尤其是性傳染疾病。雙鏈互補的RNA加適宜的穩(wěn)定的表面活性劑形成三元復合物可抗溫度造成的酶滅活。
文檔編號C07H21/02GK1031325SQ8810495
公開日1989年3月1日 申請日期1988年8月12日 優(yōu)先權日1987年8月12日
發(fā)明者威廉姆·阿·卡特 申請人:Hem研究公司