Dl-告依春中表告依春與告依春的分離方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種DL-告依春中表告依春與告依春的分離方法，該方法是先將DL-告依春制成溶液，再以超臨界流體色譜法進(jìn)行分離；該方法簡便、快捷，分離得到的表告依春和告依春單體純度高。
【專利說明】DL-告依春中表告依春與告依春的分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種將混合物DL-告依春進(jìn)行拆分的方法，即，將表告依春與告依春自混合物中分離出，得到光學(xué)純單體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DL-告依春(也叫做(R，S)-告依春)為表告依春(R-告依春)和告依春(S-告依春)的混合物，二者互為異構(gòu)體，該混合物曾被認(rèn)為是板藍(lán)根的主要有效成分。但后續(xù)研究表明，表告依春與告依春的活性具有很大差異，其中的表告依春才是抗流感病毒的活性成分，告依春不但無該活性，更有文獻(xiàn)報(bào)道其具有一定的毒性。因此，將將DL-告依春進(jìn)行手性拆分，得到光學(xué)純的表告依春單體，對于研制高效、低毒副作用的抗病毒藥物具有十分重要的意義。為此，發(fā)明人曾經(jīng)開發(fā)了一種正向手性色譜拆分方法(發(fā)明專利申請201010222106.8)，成功將二者分離，但該方法存在純度偏低、操作繁瑣、耗時(shí)長、不適于放量制備等不足。
[0003]超臨界流體色譜(supercriticalfluid chromatography, SFC)是一種以超臨界流體做流動相，依靠流動相的溶劑化能力來進(jìn)行分離、分析的技術(shù)。與常規(guī)的HPLC、GC技術(shù)相t匕，SFC具有體系粘度低、擴(kuò)散和傳質(zhì)速率高等特點(diǎn)，可以有效地彌補(bǔ)HPLC和GC在分離手性物質(zhì)方面的不足。但由于中藥活性成分十分復(fù)雜、極性偏大等原因，SFC在中藥活性成分手性分離方面的研究鮮見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]針對現(xiàn)有DL-告依春手性分離方法存在的不足，發(fā)明人經(jīng)過大量的系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)研究，建立了一種方便高效、重復(fù)性好、分離單體純度更高的手性分離方法。
[0005]本發(fā)明提供了一種DL-告依春中表告依春與告依春的分離方法,該分離方法為:將DL-告依春制成溶液，以超臨界流體色譜法進(jìn)行分離。
[0006]所述的將DL-告依春制成溶液，具體為，將DL-告依春加有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑與水的混合溶液溶解，分析時(shí)，制成濃度為0.1~10mg/ml (該濃度為混合物的濃度)的溶液，優(yōu)選制成lmg/ml的溶液,進(jìn)樣量優(yōu)選為10 μ L ;制備時(shí),制成濃度為10~100mg/ml(該濃度為混合物的濃度)的溶液，進(jìn)樣量優(yōu)選為50 μ L ;所述的有機(jī)溶劑為常用有機(jī)溶劑，優(yōu)選甲醇。該DL-告依春為表告依春與告依春的混合物,該混合物的提取已經(jīng)有多種方法的報(bào)道，本發(fā)明所使用的DL-告依春對其提取方法沒有要求，也可直接購買得到。
[0007]所述的超臨界流體色譜法，其固定相是以纖維素-三(3，5-二氯苯基氨基甲酸酯)為填料的手性色譜柱，該色譜柱為鍵合型或涂敷型，優(yōu)選用鍵合型色譜柱。超臨界流體色譜法固定相的填料相種類很多，有幾十種，如直鏈淀粉-三(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)、纖維素-三(4-氯苯基氨基甲酸酯)等。即便是同一種類型的色譜柱不同廠家的填裝工藝也不盡相同，填料與填裝工藝對固定相的分離效果影響非常大，因此，固定相的選擇對于手性分離方法的建立至關(guān)重要。發(fā)明人通過對DL-告依春結(jié)構(gòu)、性質(zhì)的分析，結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，驚喜地發(fā)現(xiàn)，以纖維素-三(3，5-二氯苯基氨基甲酸酯)為填料的手性色譜柱可以將表告依春及告依春完全分離，兩單體的純度均在99%以上，分離度均不低于2.5，遠(yuǎn)高于《中國藥典》對分離度的要求。
[0008]當(dāng)所述的固定相為鍵合型手性色譜柱時(shí)，所述分離方法的流動相為體積比83:17到90:10的二氧化碳-乙腈，流速為3~4ml/min，柱溫為33~38°C，背壓為100~150bar。各參數(shù)在該范圍內(nèi)的所述分離方法可以使表告依春與告依春的分離度達(dá)到3以上，5分鐘以內(nèi)完成分離。該分離方法十分快捷，且單體純度非常高，與現(xiàn)有分離方法相比，分離效率、效果均得到顯著地提高。
[0009]當(dāng)所述的固定相為鍵合型手性色譜柱時(shí)，本發(fā)明的分離方法優(yōu)選為:流動相為體積比85:15的二氧化碳-乙腈，流速為3.5ml/min,柱溫為35°C,背壓為lOObar。該優(yōu)選方法可使兩成分在4分鐘內(nèi)完成分離，又不被溶劑峰所影響，且兩峰的分離度高達(dá)3.5。
[0010]上述的固定相(鍵合型手性色譜柱)是指CHIRALPAK IC(5um*4.6mm*150mm),該手性色譜柱主要用于分析，也可稱為分析柱。此外，為了了解該分離方法的耐用性及放量制備的情況，發(fā)明人還考察了分析柱的其他規(guī)格及半制備柱、制備柱，如CHIRALPAKIC(5um*4.6mm*25Omm)、CHIRALPAK IC (5um*20mm*250mm)、CHIRALPAK IC (5um*50mm*150mm)等，均可很好地將表告依春與告依春進(jìn)行分離。
[0011]當(dāng)固定相為涂覆型手性色譜柱時(shí)，所述分離方法的流動相為體積比90:10到95:5的二氧化碳-甲醇,流速為1.5~2.5ml/min,柱溫為33~38°C,背壓為100~150bar。各參數(shù)在該范圍內(nèi)的所述分離方法可以使告依春與表告依春的分離度在2以上，15分鐘以內(nèi)完成分離。該分離方法在保證單體高純度的同時(shí)，相對于現(xiàn)有的液相色譜等分離法也節(jié)約了近一倍的時(shí) 間。
[0012]當(dāng)固定相為涂覆型手性色譜柱時(shí)，所述分離方法優(yōu)選為:流動相為體積比93:7的二氧化碳-甲醇，流速為2.5ml/min,柱溫為35°C,背壓為lOObar。該優(yōu)選條件下,告依春與表告依春兩峰的分離度在2.5以上，9分鐘以內(nèi)完成分離。該方法的有機(jī)溶劑消耗量更小，易于回收、更環(huán)保。
[0013]上述的固定相(涂覆型手性色譜柱)為CHIRALCEL OD (5um*4.6mm*250mm)。該固定相主要用于分析，也可稱為分析柱。此外，為了了解該分離方法的耐用性及放量制備的情況，發(fā)明人還考察了分析柱的其他規(guī)格及半制備柱、制備柱，如CHIRALCELOD (5um*10mm*250mm) ,CHIRALCEL OD (5um*20mm*250mm)，也可很好地將表告依春與告依春進(jìn)行分離。
[0014]本發(fā)明所述的分離方法的檢測波長為245nm，根據(jù)出峰的先后順序，依次為告依春和表告依春，分別收集兩流份，回收溶劑至干，得到光學(xué)純的告依春和表告依春。所述的回收溶劑，可采用本領(lǐng)域任何常用方法完成。精密稱取分離得到的表告依春和告依春單體適量，分別加三氯甲烷制成濃度約為3mg/ml的溶液，采用數(shù)字式自動旋光儀測定旋光度，測得表告依春和告依春旋光度[a]25D(c = 3，三氯甲烷)分別為+66.5和-67.3。該結(jié)果說明拆分產(chǎn)物的光學(xué)純度很高，該方法手性分離的效果非常好。將分離得到的表告依春和告依春單體分別制成溶液，按照本發(fā)明分離方法進(jìn)樣測定，采用峰面積歸一化法計(jì)算表告依春和告依春化學(xué)純度，分別為99.5%和99.2%。
[0015]當(dāng)需要大量制備光學(xué)純的表告依春和告依春時(shí)，本發(fā)明所述制備方法可以使用固定相是以纖維素-三(3，5-二氯苯基氨基甲酸酯)為填料的制備或半制備型手性色譜柱，如 CHIRALPAK IC5um*20mm*250mm 或 CHIRALCEL 0D5um*20mm*250mm，相應(yīng)的，提高流速至5ml/min~10ml/min,其他參數(shù)不變。
[0016]發(fā)明人通過以下實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證本發(fā)明分離方法。
[0017]再次重申:以下實(shí)驗(yàn)只是本發(fā)明方法建立過程中眾多實(shí)驗(yàn)中的舉例性實(shí)驗(yàn)，并未涵蓋和窮盡了發(fā)明人為本發(fā)明所做的所有實(shí)驗(yàn)，目的僅僅在于用那些數(shù)據(jù)來闡述本發(fā)明分離方法的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等。
[0018]方法學(xué)考察試驗(yàn)
[0019]1、儀器與試藥
[0020]Waters Investigator超臨界流體色譜儀,配有Waters2998PDA檢測器。色譜純甲醇、乙腈購于Merck公司。DL-告依春來自中國食品藥品檢定研究院。
[0021]2、色譜條件
[0022]分離方法A:色譜柱:CHIRALPAK IC(5um*4.6mm*150mm),流動相:二氧化碳-乙腈85:15(v/v)，流速:3.5ml/min，柱溫:35°C，背壓:100bar，進(jìn)樣量:10μ 1，檢測波長 245nm ；
[0023]分離方法B:色譜柱:CHIRALCEL OD (5um*4.6mm*250mm),流動相:二氧化碳-甲醇93:7(v/v)，流速:2.5ml/min，柱溫:35°C，背壓:100bar，進(jìn)樣量:10μ 1，檢測波長 245nm。
[0024]3、系統(tǒng)適應(yīng)性及精密度試驗(yàn)
[0025]精密稱取DL-告依春，加甲醇溶解制成約lmg/ml的供試液。取該供試液，分別按照上述兩種分離方法連續(xù)測定5次，記錄告依春與表告依春色譜峰的理論塔板數(shù)、分離度及峰面積，并計(jì)算RSD值。結(jié)果表明，兩分離方法的精密度都非常好，均可很好地將DL-告依春中的告依春與表告依春分離，具體見表1-2。
[0026]表1分離方法A系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果
[0027]
【權(quán)利要求】
1.DL-告依春中表告依春與告依春的分離方法,其特征在于,該分離方法為:將DL-告依春制成溶液，以超臨界流體色譜法進(jìn)行分離。
2.如權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，該分離方法的固定相是以纖維素-三(3，5- 二氯苯基氨基甲酸酯)為填料的手性色譜柱，該色譜柱為鍵合型或涂敷型。
3.如權(quán)利要求2所述的分離方法，其特征在于，當(dāng)固定相為鍵合型手性色譜柱時(shí)，所述分離方法的流動相為體積比83:17到90:10的二氧化碳-乙腈，流速為3~4ml/min,柱溫為33~38°C，背壓為100~150bar。
4.如權(quán)利要求3所述的分離方法，其特征在于，該分離方法的流動相為體積比85:15的二氧化碳_乙腈，流速為3.5ml/min,柱溫為35°C,背壓為lOObar。
5.如權(quán)利要求3或4所述的分離方法，其特征在于，所述的固定相為CHIRALPAKIC5um*4.6mm*150mmο
6.如權(quán)利要求2所述的分離方法，其特征在于，當(dāng)固定相為涂覆型手性色譜柱時(shí)，所述分離方法的流動相為體積比90:10到95:5的二氧化碳-甲醇，流速為1.5~2.5ml/min，柱溫為33~38°C，背壓為100~150bar。
7.如權(quán)利要求6所述的分離方法，其特征在于，該分離方法的流動相為體積比93:7的二氧化碳-甲醇， 流速為2.5ml/min,柱溫為35°C,背壓為lOObar。
8.如權(quán)利要求6或7所述的分離方法，其特征在于，所述的固定相為CHIRALCEL0D5um*4.6mm*250mm。
9.如權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，將DL-告依春制成濃度為0.1~1mg/ml的溶液。
10.如權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，該分離方法的檢測波長為245nm，根據(jù)出峰的先后順序，依次為告依春和表告依春，分別收集兩流份，回收溶劑至干，得到光學(xué)純的告依春和表告依春。
【文檔編號】C07D263/16GK104030999SQ201410293677
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】聶黎行, 戴忠, 馬雙成 申請人:中國食品藥品檢定研究院