綠盲蝽超氣門(mén)蛋白特異性多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種綠盲蝽超氣門(mén)蛋白(ultraspiracle?protein，ALUSP)的多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明將經(jīng)原核表達(dá)純化的ALUSP重組蛋白應(yīng)用于免疫家兔后制備了多克隆抗體，通過(guò)利用ELISA法確定了該多克隆抗體的效價(jià)后，發(fā)明人采用Western?blot法確定該多克隆抗體能特異性識(shí)別ALUSP重組蛋白，并可產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)?；诖耍l(fā)明人還建立了一套高效、高靈敏度和準(zhǔn)確的Western?blot方法，可特異性地從綠盲蝽蟲(chóng)體內(nèi)檢測(cè)出超氣門(mén)蛋白。應(yīng)用本發(fā)明，可為超氣門(mén)蛋白在綠盲蝽體內(nèi)的組織分布以及該蛋白的快速檢測(cè)和分子生物學(xué)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。
【專(zhuān)利說(shuō)明】綠盲蝽超氣門(mén)蛋白特異性多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗體工程農(nóng)業(yè)科學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及綠盲蝽超氣門(mén)蛋白特異性多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]綠盲蝽Apolygus lucorum(Hemiptera:Miridae)屬半翅目盲蝽科，是棉花、蔬菜、果樹(shù)、牧草等多種農(nóng)作物上的重要害蟲(chóng)。近年來(lái)，由于轉(zhuǎn)Bt基因棉的大面積種植和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整等原因，綠盲蝽種群數(shù)量急劇上升，加之長(zhǎng)期依賴(lài)化學(xué)農(nóng)藥防治，致使綠盲蝽的抗藥性日漸增強(qiáng)，目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的綠盲蝽防控面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，急待開(kāi)拓減少化學(xué)農(nóng)藥使用的新型無(wú)公害防控手段。迄今，多種新型昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑已應(yīng)用到防治綠盲蝽的危害中，如氟鈴脲等第三代殺蟲(chóng)劑，顯示出較好的殺蟲(chóng)效果。但是，由于這些農(nóng)藥的特異性靶標(biāo)表達(dá)量的差異，可顯著影響其藥效。超氣門(mén)蛋白(ultraspiracle protein, USP)就是多種昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的靶標(biāo)基因，也是綠盲蝽體內(nèi)一種重要的核基因。綠盲蝽USP基因在不同齡期、不同組織中的蛋白表達(dá)量均不相同，導(dǎo)致昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑施用后，對(duì)靶標(biāo)基因超氣門(mén)蛋白的抑制效果出現(xiàn)較大差異，從而可引起農(nóng)藥的使用效果下降。因此要求有靈敏度高，特異性好的蛋白檢測(cè)技術(shù)來(lái)分析綠盲蝽體內(nèi)超氣門(mén)蛋白的表達(dá)量，指導(dǎo)這些昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用時(shí)間。目前，應(yīng)用在昆蟲(chóng)蛋白檢測(cè)的方法主要有ELLSA和Western blot。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]發(fā)明目的:本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體。
[0004]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的制備方法。
[0005]本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的ELLSA檢測(cè)方法。
[0006]本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的Western blot檢測(cè)方法。
[0007]本發(fā)明的又一目的是提供一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的抗體特異性檢測(cè)方法。
[0008]技術(shù)方案:為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體，將重組ALUSP蛋白免疫家兔后制得。
[0009]一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟:
[0010]a、抗原處理:取純化后的重組ALUSP蛋白與等體積弗氏完全佐劑混勻乳化得到首次免疫抗原；弗氏不完全佐劑和重組ALUSP蛋白等體積混合得到第二、三和四次免疫抗原；
[0011]b、動(dòng)物免疫:采用皮下多點(diǎn)注射法免疫健康的家兔，共免疫4次；首次免疫采用首次免疫抗原；間隔21天后第二次免疫采用第二次免疫抗原，耳靜脈采血1ml，ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)；間隔35天后第三次免疫采用第三次免疫抗原，耳靜脈采血1ml，ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)；間隔49天后第四次免疫采用第四次免疫抗原，末次免疫后第7天，耳靜脈采血lml,ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)；最后于第四次免疫后第8天，頸動(dòng)脈采全血，分離血清，抗原親和純化法獲得綠盲蝽ALUSP多克隆抗體。[0012]其中，上述步驟b中的首次免疫抗原劑量為0.3mg/只，第二、三和四次免疫抗原劑量為0.15mg/只。
[0013]本發(fā)明中采用的重組ALUSP蛋白為專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?01410017156.0，發(fā)明名稱(chēng)為“一種綠盲蝽超氣門(mén)蛋白、其編碼序列、載體和菌株”中的制備方法制備得到的重組ALUSP蛋白。
[0014]一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的ELISA檢測(cè)方法，包括以下步驟:用碳酸鹽包被重組ALUSP蛋白抗原，4°C孵育過(guò)夜，取出抗原后用PBST洗滌液洗滌三次，然后加入封閉液，取出再用PBST洗滌液洗滌三次，將一抗(兔子血清)首先按照1:1000稀釋?zhuān)缓蟊侗认♂專(zhuān)?7°C孵育I小時(shí)；取出用PBST洗滌液洗滌三次，加入二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔I gG(H+L) ),1:8000稀釋?zhuān)?7°C孵育45min ;取出用PBST洗滌液洗滌五次，3分鐘/次，最后加入底物溶液100 μ I/孔，反應(yīng)15min，加入100 μ 12mol/L硫酸終止反應(yīng)，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，評(píng)價(jià)抗體效價(jià)。
[0015]一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的Western blot檢測(cè)方法，包括以下步驟:取ALUSP重組蛋白按梯度上樣。上樣完畢后，聚丙烯酰胺凝膠先90V跑完積層膠，再將電壓升至200V直到電泳結(jié)束。電泳結(jié)束后，取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒壓100V轉(zhuǎn)膜1.5小時(shí)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，取下膜后先用PBS洗滌4次，每次5分鐘。然后置于37°C，5%脫脂奶粉封閉液中封閉I小時(shí)。用封閉液稀釋一抗，膜在一抗稀釋液中37°C反應(yīng)I小時(shí)。洗膜4次,每次5分鐘,用含5%牛奶的封閉液稀釋二抗。膜在二抗中37°C反應(yīng)I小時(shí)。洗膜ECL顯影。
[0016]—種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的抗體特異性Western blot檢測(cè)方法,包括以下步驟:取綠盲蝽若蟲(chóng)提取總蛋白，通過(guò)RIPA裂解獲得上清，按梯度上樣采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后，取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，取下膜后先用PBS洗滌，然后將膜置于封閉液中封閉，然后用封閉液稀釋一抗，膜在一抗稀釋液中反應(yīng)，洗膜，封閉液稀釋二抗，膜在二抗中反應(yīng)，洗膜ECL顯影。
[0017]本發(fā)明采用的封閉劑為脫脂奶粉。
[0018]有益效果:本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn):將原核表達(dá)純化的ALUSP重組蛋白應(yīng)用于免疫家兔后制備了多克隆抗體，在通過(guò)利用ELISA法確定了該多克隆抗體的效價(jià)后，發(fā)明人采用Western blot法發(fā)現(xiàn)該多克隆抗體能特異性識(shí)別原核表達(dá)的ALUSP重組蛋白，可產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。基于此，發(fā)明人還建立了一套高效、高靈敏度和準(zhǔn)確的Westernblot方法,可特異性地從綠盲蝽蟲(chóng)體內(nèi)檢測(cè)出超氣門(mén)蛋白。應(yīng)用本發(fā)明，可為超氣門(mén)蛋白在綠盲蝽體內(nèi)的組織分布以及該蛋白的快速檢測(cè)和分子生物學(xué)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1ELISA檢測(cè)三免后效價(jià)圖；I~12孔分別代表表1中的:陰性、空白、稀釋1000倍、稀釋2000倍、稀釋4000倍、稀釋8000倍、稀釋16000倍、稀釋32000倍、稀釋64000倍、稀釋128000倍、稀釋256000倍、稀釋512000倍；
[0020]圖2ELISA檢 測(cè)四免后效價(jià)圖；1~12孔分別代表表2中的:陰性、空白、稀釋1000倍、稀釋2000倍、稀釋4000倍、稀釋8000倍、稀釋16000倍、稀釋32000倍、稀釋64000倍、稀釋128000倍、稀釋256000倍、稀釋512000倍；[0021]圖3ELISA檢測(cè)終放血后效價(jià)圖；1~12孔分別代表表3中的:陰性、空白、稀釋1000倍、稀釋2000倍、稀釋4000倍、稀釋8000倍、稀釋16000倍、稀釋32000倍、稀釋64000倍、稀釋128000倍、稀釋256000倍、稀釋512000倍；
[0022]圖4Western blot檢測(cè)ALUSP多克隆抗體與ALUSP重組蛋白結(jié)合圖；泳道1_4分別為:1-4:5μ g、ly g、0.2μ g 和 0.04 μ g ALUSP 重組蛋白。
[0023]圖5Western blot檢測(cè)ALUSP多克隆抗體特異性結(jié)果圖；泳道1_5分別為:l-3:80yg、40yg和20yg綠盲蝽總蛋白(加I抗和2抗)，4為水(加I抗和2抗)；5為80 μ g綠盲蝽總蛋白(不加I抗和2抗)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0025]實(shí)施例1綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的獲得
[0026]首先進(jìn)行抗原處理:取純化后的重組ALUSP蛋白總量約5mg，初免劑量為0.3mg/只，二免、三免、四免劑量為0.15mg/只；初免抗原為蛋白抗原與等體積弗氏完全佐劑混勻乳化；二免、三免、四免抗原為蛋白抗原與等體積弗氏不完全佐劑混勻乳化。然后進(jìn)行動(dòng)物免疫:采用皮下多點(diǎn)注射法免疫健康的雌性新西蘭大白兔，共免疫4次；首次免疫抗原為弗氏完全佐劑和蛋白抗原；間隔21天后第二次免疫，抗原為弗氏不完全佐劑和蛋白抗原；間隔35天后第三次免疫，抗原為弗氏不完全佐劑和蛋白抗原，耳靜脈采血1ml，ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)(圖1、表1);間隔49天后第四次免疫，抗原為弗氏不完全佐劑和蛋白抗原，末次免疫后第7天，耳靜脈采血1ml，ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)(圖2、表2);最后于末次免疫后第8天，頸動(dòng)脈采全血，分離血清，抗原親和純化法獲得綠盲蝽ALUSP的多克隆抗體(圖3，表
3)
[0027]表1三免后OD值
[0028]
【權(quán)利要求】
1.一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體，其特征在于，將重組ALUSP蛋白免疫家兔后制得。
2.權(quán)利要求1所述的一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: a、抗原處理:取純化后的重組ALUSP蛋白與等體積弗氏完全佐劑混勻乳化得到首次免疫抗原；弗氏不完全佐劑和重組ALUSP蛋白等體積混合得到第二、三和四次免疫抗原； b、動(dòng)物免疫:采用皮下多點(diǎn)注射法免疫家兔，共免疫4次；首次免疫采用首次免疫抗原；間隔21天后第二次免疫采用第二次免疫抗原，耳靜脈采血1ml，ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)；間隔35天后第三次免疫采用第三次免疫抗原，耳靜脈采血1ml，ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)；間隔49天后第四次免疫采用第四次免疫抗原，末次免疫后第7天，耳靜脈采血1ml，ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)；最后于第四次免疫后第8天，頸動(dòng)脈采全血，分離血清，抗原親和純化法獲得綠盲蝽ALUSP多克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟b中的首次免疫抗原劑量為0.3mg/只，第二、三和四次免疫抗原劑量為0.15mg/只。
4.權(quán)利要求1所述的一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的ELLSA檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟:用碳酸鹽包被重組ALUSP蛋白抗原，4°C孵育過(guò)夜；取出抗原后用PBST洗滌液洗滌三次，然后加入封閉液，取出再用PBST洗滌液洗滌三次，將一抗首先按照1:1000稀釋?zhuān)缓蟊侗认♂?，37°C孵育I小時(shí)，取出用PBST洗滌液洗滌三次，加入二抗，1:8000稀釋?zhuān)?7°C孵育45min，取出用PBST洗滌液洗滌五次，3分鐘/次，最后加入底物溶液100 μ I/孔，反應(yīng)15min，加入100μ 12mol/L硫酸終止反應(yīng)，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，評(píng)價(jià)抗體效價(jià)。
5.權(quán)利要求1所述的一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的抗體特異性Westernblot檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟:取綠盲蝽提取總蛋白，通過(guò)RIPA裂解獲得上清，按梯度上樣采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后，取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，取下膜后先用PBS洗滌，然后將膜置于封閉液中封閉，然后用封閉液稀釋一抗，膜在一抗稀釋液中反應(yīng)，洗膜，封閉液稀釋二抗，膜在二抗中反應(yīng)，洗膜ECL顯影。
【文檔編號(hào)】C07K16/18GK103992404SQ201410229553
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】譚永安, 肖留斌, 柏立新, 孫洋, 趙靜 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院