雞新城疫病毒f蛋白和腸毒素ltb的融合蛋白及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種截短的雞新城疫病毒F蛋白和腸毒素LTB的融合蛋白及應(yīng)用，所述的融合蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1。本發(fā)明的融合蛋白用于制備雞新城疫病毒基因工程亞單位疫苗。本發(fā)明將篩選的雞新城疫病毒基因VIId型的毒株的F蛋白部分序列與具有免疫增強(qiáng)作用的腸毒素LTB蛋白通過(guò)Lingker序列連接獲得的融合蛋白，并將該融合蛋白進(jìn)一步制備成疫苗。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明制備的基因工程亞單位疫苗免疫原性良好，可以高效的引起雛雞的免疫應(yīng)答。
【專利說(shuō)明】雞新城疫病毒F蛋白和腸毒素LTB的融合蛋白及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種雞新城疫病毒F蛋白和腸毒素LTB的融合蛋白及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]新城疫(Newcastle disease, NDV)是當(dāng)今世界上最嚴(yán)重的禽類傳染病之一，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(0IE)列為必須報(bào)告的傳染病。NDV是單鏈負(fù)股RNA病毒，整個(gè)基因組全長(zhǎng)15586個(gè)核苷酸，分子量約為51~57 KD。NDV編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein,NP)、憐蛋白(Phosphate protein,P)、基質(zhì)蛋白(Matrix,M)、融合蛋白(Fusionprotein, F)、血凝素神經(jīng)氨酸酶(Haemagglutinin Neuraminidase Protein,HN)和高分子量的RNA聚合酶(Large protein，L)，其順序?yàn)?’-NP-P-M-F-HN-L_5’。隨著現(xiàn)在養(yǎng)殖集約化、規(guī)?；陌l(fā)展，新城疫病毒變異很快，近幾年臨床上流行的毒株以新城疫基因VIId型為主，現(xiàn)有Lasota等疫苗株已無(wú)法對(duì)臨床野毒提供有效保護(hù)，免疫失敗的案例時(shí)有發(fā)生，急需開(kāi)發(fā)新一代疫苗。F蛋白是構(gòu)成新城疫病毒(NDV)致病性的分子基礎(chǔ)之一，為新城疫病毒的主要保護(hù)性抗原，常被用為新城疫病毒基因工程疫苗的候選基因。F蛋白基因編碼一條由553個(gè)氨基酸組成的蛋白，包括信號(hào)序列(SS)、位于羧基端附近疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和一個(gè)由25~30個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(CT)，其3個(gè)主要的抗原決定簇位于72、161、343位。1995年美國(guó)農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)重組新城疫病毒F基因的雞痘病毒活載體苗商品化，該重組活疫苗免疫效果與常規(guī)ND疫苗相當(dāng)，并且一次免疫即可保護(hù)雞抵抗NDV強(qiáng)毒的攻擊。因新城疫病毒F蛋白過(guò)大，原核中難于表達(dá)，而真核表達(dá)系統(tǒng)的成本又過(guò)高，針對(duì)新城疫病毒F蛋白研制的基因工程亞單位疫苗遲遲沒(méi)有實(shí)現(xiàn)商品化。因此，對(duì)新城疫病毒F蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選新城疫病毒F蛋白主要抗原表位進(jìn)行表達(dá)成為新城疫病毒病毒基因工程亞單位疫苗開(kāi)發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)。王杰等(2013年)采用大腸桿菌對(duì)含有主要抗原表位的新城疫病毒F蛋白部分序列實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，進(jìn)一步制備的疫苗可對(duì)免疫的雞群實(shí)現(xiàn)保護(hù)，但其保護(hù)率偏低，僅為50%。
[0003]產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌(ETEC)是一類致人和幼畜腹瀉的最常見(jiàn)的致病性大腸埃希菌，其產(chǎn)生不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin, LT)不僅具有毒性作用，而且還具有良好的免疫原性和免疫佐劑作用。LT為寡聚蛋白，由一個(gè)A亞(28 KD)和5個(gè)B亞基(I 1.5KD)經(jīng)非共價(jià)鍵結(jié)合。B亞基(LTB)是LT的免疫原性部位，是受體結(jié)合部位，具有良好的免疫佐劑作用，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道其用于疫苗的免疫佐劑。李潤(rùn)成等(2009年)將腸毒素LTB蛋白基因與口蹄疫VPl蛋白基因進(jìn)行融合表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LTB可有效促進(jìn)口蹄疫VPl蛋白的免疫效果，增效明顯。
[0004]本發(fā)明即是基于腸毒素LTB優(yōu)良的免疫佐劑作用和新城疫病毒株F蛋白良好的免疫原性設(shè)計(jì)的。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明涉及一種雞新城疫病毒F蛋白和腸毒素LTB的融合蛋白及應(yīng)用，即將篩選的雞新城疫病毒基因VIId型的毒株的F蛋白部分序列與具有免疫增強(qiáng)作用的腸毒素LTB蛋白通過(guò)Lingker序列連接獲得的融合蛋白，并將該融合蛋白作為疫苗用于免疫應(yīng)答。
[0006]本發(fā)明一個(gè)方面涉及一種融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
[0007]本發(fā)明的融合蛋白用于制備雞新城疫病毒亞單位疫苗。
[0008]上述制備的亞單位疫苗，其制備方法如下:將96份融合蛋白與滅菌的4份吐溫80攪拌混合作為水相；將94份注射用白油，6份加司本80、2份硬脂酸鋁，混合均勻，高壓滅菌后作為油相；按水相和油相體積比1:3比例混合乳化即可制備雞新城疫病毒基因工程亞單位疫苗。
[0009]本發(fā)明的亞單位疫苗用于對(duì)雛雞的免疫應(yīng)答。
[0010]本發(fā)明是基于腸毒素LTB優(yōu)良的免疫佐劑作用和新城疫病毒株F蛋白良好的免疫原性設(shè)計(jì)的。其具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):1、選用的雞新城疫病毒從國(guó)內(nèi)臨床養(yǎng)殖的病雞中分離，屬于國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的近幾年國(guó)內(nèi)流行的雞新城疫基因VIId型毒株，以其制備的疫苗針對(duì)性更強(qiáng)、療效更確切；2、表達(dá)的雞新城疫病毒F蛋白的部分序列，既包含了 F蛋白的主要抗原表位又實(shí)現(xiàn)了原核的高效表達(dá)，大大降低了生產(chǎn)成本；3、本發(fā)明將篩選的含主要抗原表位的雞新城疫病毒F蛋白基因與具有免疫增強(qiáng)作用的腸毒素LTB蛋白基因通過(guò)Lingker序列連接獲得融合蛋白。一次免疫操作就可以使雛雞可以獲得高效免疫保護(hù)。
[0011]【具體實(shí)施方式】:
本發(fā)明涉及一種截短的雞新城疫病毒F蛋白和腸毒素LTB的融合蛋白。其中腸毒素LTB蛋白3'端的108個(gè)氨基酸與含主要抗原表位的雞新城疫病毒F蛋白145個(gè)氨基酸通過(guò)Lingker序列GGGGS連接起來(lái)，其具有序列為SEQ ID NO:1的氨基酸序列和序列為SEQID N0:2的核苷酸序列。所述的融合蛋白`可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的基因重組的方法進(jìn)行制備。
[0012]將重組制備的雞新城疫病毒F蛋白和腸毒素LTB的融合蛋白經(jīng)白油佐劑乳化制成雞新城疫病毒基因工程亞疫苗。按獸用生物制品規(guī)程的檢驗(yàn)方法進(jìn)行性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)均合格。再將制備的疫苗免疫SPF雛雞，結(jié)果顯示制備的疫苗免疫原性良好，可有效引起雛雞的免疫應(yīng)答。
[0013]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，但這些實(shí)例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的技術(shù)方案實(shí)質(zhì)的情況下可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。
一、截短的雞新城疫病毒F蛋白的篩選與原核表達(dá) 包括有如下的步驟:
1、 申請(qǐng)人:首先從臨床分離的疑似雞新城疫的病料處理后接種9日齡SPF雞胚，盲傳三代后PCR擴(kuò)增雞新城疫病毒F基因，引物序列如下:
Pl:5' — GTTAGAAAAAACACGGGTAGAAGA —3'
P2:5 ' — TCCAAATAGGTGGCACGCATA —3'
擴(kuò)增的條件如下:94°C 5min 變性，94°C 30S,55°C 30S,72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin0[0014]擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，基因序列部分在NCBI上Blast比對(duì)，同源性最高為100%，建立的進(jìn)化樹(shù)顯示其屬于新城疫病毒基因VIId型，為近幾年國(guó)內(nèi)臨床流行毒株。
[0015]2、通過(guò)生物軟件分析選取分離的雞新城疫病毒F蛋白基因的部分序列，該序列位于F基因N端，含有F蛋白的主要抗原表位，并將該段蛋白與免疫佐劑LTB蛋白通過(guò)Lingker序列GGGGS連接起來(lái)，其具有序列為SEQ ID NO:1的氨基酸序列和序列為SEQ ID NO: 2的核苷酸序列。將獲得的融合蛋白基因的5'端和3'端分別加上BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)，送基因公司進(jìn)行全基因合成。
3、將合成得到的基因雙酶切后連入pET30a載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pET30a/NDV-LTB表達(dá)載體。用CaCl2法將pET30a/NDV_LTB表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)，涂布于含50iig/ml卡那霉素的瓊脂平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。選取10個(gè)單菌落提取質(zhì)粒，BamH I和Hind III雙酶切驗(yàn)證陽(yáng)性的菌落進(jìn)一步測(cè)序鑒定。將測(cè)序驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)至0.6~0.8時(shí)加入0.3mM IPTG誘導(dǎo)4~5小時(shí)，離心收集菌體跑SDS-PAGE電泳，同時(shí)設(shè)立未誘導(dǎo)菌體作為對(duì)照。結(jié)果誘導(dǎo)后陽(yáng)性克隆比對(duì)照菌在33KD處多出一條蛋白條帶，與重組蛋白理論分子量一致，表達(dá)量約為32%以上。經(jīng)新城疫病毒F蛋白抗體免疫印跡檢定，顯示陽(yáng)性反應(yīng)。證明獲得的陽(yáng)性克隆為高效表達(dá)基因工程蛋白的工程菌。
[0016]二、發(fā)酵、純化與雞新城疫病毒基因工程亞單位疫苗的制備
1、重組蛋白發(fā)酵與純化
I) LB培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基，含5g/L葡萄糖和5g/L MgSO4 ? 7H20的LB培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，補(bǔ)料為葡萄糖400g/L、蛋白胨24g/L、酵母提取物10 g/L, NaCl 5 g/L、MgSO4 ? 7H20 5 g/L。
[0017]2)發(fā)酵過(guò)程·
挑取鑒定過(guò)的工程菌接種于含卡那霉素的濃度為50ii g/ml的LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，作為種子液。將種子液按2%接種量接種于發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)好各參數(shù)，37°C，200轉(zhuǎn)，溶氧控制在20%以上。發(fā)酵4小時(shí)后開(kāi)始流加補(bǔ)料，發(fā)酵6小時(shí)后加入0.3mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)后6小時(shí)發(fā)酵結(jié)束。
[0018]3)鎳柱純化、脫鹽
4)親和層析
采用鎳離子金屬螯合層析柱，重組蛋白可以用含350mmol/L咪唑的洗脫液洗下來(lái)，純度達(dá)到92%以上
5)脫鹽
收集的重組蛋白洗脫液放入透析袋，PBS液作為透析外液，透析脫鹽即得重 組蛋白液。
[0019]2、雞新城疫病毒基因工程亞單位疫苗的制備
將制備的重組蛋白96份與滅菌的4份吐溫-80充分?jǐn)嚢杌旌献鳛樗?。同時(shí)注射用白油94份，加6份的司本80、硬脂酸鋁2份，混合均勻，高壓滅菌后作為油相。按水相和油相1:3比例混合乳化即可制備雞新城疫病毒基因工程亞單位疫苗。按獸用生物制品規(guī)程的檢驗(yàn)方法進(jìn)行性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)均合格。
[0020]三、雞新城疫病毒基因工程亞單位疫苗的免疫試驗(yàn)
將制備的雞新城疫病毒基因工程亞單位疫苗經(jīng)肌肉接種20日齡SPF雛雞20羽，另取20羽注射無(wú)菌PBS作為對(duì)照。免疫后0、7、14、21、28、60天采血，測(cè)血清中新城疫的HI效價(jià)。結(jié)果免疫組在21后效價(jià)維持在8、左右，且雞群抗體滴度分布均勻，而對(duì)照組則全程維持在3~4左右。證明制備的雞新城疫病毒基因工程亞單位免疫效果良好。
[0021]四、雞新城疫病毒基因工程亞單位疫苗的攻毒試驗(yàn)
將制備的雞新城疫病毒基因工程亞單位疫苗經(jīng)肌肉接種20日齡SPF雛雞20羽，另取20羽注射無(wú)菌PBS作為對(duì)照。免疫28日后在負(fù)壓隔離器中進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，口服新城疫強(qiáng)毒北京株，IO5EID5tl/羽，觀察14日。結(jié)果對(duì)照組雞群全部發(fā)病、死亡，剖檢有典型新城疫病毒感染癥狀，免疫組雞只接種部位、精神、采食正常，未見(jiàn)明顯變化，保護(hù)率達(dá)到100%。結(jié)果顯示制備的重組蛋白免疫原性良好，其進(jìn)一步制備的雞新城疫病毒基因工程亞單位疫苗可以引起雛雞的免疫應(yīng)答 ，可有效保護(hù)雛雞抵抗新城疫強(qiáng)毒北京株的攻擊。
【權(quán)利要求】
1.一種雞新城疫病毒F蛋白和腸毒素LTB的融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
2.權(quán)利要求1所述的融合蛋白在制備雞新城疫病毒基因工程亞單位疫苗中的應(yīng)用。
3.一種雞新城疫病毒基因工程亞單位疫苗，其制備方法如下:將96份權(quán)利要求1所述的融合蛋白與滅菌的4份吐溫80攪拌混合作為水相；再將94份注射用白油，6份加司本80、2份硬脂酸鋁混合均勻，高壓滅菌后作為油相；按水相和油相體積比1:3比例混合乳化后制成亞單位疫苗。
4.權(quán)利要求3所 述的亞單位疫苗用于對(duì)雛雞的免疫應(yīng)答。
【文檔編號(hào)】C07K19/00GK103626878SQ201310652273
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】侯竹美, 方華華, 豐艷妮, 王鳳舞, 王金葉 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)