一種促進(jìn)大黃魚生長(zhǎng)的可溶性重組蛋白及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促進(jìn)大黃魚生長(zhǎng)的可溶性重組蛋白及其制備方法，所述的可溶性重組蛋白具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的蛋白能夠有效的促進(jìn)大黃魚幼苗生長(zhǎng)，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種促進(jìn)大黃魚生長(zhǎng)的可溶性重組蛋白及其制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，具體而言，涉及一種促進(jìn)大黃魚生長(zhǎng)的可溶性重組蛋白及其制備方法。【背景技術(shù)】
[0002]大黃魚(Larimichthys crocea, Richadson),俗稱大黃花魚,紅瓜、桂花黃魚、石首魚、石頭魚等，是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類，屬于我國(guó)四大海產(chǎn)之一。從分類學(xué)角度來看，大黃魚隸屬于動(dòng)物界(Animalia)、脊索動(dòng)物門(Chordata)、脊椎動(dòng)物亞門(Vertebrata)、硬骨魚綱(Osteichthyes)、福鰭亞綱(Actinopterygii)、S盧形目(Perciformes)、石首魚(Sciaenidae)、黃魚屬(Pseudosciaena)。其主要分布在黃海中部以南到瓊州海峽以東的中國(guó)大陸近海岸，西北太平洋的亞熱帶區(qū)域(Santos et al.，2013)，依據(jù)海區(qū)大黃魚產(chǎn)卵場(chǎng)的不同，大黃魚種群分為岱衢族、閩-粵東族和硇州族。其肉質(zhì)鮮美，既可鮮食，亦可曬干制成“黃魚鲞”，加工成風(fēng)味獨(dú)特的水產(chǎn)品。耳石有清熱之功效，鰾可潤(rùn)肺健脾、補(bǔ)氣活血，有很高的藥用價(jià)值。又因其體黃唇紅的富貴之像，素有“國(guó)魚”的美譽(yù)。
[0003]由于八十年代過度捕撈，加之海水日益嚴(yán)重的污染，致使大黃魚近海資源受到嚴(yán)重的破壞，捕獲的野生大黃魚價(jià)格奇高。自上個(gè)世紀(jì)八十年代大黃魚人工育苗技術(shù)獲得突破性進(jìn)展，大黃魚的養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大?！?012-2015年中國(guó)大黃魚行業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及投資前景分析報(bào)告》從大黃魚產(chǎn)業(yè)鏈，行業(yè)發(fā)展環(huán)境及總體發(fā)展?fàn)顩r分析，深度數(shù)據(jù)挖掘分析，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)值已達(dá)10億以上，產(chǎn)生了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。然而，大黃魚作為浙江省主要的海洋經(jīng)濟(jì)品種，隨著多年的人工網(wǎng)箱和土池養(yǎng)殖，出現(xiàn)了經(jīng)濟(jì)性退化現(xiàn)象，性成熟過早，生長(zhǎng)緩慢，親魚個(gè)體小，肉質(zhì)風(fēng)味變差等一系列問題，直接影響了大黃魚的市場(chǎng)供需關(guān)系。在“海洋經(jīng)濟(jì)”發(fā)展的浪潮中，利用現(xiàn)代生物遺傳育種技術(shù)培育經(jīng)濟(jì)效益高的大黃魚品種，積極響應(yīng)了廣大養(yǎng)殖戶的要求，滿足了市場(chǎng)需求。
[0004]肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin, MSTN),亦稱生長(zhǎng)分化因子_8 (growth anddifferential factor-8,⑶F_8)，是骨骼肌生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子，基于其研究肌肉生長(zhǎng)的策略引起了人們足夠的重視。通過設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物發(fā)現(xiàn)了小鼠的GDF-8，利用基因打靶將⑶F-8失去功能，發(fā)現(xiàn)了小鼠骨骼肌是野生型的2-3倍之多，這是首次關(guān)于⑶F-8的報(bào)道(C.Mcpherron et al., 1997)。同年，發(fā)現(xiàn)了比利時(shí)藍(lán)牛(Belgian Blue)和皮爾蒙特牛(Piedmontese)的雙肌性狀與⑶F-8有關(guān)(Mcpherron and Lee, 1997)。這掀起了以后關(guān)于MSTN在脊椎動(dòng)物中研究的熱潮。通過不同手段的抑制MSTN在肌肉中的負(fù)調(diào)控作用，在眾多哺乳動(dòng)物中被驗(yàn)證。在血液中，MSTN前體蛋白在形成MSTN成熟肽時(shí)，其前肽在金屬蛋白酶切位點(diǎn) RXXR被骨形成蛋白酶[bone morphogenetic proteins-1 / tolloid(BMP-1 /TLD)]切割，并與二硫鍵連接成熟肽二聚體以非共價(jià)形式存在，形成了潛在的無活性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了 MSTN 失去其肌肉抑制的作用(ffolfman et al.，2003，Hill et al.，2002)。MSTN 前肽過量表達(dá)，注射和腺病毒介導(dǎo)等處理的小鼠，都發(fā)現(xiàn)了顯著的骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育(Yang etal.，2001 ；Bartoli et al.，2007 ；Li et al.，2010)。MSTN前肽對(duì)MSTN成熟肽活性有抑制作用，能有效提高動(dòng)物的肌肉含量，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，為養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展開辟了一條新的思路，然而，如何獲得能夠促進(jìn)大黃魚幼苗生長(zhǎng)的制劑，仍然是本領(lǐng)域的技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)大黃魚生長(zhǎng)的可溶性重組蛋白，其特征在于所述的可溶性重組蛋白的氨基酸序列與SEQ ID N0.2具有95%以上的相似性，優(yōu)選具有99%以上的相似性，進(jìn)一步優(yōu)選為與SEQ ID N0.2的氨基酸序列完全一致。
[0006]在本發(fā)明的另一方面，還涉及上述可溶性重組蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟:
[0007]步驟一:取-80°C的凍存的大黃魚骨骼肌肌肉組織，30mg-50mg組織在液氮中充分研磨至粉末狀，加入Iml Trizol,用槍頭反復(fù)吸打至均勻；
[0008]步驟二:肌肉樣品裂解之后置于室溫下5-10min，使得核蛋白和核酸完全分離；
[0009]步驟三:加入300 μ I氯仿，混勻震蕩15sec，置于室溫5min，然后4°C，1000Orpm下離心15min。漩渦混勻，樣品會(huì)出現(xiàn)三層:上清水相，中層和下層為有機(jī)相，總RNA位于上層水相；
[0010]步驟四:將上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入等體積異戊醇，混勻后，置于室溫 20min ；
[0011]步驟五:4°C時(shí)12000rpm下離心IOmin,棄去上清。置于室溫干燥5_10min。用DEPC-H2O配置75%乙醇。通常ImlTrizol需加入lml75%乙醇洗滌沉淀；用槍頭吸出殘液，不要吸到沉淀；室溫晾曬5min ；
[0012]步驟六:加入35 μ I RNase-free的DEPC-H2O,充分溶解RNA，置于_70°C保存；
[0013]步驟七:設(shè)計(jì)MSTN-1前肽引物:
[0014]上游引物5 ’ -CCG GAATTCGACCAAGAGACGCACCAG-3 ’
[0015]下游引物5 ’ -CCC AAGCTTTCACACCTCCATGAACGGTT-3 ’
[0016]以大黃魚cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系:10Xbuffer5 μ 1，2mMdNTPs5 μ I，25mM MgS043 μ I，模板 cDNA3 μ I，KOD-Plus Neol μ I,加水至 50 μ I。擴(kuò)增程序:預(yù)變性 940C，2min ;變性 98°C，lOsec，退火，55°C，30sec,延伸 68°C，30sec，進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)，收集擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)為723bp，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1 ；
[0017]步驟八:對(duì)目的片段進(jìn)行加a尾；
[0018]步驟九:用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII酶切pMD19_T以及pMAL c2x克隆質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒以及擴(kuò)增的加a尾的目的片段，分別構(gòu)建LcMSTNlpiO-pMD19-T以及MSTNlpro-pMAL c2x表達(dá)載體；將所述的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，得到的LcMSTNlpro-MBP蛋白，其分子量為69.56KDa,由625個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2。
[0019]在本發(fā)明的另一方面，還涉及上述可溶性重組蛋白在促進(jìn)大黃魚增重中的應(yīng)用，特別是促進(jìn)大黃魚幼苗增重中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明的蛋白能夠有效的促進(jìn)大黃魚幼苗生長(zhǎng)，具有良好的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】[0021]樣品采集
[0022]大黃魚骨骼肌樣品取自浙江寧波象山港灣苗種有限公司的一齡大黃魚側(cè)線以上，背鰭以下的背部，裝在1.5ml RNasefree的離心管，迅速放入液氮，帶回實(shí)驗(yàn)室保存于-70°C，用于提取總RNA。
[0023]RNA操作相關(guān)試劑
[0024]Trizol試劑:購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；
[0025]氯仿，無水乙醇(AR級(jí))和異丙醇:均購(gòu)于寧波博奧科學(xué)儀器有限公司；
[0026]70%的乙醇:取70ml的無水乙醇，加RNase Free-H2O定容到100ml，置于4°C保存?zhèn)溆?
[0027]RNase Free-H2O:購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；
[0028]氯仿:異戊醇(24:1):將48ml的氯仿和2ml異戊醇充分混勻，置于4°C保存?zhèn)溆?。氯仿、異戊醇試劑均?gòu)于寧波博奧科學(xué)儀器有限公司；
[0029]3mol 醋酸鈉(NaAC):將 81.6g NaAc_3H20 溶于 160ml RNase Free-H2O，用 3mol 醋酸調(diào)至pH5.2，加RNase Free-H2O定容到200ml，高壓高溫滅菌，然后保存于4°C冰箱備用；
[0030]I X TAE 電泳緩沖液:稱取 Tris4.84g，Na2EDTA.2H200.74g，冰醋酸 1.14ml 放入燒杯中，RNase Free-H2O定容至I升，玻璃容器常溫保存。Tris、冰醋酸和Na2EDTA.2H20，均購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；
[0031]IOmg / ml溴化乙錠(EB):在100ml ddH20中充分溶解Ig溴化乙錠，轉(zhuǎn)移至的棕
色瓶中，并用鋁箔包裹瓶體以避光，室溫保存。溴化乙錠購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；
[0032]I %瓊脂糖凝膠:稱取0.2g Agarose H和20ml I X TAE電泳緩沖液混勻，置于燒杯中，微波爐加熱溶解，冷卻至約50°c左右時(shí)加入以上配置的溴化乙錠I μ 1，搖勻后倒入制膠槽中，插入點(diǎn)樣孔梳子，待室溫下凝固完全后，輕輕拔出插好的梳子。Agarose H購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；
[0033]PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑
[0034]高保真酶擴(kuò)增
[0035]KOD-Plus-Neo (1.0U / μ I):購(gòu)自東洋紡(上海)生物科技有限公司；
[0036]10XPCR Buffer for KOD-Plus-Neo:購(gòu)自東洋紡(上海)生物科技有限公司；
[0037]25mM MgSO4:購(gòu)自東洋紡(上海)生物科技有限公司；
[0038]2mM dNTPs:購(gòu)自東洋紡(上海)生物科技有限公司。
[0039]加‘a(chǎn)’尾及菌落PCR檢測(cè)
[0040]rTaq DNA 聚合酶(5U / μ L) >dNTP Mixture (各 2.5mmol)、10 XPCR Buffer (Mg-)(IOOmmoI Tris-HCL, ρΗ8.3 ；500mmol KCL)和 MgCL2 (25mmol):均購(gòu)于寶生物工程(大連)
有限公司。
[0041]檢測(cè)marker
[0042]DL1000DNA marker:購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；
[0043]Supercolied DNA Ladder Marker:購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。
[0044]克隆過程相關(guān)試劑
[0045]0.1mol CaCL2:在 200ml ddH20 中溶解 54g CaCL2.6H20，高壓滅菌，4°C保存?zhèn)溆?。CaCL2.6H20購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；
[0046]1OOmg / ml氨節(jié)青霉素(Ampicillin, Amp):將0.1g氨節(jié)青霉素溶解于Iml的ddH20中，混勻，-20°C保存?zhèn)溆?。氨芐青霉素購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；
[0047]LB 固體培養(yǎng)基:將 Tryptonelg, Yeast Extract0.5g, NaCLlg,瓊脂粉 Al.Sg在玻璃容器中混勻，加ddH20定容至100ml。用Imol的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。121°C高溫高壓濕熱滅菌20min,冷卻至55°C左右加入IOOmg / ml氨節(jié)青霉素溶液0.1ml,每20ml倒一個(gè)已滅菌的培養(yǎng)皿，完全凝固后，保鮮膜包裹置于4°C保存?zhèn)溆?。Tryptone、Yeast Extract、NaCL, NaOH和瓊脂粉A均購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；
[0048]LB液體培養(yǎng)基:將Tryptonelg, Yeast Extract0.5g和NaCLlg在玻璃容器中混勻，加ddH20定容至100ml。用Imol的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。121°C高溫高壓滅菌20min,冷卻至55°C左右加入IOOmg / ml氨芐青霉素溶液0.lml，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0049]用Imol的NaOH溶液調(diào)節(jié)至ρΗ7.0。121°C高溫高壓滅菌20min，冷卻至55°C加入IOOmg / ml氨芐青霉素溶液200 μ L，4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0050]克隆菌株TGl:本實(shí)驗(yàn)室_80°C冰箱保存。
[0051 ] 大黃魚MSTN基因cDNA合成
[0052](I)取-80°C的凍存肌肉組織，30mg-50mg組織在液氮中充分研磨至粉末狀，加入Iml Trizol,用槍頭反復(fù)吸打至均勻。
[0053](2)肌肉樣品裂解之后置于室溫下5-10min，使得核蛋白和核酸完全分離。
[0054](3)加入300 μ I氯仿,混勻震蕩15sec,置于室溫5min,然后4°C, 1000Orpm下離心15min。漩渦混勻，樣品會(huì)出現(xiàn)三層:上清水相，中層和下層為有機(jī)相，總RNA位于上層水相。
[0055](4)將上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入等體積異戊醇，混勻后，置于室溫20min。切勿吸取到中間層物質(zhì)，否則可能會(huì)出現(xiàn)染色體DNA污染。
[0056](5)4°C時(shí)12000rpm下離心lOmin，棄去上清。置于室溫干燥5-lOmin。用DEPC-H2O配置75%乙醇。通常ImlTrizol需加入lml75%乙醇洗滌沉淀。用槍頭吸出殘液，不要吸到沉淀。室溫晾曬5min。
[0057](6)加入35 μ I RNase-free的DEPC-H2O,充分溶解RNA，置于_70°C保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0058]大黃魚MSTNl前肽的克隆
[0059]設(shè)計(jì)MSTN-1前肽弓丨物:
[0060]上游引物5，-CCG GAA TTC GACCAAGAGACGCACCAG-3 ’
[0061 ] 3個(gè)保護(hù)堿基+EcoRI (斜體)酶切位點(diǎn)
[0062]下游引物5 ’ -CCC AAGCTT TCACACCTCCATGAACGGTT-3 ’
[0063]以大黃魚cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系:10Xbuffer5 μ 1，2mMdNTPs5 μ I，25mM MgS043 μ I，模板 cDNA3 μ I，KOD-Plus Neol μ I,加水至 50 μ I。擴(kuò)增程序:預(yù)變性 940C，2min ;變性 98°C，lOsec，退火，55°C，30sec,延伸 68°C，30sec，進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)，收集擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)為723bp，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
[0064]由于使用高保真酶得到的目的片段不能直接進(jìn)行TA克隆，故需加a尾。反應(yīng)體系:割膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物 30 μ 1,10Xbuffer5y 1，MgCL25 μ 1，dNTPs5 μ 1，rTaq 酶 0.3 μ 1，加水 9μ1。反應(yīng)程序:72°C，20min。[0065]用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII酶切pMD19-T以及pMAL c2x克隆質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒以及擴(kuò)增的產(chǎn)物，分別構(gòu)建LcMSTNlpro-pMD19-T以及MSTNlpro-pMAL c2x表達(dá)載體。將所述的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，得到的LcMSTNlpro-MBP蛋白，其分子量為69.56KDa，由625個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2。
[0066]以含有LcMSTNlpro-MBP蛋白的溶液來處理大黃魚幼魚
[0067]對(duì)照組為海水直接浸泡，實(shí)驗(yàn)組為浸泡lmg/L的LcMSTNlpro-MBP蛋白的溶液和5mg / L的LcMSTNlpro-MBP蛋白的溶液進(jìn)行投放浸泡實(shí)驗(yàn)。
[0068]通過四個(gè)時(shí)間段(Od，12d，28d，41d)不同處理下對(duì)大黃魚幼魚體重增長(zhǎng)的數(shù)據(jù)記錄分析發(fā)現(xiàn)，浸泡LcMSTNlpro-MBP蛋白的溶液的幼魚比海水浸泡體重增重快，浸泡Img / L LcMSTNlpro-MBP蛋白溶液的實(shí)驗(yàn)魚比對(duì)照組增重速度快7.3%，浸泡5mg/LLcMSTNlpro-MBP蛋白溶液的實(shí)驗(yàn)魚比對(duì)照組增重速度快14.7% (具體數(shù)據(jù)見下表)，增重率與LcMSTNlpro-MBP蛋白的溶液浸泡濃度成正相關(guān)。
【權(quán)利要求】
1.一種促進(jìn)大黃魚生長(zhǎng)的可溶性重組蛋白，其特征在于所述的可溶性重組蛋白的氨基酸序列與SEQ ID N0.2具有95%以上的相似性，優(yōu)選具有99%以上的相似性，進(jìn)一步優(yōu)選為與SEQ ID N0.2的氨基酸序列完全一致。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溶性重組蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)取_80°C的凍存的大黃魚骨骼肌肌肉組織，30mg-50mg組織在液氮中充分研磨至粉末狀，加入Iml Trizol，用槍頭反復(fù)吸打至均勻； (2)肌肉樣品裂解之后置于室溫下5-10min，使得核蛋白和核酸完全分離； (3)加入300μ I氯仿，混勻震蕩15sec，置于室溫5min，然后4°C，1000Orpm下離心15min,漩渦混勻，樣品會(huì)出現(xiàn)三層:上清水相，中層和下層為有機(jī)相，總RNA位于上層水相； (4)將上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入等體積異戊醇，混勻后，置于室溫20min； (5)4°C時(shí)12000rpm下離心lOmin，棄去上清。置于室溫干燥5_10min。用DEPC-H2O配置75%乙醇，通常ImlTrizol需加入lml75%乙醇洗滌沉淀；用槍頭吸出殘液，不要吸到沉淀；室溫晾曬5min ； (6)加入35 μ I RNase-free 的 DEPC-H2O,充分溶解 RNA，置于 _70°C保存； (7)設(shè)計(jì)MSTN-1前肽引物:
上游引物 5 ’ -CCG GAATTCGACCAAGAGACGCACCAG-3，
下游引物 5’ -CCC AAGCTTTCACACCTCCATGAACGGTT-3， 以大黃魚cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系:10Xbuffer5 μ 1，2mMdNTPs5 μ I，25mM MgS043 μ I，模板 cDNA3 μ I，KOD-Plus Neol μ I,加水至 50 μ I,擴(kuò)增程序:預(yù)變性 94°C，2min ;變性 98°C，lOsec，退火，55°C，30sec,延伸 68°C，30sec，進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)，收集擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)為723bp，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1 ； (8)對(duì)目的片段進(jìn)行加a尾； (9)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII酶切pMD19-T以及pMALc2x克隆質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒以及擴(kuò)增的加a尾的目的片段，分別構(gòu)建LcMSTNlpro-pMD19-T以及MSTNlpro-pMAL c2x表達(dá)載體；將所述的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，得到的LcMSTNlpro-MBP蛋白，其分子量為69.56KDa,由625個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溶性重組蛋白在促進(jìn)大黃魚增重中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/495GK103626864SQ201310579015
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】薛良義, 應(yīng)俊 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)