專(zhuān)利名稱(chēng)：人血白蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血液制品的制備方法，特別是涉及一種從人血漿分離的廢棄物組分IV沉淀中提取人血白蛋白的方法。
背景技術(shù)：
人血白蛋白是一種一級(jí)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的單鏈蛋白，其分子量為66250道爾頓(Da)，由585個(gè)殘基構(gòu)成，富含門(mén)冬氨酸及谷氨酸而缺乏色氨酸。白蛋白分子小，表面面積相對(duì)較大，能穿過(guò)毛細(xì)血管壁和細(xì)胞間隙，負(fù)電性強(qiáng)，能與多種分子可逆結(jié)合，故能在血液循環(huán)與各種體液之間傳遞運(yùn)送各種生理活動(dòng)中所需的物質(zhì)。人血白蛋白主要用于因失血、創(chuàng)傷及燒傷等引起的休克，腦水腫及大腦損傷所致的腦壓增高，對(duì)防治低蛋白血癥及肝硬化或腎病引起的水腫或腹水有較好的療效。 現(xiàn)階段臨床上用于治療的白蛋白(除基因工程產(chǎn)品外)全是來(lái)源商業(yè)化的人血漿，以人血漿為起始原料，由于受生產(chǎn)工藝所限，有大量人血白蛋白殘留在組分IV沉淀中，被作為廢物焚燒處理，造成大量資源浪費(fèi)。人血漿作為國(guó)家戰(zhàn)略資源，十分珍貴且資源有限，人血白蛋白作為生命的急救藥品，具有不可替代性作用。為了更好的滿足臨床病人需求，同時(shí)降低該藥品的生產(chǎn)成本，充分利用寶貴的血漿資源，特開(kāi)發(fā)出新的提取工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種人血白蛋白的制備方法，該方法是從人血漿分離的廢棄物組分IV沉淀中提取、純化出安全有效的人血白蛋白，從而可以提高血漿的綜合利用，降低了人血白蛋白的生產(chǎn)成本。本發(fā)明所提供的技術(shù)方案是一種人血白蛋白的制備方法，包括以下步驟I)組分IV沉淀溶解以人血漿分離的廢棄物組分IV沉淀為起始原料，將組分IV沉淀投入O. 0Γ0. 03mol/L、pH值6. 8^7. 4的Tris-HCl緩沖液中得到反應(yīng)液A，調(diào)整反應(yīng)液A的pH為6. 8^7. 4，控制反應(yīng)液A溫度為1°C，攪拌溶解后壓濾分離，得到濾液A ;2)邊攪拌濾液A邊加入分子量為300(Γ4000的聚乙二醇，使聚乙二醇濃度為8 14%(質(zhì)量/體積)，得到反應(yīng)液B，調(diào)整反應(yīng)液B的pH至6. (Γ6. 5，控制反應(yīng)液B溫度為1°C，攪拌混合后靜置沉淀，壓濾分離，得到濾液B ;3)調(diào)整濾液B的pH至5. 5^5. 8，控制濾液B的溫度為1°C，攪拌混合后靜置沉淀，壓濾分離，得到濾液C ;4)邊攪拌濾液C邊加入分子量為300(Γ4000的聚乙二醇，使聚乙二醇濃度為2(Γ25% (質(zhì)量/體積)，得到反應(yīng)液C，調(diào)整反應(yīng)液C的pH至4. 8^5. 2，控制反應(yīng)液C的溫度為-frc，攪拌混合后靜置沉淀，壓濾分離，得到沉淀；5)沉淀用O. Olmol/L.pH值6. 8^7. 4櫞酸鈉-NaCl緩沖液溶解，得到沉淀溶解液，調(diào)節(jié)沉淀溶解液的pH為6. 8 7. 4后進(jìn)行DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析，收集洗脫液進(jìn)行超濾，得到超濾液；
6)收集超濾液，將超濾液中的蛋白濃度稀釋至20% (質(zhì)量/體積)后加入辛酸鈉，使辛酸鈉的濃度為O. 16"O. 18mmol/g蛋白質(zhì)，調(diào)整pH至6. 8 7. O,用除菌濾器過(guò)濾后60±0. 5°C連續(xù)10小時(shí)恒溫巴氏滅活，再次除菌濾器過(guò)濾，得到人血白蛋白成品。本發(fā)明人血白蛋白的制備方法，其中所述超濾所用超濾膜的截留分子量為IOKD。本發(fā)明人血白蛋白的制備方法，其中所述聚乙二醇的分子量為3350。本發(fā)明人血白蛋白的制備方法，其中步驟I中所述Tris-HCl緩沖液體積是組分IV沉淀體積的2 4倍。本發(fā)明人血白蛋白的制備方法，其中步驟I中所述攪拌溶解的時(shí)間為5 8小時(shí)。本發(fā)明人血白蛋白的制備方法，其中所述進(jìn)行DEAE Sepharose fast flow弱陰 離子交換層析時(shí)先用O. Olmol/L O. lmol/L、pH6. 8 7. 4的枸櫞酸鈉-NaCl緩沖液平衡，再用
O.lmol/L O. 3mol/L、pH6. 8 7. 4的枸櫞酸鈉-NaCl緩沖液梯度洗脫。上述方法制備的人血白蛋白，僅與抗人血漿產(chǎn)生沉淀線，與抗馬、牛、豬或羊血漿不產(chǎn)生沉淀線。上述方法制備的人血白蛋白，與正常人血漿比較，主要沉淀線為人血白蛋白。上述方法制備的人血白蛋白，聚乙二醇含量不高于O. 5%,即5g/L,純度應(yīng)不低于蛋白質(zhì)總量的96. 0% (質(zhì)量百分比)。本發(fā)明人血白蛋白的制備方法步驟1-6中，對(duì)pH的調(diào)整均采用常規(guī)的酸堿中和法，采用NaOH水溶液、KOH水溶液或HCl水溶液。本發(fā)明人血白蛋白的制備方法以人血漿中的組分IV沉淀為原料，所用組分IV沉淀應(yīng)符合《中國(guó)藥典》2010年版中關(guān)于“組分IV沉淀原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”。本發(fā)明人血白蛋白的制備方法與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別在于采用血漿分離的廢棄物
組分IV沉淀為原料，提取人血白蛋白，大大提高了寶貴的人血漿的綜合利用能力，高純度
97. 5%的人血白蛋白的回收率可達(dá)到85%以上，提高了經(jīng)濟(jì)效益；采用聚乙二醇法和離子交
換層析法相結(jié)合簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，降低了對(duì)大型設(shè)備低溫高速離心機(jī)的需求，提高經(jīng)濟(jì)效.、
Mo
具體實(shí)施例方式組分IV的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)手段，以下實(shí)施例中所用組分IV沉淀的制備方法包括以下步驟a、原料血漿融化人原料血漿，水浴融化原料血漿，水浴中的水溫控制在37°C以下；b、組分I+II+III的乙醇沉淀及壓濾分離將原料血漿溫度降至0°C以下并加入_15°C以下的乙醇，得到反應(yīng)液，使反應(yīng)液中的乙醇終濃度為20體積％，用pH4. O的醋酸緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至6. 5±0. 3、控制反應(yīng)液溫度在-4. 5^5. 5°C，靜置30分鐘，進(jìn)行壓濾分離，所得沉淀為組分I+II+III沉淀，其是提取免疫球蛋白的起始原料；所得濾液為組分I+II+III濾液；C、組分IV的乙醇沉淀及壓濾分離
將組分I+II+III濾液的pH調(diào)至6. 20±0. 3，加入_15°C以下乙醇至最終乙醇濃度為40體積％，得到反應(yīng)液I，控制反應(yīng)液I的溫度在-4. 5^-5. 5°C，靜置30分鐘，進(jìn)行壓濾分離，收集沉淀即為組分IV沉淀。實(shí)施例Ia、組分IV沉淀溶解以人血漿分離的廢棄物組分IV沉淀為起始原料，組分IV沉淀溶解于O. 01mol/L、pH值6. 8的Tris-HCl緩沖液中得到反應(yīng)液A，其中Tris_HCl緩沖液體積是組分IV沉淀體積的2倍，調(diào)節(jié)反應(yīng)液A的pH至6. 8，控制反應(yīng)液A的溫度為1°C，攪拌溶解5小時(shí)后壓濾分離，得到濾液A ;b、邊攪拌濾液A邊加入分子量為3000的聚乙二醇至其濃度為8質(zhì)量/體積％，得到反應(yīng)液B，調(diào)整反應(yīng)液B的pH至6. 0，控制反應(yīng)液B的溫度為1°C，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，靜置I小時(shí)，壓濾分離，得到濾液B ; C、調(diào)整濾液B的pH至5. 5，控制濾液B的溫度為1°C，繼續(xù)攪拌I小時(shí)，靜置I小時(shí)，壓濾分離，得到濾液C ;d、邊攪拌濾液C邊加入分子量為3000的聚乙二醇至其濃度為20質(zhì)量/體積％，得到反應(yīng)液C，調(diào)整反應(yīng)液C的pH至4. 8，控制反應(yīng)液C的溫度為1°C，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，靜置I小時(shí)，壓濾分離，得到沉淀；e、將沉淀用O. Olmol/L、pH值6. 8枸櫞酸鈉-NaCl緩沖液溶解，得到沉淀溶解液，調(diào)節(jié)沉淀溶解液的pH至6. 8后將其進(jìn)行DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析，用 O. 01mol/L O. lmol/L、pH6. 8 的枸櫞酸鈉-NaCl 緩沖液平衡，0. lmol/L 0. 3mol/L、pH6. 8的枸櫞酸鈉-NaCl緩沖液洗脫，收集洗脫液進(jìn)行超濾，得到超濾液，超濾膜的截留分子量為IOKD0f、收集超濾液，用注射用水將超濾液中的蛋白濃度稀釋至20質(zhì)量/體積％后加入辛酸鈉，使辛酸鈉的濃度為0. 16mmol/g蛋白質(zhì),調(diào)整pH至6. 8 7. O,用除菌濾器過(guò)濾，60±0.5°C連續(xù)10小時(shí)恒溫巴氏滅活，再次除菌濾器過(guò)濾，得到人血白蛋白成品。按上述方法制取三批次的人血白蛋白成品，檢測(cè)蛋白濃度和純度，并計(jì)算蛋白回
收率，結(jié)果如下表
權(quán)利要求
1.一種人血白蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)組分IV沉淀溶解以人血漿分離的廢棄物組分IV沉淀為起始原料，將組分IV沉淀投入O. ΟΓΟ. 03mol/L、pH值6. 8^7. 4的Tris-HCl緩沖液中得到反應(yīng)液A，調(diào)整反應(yīng)液A的pH為6. 8^7. 4，控制反應(yīng)液A溫度為-廣I °C，攪拌溶解后壓濾分離，得到濾液A ; 2)邊攪拌濾液A邊加入分子量為300(Γ4000的聚乙二醇，使聚乙二醇濃度為8 14%(質(zhì)量/體積)，得到反應(yīng)液B，調(diào)整反應(yīng)液B的pH至6. (Γ6. 5，控制反應(yīng)液B溫度為1°C，攪拌混合后靜置沉淀，壓濾分離，得到濾液B ; 3)調(diào)整濾液B的pH至5.5^5. 8，控制濾液B的溫度為1°C，攪拌混合后靜置沉淀，壓濾分離，得到濾液C ; 4)邊攪拌濾液C邊加入分子量為300(Γ4000的聚乙二醇，使聚乙二醇濃度為2(Γ25%(質(zhì)量/體積)，得到反應(yīng)液C，調(diào)整反應(yīng)液C的pH至4. 8^5. 2，控制反應(yīng)液C的溫度為1°C，攪拌混合后靜置沉淀，壓濾分離，得到沉淀； 5)沉淀用O.Olmol/L.pH值6. 8^7. 4櫞酸鈉-NaCl緩沖液溶解，得到沉淀溶解液，調(diào)節(jié)沉淀溶解液的pH為6. 8^7. 4后進(jìn)行DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析,收集洗脫液進(jìn)行超濾，得到超濾液； 6)收集超濾液，將超濾液中的蛋白濃度稀釋至20%(質(zhì)量/體積)后加入辛酸鈉，使辛酸鈉的濃度為O. 16^0. 18mmol/g蛋白質(zhì)，調(diào)整pH至6. 8 7. 0，用除菌濾器過(guò)濾后60±0. 5°C連續(xù)10小時(shí)恒溫巴氏滅活，再次除菌濾器過(guò)濾，得到人血白蛋白成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人血白蛋白的制備方法，其特征在于所述超濾所用超濾膜的截留分子量為10KD。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人血白蛋白的制備方法，其特征在于所述聚乙二醇的分子量為3350。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人血白蛋白的制備方法，其特征在于步驟I中所述Tris-HCl緩沖液體積是組分IV沉淀體積的2 4倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人血白蛋白的制備方法，其特征在于步驟I中所述攪拌溶解的時(shí)間為5 8小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人血白蛋白的制備方法，其特征在于所述進(jìn)行DEAESepharose fast flow弱陰離子交換層析時(shí)先用O. Olmol/L O. lmol/L、pH6. 8 7· 4的枸橡酸鈉-NaCl緩沖液平衡，再用O. lmol/L O. 3mol/L、pH6. 8 7· 4的枸櫞酸鈉-NaCl緩沖液梯度洗脫。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一所述的方法制備的人血白蛋白，其特征在于僅與抗人血漿產(chǎn)生沉淀線，與抗馬、牛、豬或羊血漿不產(chǎn)生沉淀線。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一所述的方法制備的人血白蛋白，其特征在于與正常人血漿比較，主要沉淀線為人血白蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一所述的方法制備的人血白蛋白，其特征在于聚乙二醇含量不高于O. 5%，純度應(yīng)不低于蛋白質(zhì)總量的96. 0%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人血白蛋白的制備方法，該方法是從人血漿分離的廢棄物組分IV沉淀中提取、純化出人血白蛋白，從而可以提高血漿的綜合利用。本發(fā)明包括以下步驟1、將組分IV沉淀溶解后壓濾分離得到濾液A；2、邊攪拌濾液A邊加入聚乙二醇，壓濾分離，得到濾液B；3、調(diào)整濾液B的pH，控制濾液B的溫度，壓濾分離，得到濾液C；4、邊攪拌濾液C邊加入聚乙二醇，得到反應(yīng)液C，壓濾分離，得到沉淀；5、沉淀溶解，進(jìn)行DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析，超濾；6、將超濾液中的蛋白濃度稀釋后加入辛酸鈉，調(diào)整pH至6.8～7.0，除菌過(guò)濾、巴氏滅活，得到人血白蛋白成品。
文檔編號(hào)C07K14/765GK102816230SQ20121030816
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月27日
發(fā)明者邵恒波, 胡輝恒, 鄧?yán)?申請(qǐng)人:同路生物制藥股份有限公司