專利名稱：凝集素及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物、其發(fā)現(xiàn)方法及其治療和研究用途。具體地，本發(fā)明提供了抗病毒和抗微生物的凝集素化合物及其使用方法。
背景技術(shù)：
獲得性免疫缺陷綜合征或后天免疫缺陷綜合征(AIDS或Aids)是由在人中的人免疫缺陷病毒(HIV)(參見例如，Marx，J. L. (1982) Science 217(4560) :618-621 ;通過引用整體并入本文)以及在其他物種中的類似病毒(SIV、FIV、等)引起的對(duì)免疫系統(tǒng)的特定損害所導(dǎo)致的癥狀和感染的總稱。病癥晚期使個(gè)體容易發(fā)生機(jī)會(huì)感染和腫瘤。盡管存在延緩病毒進(jìn)展的針對(duì)AIDS和HIV的治療，但是已知沒有治愈。HIV通過粘膜或血流與含有HIV的體液直接接觸而傳播，所述體液例如血液、精液、陰道液、尿道球腺液和乳汁。這種傳播可以通過肛交、陰道性交或口交、輸血、污染的注射針頭、懷孕、分娩或母乳喂養(yǎng)期間的母嬰交換或者與上述體液之一的其他接觸的形式發(fā)生。在沒有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法時(shí)，從HIV感染發(fā)展成AIDS的中值時(shí)間是9至10年，并且發(fā)生AIDS之后的中值存活時(shí)間只有9. 2個(gè)月(參見例如，Morgan等，(2002) AIDS 16(4)597-632 ;通過引用整體并入本文)。高度活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法的使用延長(zhǎng)了發(fā)展成AIDS的中值時(shí)間和中值存活時(shí)間。目前沒有針對(duì)HIV或AIDS的疫苗或治愈療法。唯一已知的預(yù)防方法是基于避免與病毒接觸，或者如果做不到這點(diǎn)，則在非常明顯的接觸之后立即進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，稱為接觸后預(yù)防(PEP)。PEP具有非常苛刻的四周劑量方案。它還具有非常令人厭惡的副作用，包括腹瀉、不適、惡心和疲勞。需要用于治療HIV和AIDS的改良方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及化合物、其發(fā)現(xiàn)方法及其治療和研究用途。具體地，本發(fā)明提供了抗病毒和抗微生物的凝集素化合物及其使用方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有降低的或低的促有絲分裂性的抗病毒凝集素化合物及其使用方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含BanLec多肽(例如，變體BanLec多肽)(例如，以分離的或純化的形式)的組合物，其中所述BanLec多肽表現(xiàn)出抗病毒活性但是表現(xiàn)出相對(duì)于野生型BanLec降低的促有絲分裂活性(例如，相對(duì)于野生型BanLec或其他凝集素，促有絲分裂活性降低至少10%、至少20%、至少50%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%等)。在一些實(shí)施方案中，例如，BanLec多肽是SEQ ID NO:1-3所描述的多肽，或者由SEQ ID NO :4-6所描述的核酸或其他適合的核酸序列編碼。在一些實(shí)施方案中，BanLec多肽在位置84包含從野生型的突變。在一些實(shí)施方案中，例如，組氨酸84被突變?yōu)樘K氨酸(H84T)、絲氨酸(H84S)或甲硫氨酸(H84M)。在一些實(shí)施方案中，例如，BanLec多肽是SEQ ID NO 7所描述的多肽，或者由SEQ ID NO 8所描述的核酸或其他適合的核酸序列編碼。在一些實(shí)施方案中，BanLec多肽在位置83包含從野生型的突變。在一些實(shí)施方案中，例如，酪氨酸83被突變?yōu)槔i氨酸(Y83V)。在一些實(shí)施方案中，BanLec多肽包含Y83V突變或H84T、H84S和H84M的一個(gè)或多個(gè)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗病毒、抗微生物和/或抗菌的組合物。在一些實(shí)施方案中，本文提供的組合物是全身的、區(qū)域的、局部的等(例如，局部抗病毒組合物)。本發(fā)明的實(shí)施方案提供了包含編碼BanLec多肽的核酸的表達(dá)載體(例如，包含純化標(biāo)簽)以及包含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防病毒(例如，HIV)、細(xì)菌(例如，幽門螺桿菌(helobacter pilori))和/或寄生蟲(例如，嬰兒利什曼原蟲(Leshmania infantum))感染的方法,包括使疑似包含病毒、細(xì)菌或寄生蟲的表面與前述組合物接觸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療被診斷有病毒感染(例如，HIV)、細(xì)菌感染(例如，幽門螺桿菌)和/或寄生蟲感染(例如，嬰兒利什曼原蟲)的 受治療者的方法，包括向受治療者施用前述組合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防病毒感染的組合物和方法，所述病毒包括但不限于HIV、HCV、登革病毒、馬堡病毒(Marburg virus)、依波拉病毒(Ebola virus)、西尼羅河病毒(West Nile virus)、巨細(xì)胞病毒、皰疹病毒(例如，8型)、冠狀病毒(例如，SARS)和麻疹病毒。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防細(xì)菌感染的組合物和方法，所述細(xì)菌包括但不限于結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、牛分支桿菌(Mycobacteriumbovis)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(例如，血清型 3 和14)、幽門螺桿菌和乳酸桿菌(Lactobacillus spp)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防寄生蟲感染的組合物和方法，所述寄生蟲包括但不限于嬰兒利什曼原蟲、皮氏利什曼原蟲(Leshmania pifanoi)、墨西哥利什曼原蟲(Leshmania mexicana)和曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)寄生蟲。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防真菌感染的組合物和方法，所述真菌包括但不限于煙曲霉(Aspergillus fumigatus)和白色念珠菌(Candida albicans)。在一些實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了治療或預(yù)防其表面具有甘露糖的任何微生物的感染的組合物和方法。在一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的組合物(例如，BanLec和/或BanLec突變體)與微生物表面上的甘露結(jié)合糖。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防與DC-SIGN受體相互作用的微生物的感染的組合物和方法。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了 H84T的促有絲分裂活性。圖2顯示了突變體H84S、H84M、H84Y和H84A的促有絲分裂活性。圖3顯示了天然BanLec和重組BanLec的抗HIV-1活性的比較。在HIV-1分離株YU2 (A)或90CF402(B)感染之前30分鐘，向TZM_bl細(xì)胞添加從香蕉果實(shí)分離的天然BanLec或從大腸桿菌分離的重組BanLec。病毒孵育后48小時(shí)，通過測(cè)量熒光素酶活性來定量感染。(C)BanLec與其他凝集素的促有絲分裂活性比較。圖4顯示H84T的性質(zhì)。(A)H84T與rBanLec的促有絲分裂活性比較。(B)如通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的，在BanLec或H84T BanLec存在下⑶4T細(xì)胞上活化標(biāo)記⑶69的誘導(dǎo)。(C)通過Banlec和H84TBanlec誘導(dǎo)細(xì)胞因子/趨化因子。(D)H84T保留抗HIV-1活性。圖5顯示重組BanLec的表達(dá)。重組BanLec的純化的考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠。凝膠泳道如下加樣1 :分子量標(biāo)準(zhǔn)，2 :含有重組BanLec的裂解物，3 :柱負(fù)載穿流，4 :25mM咪唑洗滌，5 :第一次250mM咪唑洗脫，6 :第二次250mM咪唑洗脫，7 :香蕉來源的BanLec,8 :用于細(xì)胞裂解步驟的溶菌酶蛋白。圖6顯示BanLec抑制含有共有亞型B和亞型C包膜的HIV-1。圖7顯示BanLec和BanLec H84T的三維晶體結(jié)構(gòu)的比較。圖8顯示與α -甲基D-甘露糖苷結(jié)合時(shí)，BanLec WT與Η84Τ的結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)的差異。(Α.)未結(jié)合的BanLec (插入，WT和Η84Τ的重疊)和(B.)在α -甲基D-甘露糖苷存在下(插入，WT和Η84Τ的重疊)的1Η-15Ν HSQC光譜的峰強(qiáng)度相關(guān)性。
圖9顯示了變體BanLec肽的序列。定義為了方便理解本發(fā)明，以下定義了許多術(shù)語和短語。如本文使用的，術(shù)語“受治療者”指將通過本發(fā)明的實(shí)施方案的方法治療的生物。此類生物優(yōu)選地包括但不限于哺乳動(dòng)物(例如，鼠、猴、馬、牛、豬、犬、貓等)，并且最優(yōu)選地包括人。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“受治療者”一般指將接受或已經(jīng)接受針對(duì)特征為微生物感染或者微生物感染風(fēng)險(xiǎn)的病癥的治療(例如，施用本發(fā)明的肽和任選一種或多種其他藥劑)的個(gè)體。如本文使用的，術(shù)語“診斷”指通過其體征和癥狀(例如，抵抗傳統(tǒng)療法)或者遺傳分析、生理分析、組織分析、診斷測(cè)定(例如，針對(duì)微生物感染)等識(shí)別疾病。如本文使用的，術(shù)語“體外”指人工環(huán)境以及發(fā)生在人工環(huán)境中的過程或反應(yīng)。體外環(huán)境包括但不限于試管和細(xì)胞培養(yǎng)物。術(shù)語"體內(nèi)"指天然環(huán)境(例如，動(dòng)物或細(xì)胞)和發(fā)生在天然環(huán)境中的過程或反應(yīng)。如本文使用的，術(shù)語“宿主細(xì)胞”指無論是位于體外還是體內(nèi)的任何真核或原核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、禽細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、魚細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞)。如本文使用的，術(shù)語"細(xì)胞培養(yǎng)物"指細(xì)胞的任何體外培養(yǎng)物。該術(shù)語包括連續(xù)傳代細(xì)胞系(例如，具有不變的表型)、原代細(xì)胞培養(yǎng)物、有限細(xì)胞系(例如，非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)和體外維持的任何其他細(xì)胞群，包括卵母細(xì)胞和胚胎。如本文使用的，術(shù)語“有效量”指足以實(shí)現(xiàn)有益或期望結(jié)果的治療劑(例如，本發(fā)明的肽)的量。有效量可以通過一個(gè)或多個(gè)施用、應(yīng)用或劑量來施用，并且不意圖限于特定的制劑或施用途徑。如本文使用的，術(shù)語“聯(lián)合施用”指向受治療者施用至少兩種藥劑(例如，本發(fā)明的肽)或療法。在一些實(shí)施方案中，兩種或多種藥劑/療法的聯(lián)合施用是共時(shí)的。在一些實(shí)施方案中，第一藥劑/療法在第二藥劑/療法之前施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，使用的各種藥劑/療法的制劑和/或施用途徑可以變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定聯(lián)合施用的適當(dāng)劑量。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)聯(lián)合施用藥劑/療法時(shí)，各藥劑/療法以低于適合它們單獨(dú)施用時(shí)的劑量施用。因此，在其中藥劑/療法的聯(lián)合施用降低已知潛在有害(例如，毒性)藥劑的必需劑量的實(shí)施方案中特別需要聯(lián)合施用。如本文使用的，術(shù)語“毒性”指與施用毒劑之前的相同細(xì)胞或組織相比，對(duì)細(xì)胞或組織的任何傷害或有害效應(yīng)。如本文使用的，術(shù)語“藥物組合物”指活性劑與惰性或活性載體的組合，使得組合物特別適合體內(nèi)、體內(nèi)或離體的診斷或治療用途。如本文使用的，術(shù)語“藥學(xué)可接受的載體”指任何標(biāo)準(zhǔn)的藥物載體，例如磷酸鹽緩沖的鹽水溶液、水、乳狀液(例如，油/水或水/油乳狀液)和各種類型的潤(rùn)濕劑。組合物還可以包含穩(wěn)定劑和防腐劑。有關(guān)載體、穩(wěn)定劑和佐劑的實(shí)例(參見例如，Martin，Remington' sPharmaceutical Sciences,第 15 版，Mack Publ. Co. , Easton,PA[1975])。如本文使用的，術(shù)語“樣本”以其最廣泛的含義使用。樣本可以包括細(xì)胞、組織或從細(xì)胞(例如，微生物)分離的液體、核酸或多肽等。如本文使用的，術(shù)語"純化的"或"純化"指從樣本去除不想要的組分。如本文使用的，術(shù)語"基本上純化的"指至少60%、優(yōu)選75%和最優(yōu)選90%或更多沒有通常與之相伴的其他組分。如本文使用的，術(shù)語“調(diào)節(jié)”指化合物(例如，本發(fā)明的化合物)影響(例如，殺傷或防止生長(zhǎng))微生物的活性。"氨基酸序列"和諸如"多肽"或"蛋白質(zhì)"的術(shù)語不意味著將氨基酸序列限于與所提蛋白質(zhì)分子有關(guān)的完全天然的氨基酸序列。如本文使用的，術(shù)語"天然蛋白質(zhì)"指不含由載體序列編碼的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)；即，天然蛋白質(zhì)僅含有該蛋白質(zhì)天然存在時(shí)存在的那些氨基酸。天然蛋白質(zhì)可以通過重組方式產(chǎn)生，或者可以從天然存在的來源分離。如本文使用的，當(dāng)提及蛋白質(zhì)(如在"給定蛋白質(zhì)的一部分"中)時(shí)，術(shù)語"蛋白質(zhì)"指該蛋白質(zhì)的片段。片段大小范圍可以從4個(gè)氨基酸殘基至完整氨基酸序列減去I個(gè)
氨基酸。
術(shù)語“測(cè)試化合物”指可用于治療或預(yù)防身體功能的疾病、不健康狀態(tài)、病態(tài)或疾患或者以其他方式改變樣本(例如，微生物感染)的生理或細(xì)胞狀態(tài)的任何化學(xué)實(shí)體、藥劑、藥物等。測(cè)試化合物包括已知和可能的治療化合物。可以通過利用本發(fā)明的篩選方法來確定測(cè)試化合物是治療性的。“已知的治療化合物”指已經(jīng)顯示(例如，通過動(dòng)物試驗(yàn)或之前施用給人的經(jīng)驗(yàn))在這種治療或預(yù)防中有效的治療化合物。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及化合物、其發(fā)現(xiàn)方法及其治療和研究用途。具體地，本發(fā)明提供了抗病毒和抗微生物的凝集素化合物及其使用方法。稱為BanLec的凝集素分離自香蕉(小果野蕉(Musa acuminate)品種)的成熟果實(shí)，以分子量大約30kDa的二聚體存在。它是木菠蘿相關(guān)凝集素家族(jacalinrelatedlectin family)的成員，并且可以識(shí)別高甘露醇結(jié)構(gòu)。該家族凝集素的特征為存在由三個(gè)希臘鑰匙(Greek Key)轉(zhuǎn)角基序構(gòu)成的β _棱柱I結(jié)構(gòu)。希臘鑰匙I和2都參與結(jié)合糖類，并且含有GXXXD結(jié)合基序，而鑰匙3不含有該結(jié)合基序。然而，該環(huán)可以幫助配體結(jié)合并決定凝集素特異性。BanLec具有許多使它有望發(fā)展成為殺菌劑組分的性質(zhì)，包括高穩(wěn)定性、廣譜的抗HIV活性和在大腸桿菌中生成的能力。此外，BanLec已經(jīng)被許多人經(jīng)常食用，并且這可以導(dǎo)致口服耐受性，證據(jù)是報(bào)道的IgG4抗體對(duì)BanLec的反應(yīng)(致耐受性的)。已經(jīng)顯示BanLec作為抗HIV治療劑或殺菌劑(例如，陰道或直腸殺菌劑)的組分具有治療效用。然而，存在有關(guān)凝集素的促有絲分裂活性和炎性活性的安全性顧慮。在本發(fā)明的實(shí)施方案發(fā)展期間，通過產(chǎn)生BanLec變體H84T而解決了這些顧慮，H84T保留了抗HIV-1活性但展示了非常明顯降低的促有絲分裂活性和促炎活性。BanLec是HIV感染的有效抑制劑，其顯著減少一系列HIV-1分離株的復(fù)制(Swanson等，J. Biol. Chem. 285 :8646(2010);通過引用整體并入本文)。本發(fā)明實(shí)施方案發(fā)展期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證明了 BanLec活性。本發(fā)明的實(shí)施方案提供了改變的BanLec序列(例如，SEQ ID NO :1_6)或其活性片段。改變BanLec的氨基酸序列以降低其促有絲分裂活性，同時(shí)維持有效的抗HIV活性。通過使用可商購的定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?，將突變引入含有編碼BanLec的DNA序列的表達(dá)載體。通過DNA測(cè)序證實(shí)突變，并表達(dá)和純化得到的突變體。然后測(cè)試純化的突變體的促有絲分裂活性。
因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了其中促有絲分裂性已經(jīng)與抗HIV性質(zhì)分開的凝集素。本發(fā)明使用BanLec凝集素示例說明。然而，本發(fā)明不限于BanLec。本發(fā)明的實(shí)施方案提供了具有降低或消除的促有絲分裂性同時(shí)保留有用的治療性質(zhì)的其他凝集素(例如，來自其他物種)。本發(fā)明不限于本文描述的BanLec突變體(例如，SEQ ID NO :1_8)。導(dǎo)致促有絲分裂性降低或減少同時(shí)保留抗病毒性質(zhì)的任何突變包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了表現(xiàn)出相對(duì)于野生型BanLec降低的促有絲分裂活性的變體BanLec多肽(例如，相對(duì)于野生型BanLec或其他凝集素，促有絲分裂活性降低至少10%、至少20%、至少50%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%等)。本文描述的突變體BanLec凝集素可用于多種應(yīng)用。例如，在一些實(shí)施方案中，非促有絲分裂的BanLec多肽(例如，SEQ ID NO 1-3)可用于治療病毒感染(例如，HIV)的治療組合物。在一些實(shí)施方案中，非促有絲分裂的BanLec多肽用于與已知的HIV治療劑組合(例如，作為治療性混合物的部分)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知如何配制這種治療性混合物。在一些實(shí)施方案中，將BanLec組合物(例如，SEQ ID NO :1_3和7)用作局部抗病毒組合物的組分(例如，以殺傷HIV并因此預(yù)防感染)。例如，在一些實(shí)施方案中，BanLec (例如，通過SEQ ID NO :1_3和7所描述的那些)包含在制劑中用作陰道抗病毒劑(例如，與含有或疑似含有HIV的體液(例如，精液)接觸之前或之后使用)。在一些實(shí)施方案中，使用包含BanLec的抗病毒制劑來處理避孕套、性用具或可能與含有HIV或其他致病病毒的體液接觸的其他物體。本發(fā)明不限于HIV的治療或殺傷。因?yàn)锽anLec通過與病毒包膜上的糖結(jié)合而抑制病毒復(fù)制，它可用于預(yù)防或治療人、動(dòng)物和植物的其他病毒感染。在一些實(shí)施方案中，本文描述的組合物不限于抗病毒應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，組合物可用作抗微生物、抗細(xì)菌、抗寄生蟲和抗真菌劑。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防病毒感染的組合物和方法，所述病毒包括但不限于HIV、HCV、登革病毒、馬堡病毒、依波拉病毒、西尼羅河病毒、巨細(xì)胞病毒、皰疫病毒(例如，8型)、冠狀病毒(例如,SARS)和麻疫病毒。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防細(xì)菌感染的組合物和方法，所述細(xì)菌包括但不限于結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、牛分支桿菌、肺炎鏈球菌(例如，血清型3和14)、幽門螺桿菌和乳酸桿菌。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防寄生蟲感染的組合物和方法，所述寄生蟲包括但不限于嬰兒利什曼原蟲、皮氏利什曼原蟲、墨西哥利什曼原蟲和曼氏血吸蟲寄生蟲。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防真菌感染的組合物和方法，所述真菌包括但不限于煙曲霉和白色念珠菌。在一些實(shí)施方案中，組合物可用于治療涉及呈遞適當(dāng)表面糖(例如，甘露糖)的生物的感染。在一些實(shí)施方案中，組合物不限于表面應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，通過藥物領(lǐng)域技術(shù)人員理解的適當(dāng)遞送途徑(例如，靜脈內(nèi)、口服、局部等)施用組合物。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供了藥物組合物(例如，包含上述治療劑的一種或多種)。本發(fā)明的藥物組合物可以多種方式施 用，取決于希望局部治療還是全身治療以及待治療的區(qū)域。施用可以是局部的(包括眼睛和粘膜，包括陰道和直腸遞送)、肺部(例如，通過吸入或吹入粉末或氣溶膠，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和透皮)、口服或胃腸外。胃腸外施用包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)，例如，鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用。用于局部施用(例如，至組織、傷口、器官等)的藥物組合物和制劑可以包括透皮貼片、軟膏、洗劑、乳霜、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末。常規(guī)藥物載體、水性、粉末或油性基底、增稠劑等可能是必要或所需的?？诜┯玫慕M合物和制劑包括粉末或顆粒、水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠囊、小袋或片劑。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可能是需要的。用于胃腸外、鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用的組合物和制劑可以包括無菌水溶液，其還可以含有緩沖劑、稀釋劑和其他適當(dāng)添加劑，例如但不限于滲透增強(qiáng)劑、載體化合物和其他藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳液和含有脂質(zhì)體的制劑。這些組合物可以從多種組分產(chǎn)生，包括但不限于預(yù)制液體、自乳化固體和自乳化半固體?？梢猿Ｒ?guī)以單位劑量形式存在的本發(fā)明藥物組合物可以根據(jù)制藥行業(yè)熟知的常規(guī)技術(shù)制備。此類技術(shù)包括使活性成分與藥物載體或賦形劑結(jié)合的步驟。一般而言，通過使活性成分與液體載體或細(xì)碎固體載體或兩者均勻且緊密地結(jié)合，然后如果必要?jiǎng)t使產(chǎn)物成形，來制備制劑。本發(fā)明組合物還可以包含常規(guī)存在于藥物組合物中的其他佐劑組分。因此，例如，組合物可以含有其他相容的藥物活性材料，例如止癢劑、止血?jiǎng)?、局部麻醉劑或抗炎劑，或者可以含有用于物理上配制本發(fā)明組合物的各種劑型的其他材料，例如染料、調(diào)味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。然而，此類材料在添加時(shí)不應(yīng)該不當(dāng)?shù)馗蓴_本發(fā)明組合物的組分的生物活性。制劑可以被滅菌，并且如果需要可以與不會(huì)有害地與制劑的活性劑相互作用的輔助劑混合，所述輔助劑例如潤(rùn)滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑、香料和/或芳香物質(zhì)等。給藥取決于待治療的疾病狀態(tài)或病癥的嚴(yán)重程度和響應(yīng)性，療程持續(xù)數(shù)天至數(shù)月，或者直至實(shí)現(xiàn)治愈或者實(shí)現(xiàn)疾病狀態(tài)的減輕。在一些實(shí)施方案中，以一個(gè)或多個(gè)療程施用治療，其中每個(gè)療程包括每天一個(gè)或多個(gè)劑量，持續(xù)數(shù)天(例如，1、2、3、4、5、6)或數(shù)周(例如，1、2或3周等)。在一些實(shí)施方案中，療程被相繼施用(例如，療程間沒有間隔)，而在其他實(shí)施方案中，療程之間提供了 I或多日、周或月的間隔。在一些實(shí)施方案中，在進(jìn)行或維持基礎(chǔ)上提供治療(例如，提供多個(gè)療程，有或沒有不定時(shí)段的間隔)。最佳給藥方案可以從患者體內(nèi)藥物累積的測(cè)量值來計(jì)算。主治醫(yī)師可以容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)率。在一些實(shí)施方案中，劑量從O. 01 μ g至IOOg每kg體重，并且可以每天、每周、每月或每年給予一次或多次。治療醫(yī)師可以基于藥物在體液或組織中測(cè)量的停留時(shí)間和濃度來估計(jì)給藥的重復(fù)率。實(shí)驗(yàn)提供以下實(shí)施例以證明和進(jìn)一步示例說明本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案和方面，并且不應(yīng)被解釋為限制其范圍。
實(shí)施例1為了確定BanLec的抗HIV活性，將不同濃度的凝集素在與各種HIV-1分離株感染之前與TZM-bl指示細(xì)胞孵育?？疾炝?BanLec抑制幾種不同的HIV-1分離株的能力。病毒克隆81A-4和NL(AD8)都是NL4-3的衍生物，其中一部分包膜與分別來自R5 HIV-1分離株BaL或ADA的包膜區(qū)交換。81A-4和NL(AD8)利用CCR5作為細(xì)胞共受體(R5嗜性)，而NL4-3利用CXCR4作為細(xì)胞共受體(X4嗜性)。這些分離株允許評(píng)估不同HIV-1包膜對(duì)BanLec的敏感性，同時(shí)保持NL4-3病毒組分的其余部分不變。還評(píng)估了雙嗜性分離株89. 6對(duì)BanLec的易感性。觀察到針對(duì)不同嗜性的病毒分離株以低納摩爾范圍內(nèi)計(jì)算的IC5tl值的劑量依賴性的病毒感染抑制。還使用HIV-1指示細(xì)胞系MAG1-CCR5進(jìn)一步證實(shí)了 BanLec的抗HIV活性。利用該細(xì)胞系，測(cè)定了 BanLec抑制實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)的分離株BaL(R5)和Bru(X4)以及原代分離株ASM44 (R5X4)和ASM 54 (R5X4)感染的能力，并且確定全部受BanLec抑制。R5嗜性病毒是性傳播HIV-1中發(fā)現(xiàn)的主要形式。為了確定BanLec是否能夠抑制來自不同進(jìn)化枝的其他原代分離株，測(cè)試了 BanLec對(duì)具有源自亞型B和C的原代分離株的包膜的假型HIV-1的抑制。這些亞型常見于北美洲和中美洲(亞型B)和非洲和印度的部分(亞型C)。觀察到BanLec對(duì)病毒復(fù)制的有效的亞納摩爾濃度抑制。噬菌體易感于HIV-1感染并且可以變成不能被高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法清除的病毒貯庫。陰道噬菌體在HIV-1致病中的作用還沒有被完全表征，但最近證據(jù)指示，這些細(xì)胞容許HIV-1感染。測(cè)定了 BanLec抑制MDM的HIV-1感染的能力。經(jīng)15天的時(shí)段，納摩爾濃度的BanLec抑制了 MDM中的HIV復(fù)制。而且，如通過在第15天進(jìn)行的MTT測(cè)定所測(cè)定的，BanLec對(duì)細(xì)胞活力無影響；因此，該影響不是由于細(xì)胞毒性。當(dāng)BanLec在培養(yǎng)上清液中保持7天而沒有改變培養(yǎng)基或添加額外凝集素時(shí)，BanLec對(duì)HIV-1復(fù)制抑制的IC5tl值是9. 72nM，證明37°C下BanLec在長(zhǎng)期培養(yǎng)體系中保持為有效且穩(wěn)定的抑制劑。測(cè)試了 BanLec阻止PBL中的HIV-1細(xì)胞進(jìn)入的能力。預(yù)計(jì)BanLec與HIV-1包膜上存在的高甘露糖結(jié)構(gòu)結(jié)合，防止進(jìn)入并由此防止感染。如果是這樣，當(dāng)細(xì)胞在BanLec存在下接觸HIV-1時(shí)，應(yīng)該檢測(cè)到很少或沒有早期HIV-1逆轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)終止DNA產(chǎn)物。在不同濃度BanLec存在下將PBL與HIV-1 Bru分離株孵育。作為陽性對(duì)照和用于比較，平行進(jìn)行了使用凝集素GNA的類似實(shí)驗(yàn)。使用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)強(qiáng)終止DNA，強(qiáng)終止DNA是可以在病毒進(jìn)入之后、在病毒脫殼發(fā)生之前早期檢測(cè)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。通過用DNA酶I處理來去除病毒原液中可能已經(jīng)存在的強(qiáng)終止DNA，以消除逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的假檢測(cè)。以低凝集素濃度的BanLec處理導(dǎo)致強(qiáng)終止DNA的明顯減少，指示BanLec除了抑制MDM中的病毒復(fù)制外，還阻止PBL中的HIV-1感染。而且，這種抑制在早期復(fù)制事件之前的步驟、在病毒進(jìn)入的水平上發(fā)生。已知BanLec與甘露糖結(jié)合，并且 因此假設(shè)BanLec結(jié)合糖基化gpl20包膜蛋白上存在的高甘露糖結(jié)構(gòu)并且阻止HIV-1進(jìn)入細(xì)胞。使用基于BanLec的ELISA來測(cè)量糖基化HIV-1 gpl20與BanLec的結(jié)合。觀察到BanLec以濃度依賴性方式與gpl20結(jié)合。而且，已知的BanLec配體甲基- a -D甘露吡喃糖苷以濃度依賴性方式抑制這種結(jié)合。因?yàn)镠IV-1包膜蛋白上高密度的糖類殘基，高濃度的甲基- a -D甘露吡喃糖配體是競(jìng)爭(zhēng)與gpl20結(jié)合所需的。使用基于ELISA的測(cè)定來測(cè)定BanLec阻止單克隆抗體2G12結(jié)合的能力。2G12識(shí)別對(duì)于抗體識(shí)別而言關(guān)鍵的位置Asn-295、-332和-392 (位置編號(hào)具有HXB2參考序列)處的N連接糖基化結(jié)構(gòu)簇。發(fā)現(xiàn)，用BanLec預(yù)處理gpl20以劑量依賴方式抑制了 2G12的識(shí)別，指示BanLec能夠與由高甘露糖結(jié)構(gòu)組成的該抗體表位結(jié)合。為了進(jìn)一步考察BanLec在病毒生命周期的哪個(gè)階段抑制HIV-1感染，測(cè)試了BanLec抑制附著后的HIV-1感染的能力。為此，測(cè)試了 BanLec是否能夠抑制已經(jīng)與細(xì)胞結(jié)合但由于溫度限制而未能完成融合的HIV-1。在附著后測(cè)定中觀察到HIV-1附著抑制劑CD4-1gG2的抑制活性的大大減少，而結(jié)合的病毒依然對(duì)融合抑制劑T-20基本上完全易感。這證明在16°C發(fā)生病毒附著而非融合。CCR5結(jié)合抑制劑maraviroc和BanLec都主要是通過抑制HIV-1附著而阻止病毒復(fù)制，但是各自對(duì)病毒融合具有適度影響。改變BanLec的氨基酸序列以降低其促有絲分裂活性，同時(shí)維持有效的抗HIV活性。通過使用可商購的定點(diǎn)誘變?cè)噭┖卸鴮⑼蛔円牒芯幋aBanLec的DNA序列的表達(dá)載體。通過DNA測(cè)序證實(shí)了突變，并且表達(dá)并純化得到的突變體。然后測(cè)試純化的突變體的促有絲分裂活性。還測(cè)試了突變體的抗HIV活性并與野生型形式的活性比較。在用含有共有的亞型C包膜的假型HIV-1感染之前，用不同濃度的野生型或突變體形式的BanLec預(yù)處理TZM_bl細(xì)胞。通過測(cè)量響應(yīng)感染而產(chǎn)生的報(bào)告基因活性來定量感染。通過非線性回歸測(cè)定突變體和野生型序列的IC5tl值。用突變體的IC5tl值除以野生型BanLec蛋白的IC5tl，測(cè)定了突變體的抗HIV活性的倍減。通過將BanLec的位置84的氨基酸組氨酸突變?yōu)榘被崽K氨酸(H84T)、絲氨酸(H84S)或甲硫氨酸(H84M)而實(shí)現(xiàn)了促有絲分裂活性的降低(圖1&2)。并非所有突變導(dǎo)致該表型；用丙氨酸(H84A)或酪氨酸(H84Y)取代組氨酸84不導(dǎo)致促有絲分裂活性的減少。突變體H84T、H84S和H84M的抗HIV活性減少，但是他們保持納摩爾范圍內(nèi)的有效的IC5tl值。此外，抗HIV活性的倍減明顯小于促有絲分裂活性的減少(表I)。圖1顯示了 H84T的促有絲分裂活性。通過測(cè)量外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的增殖來評(píng)估促有絲分裂活性。從健康供體分離PBL。將細(xì)胞與不同濃度的凝集素或作為對(duì)照的PBS孵育。細(xì)胞被孵育3天，并且然后向培養(yǎng)物添加BrdU。增殖細(xì)胞加入BrdU，并且然后通過抗BrdU ELISA定量。對(duì)于定量，將促有絲分裂活性表示為刺激指數(shù)。這是治療樣本除以PBS治療對(duì)照的值。通常，如果刺激指數(shù)大于3 (下虛線)則認(rèn)為凝集素是促有絲分裂的。然而，觀察到了 griffithsin超過3的值。因?yàn)橐呀?jīng)報(bào)道了這是非促有絲分裂的，10被用作截止值，因?yàn)間riffithsin在除一例以外的所有情況下未超過該閾值。rBanLec代表克隆的野生型BanLec，而H84T代表其中組氨酸84已變?yōu)樘K氨酸的克隆的BanLec。圖2顯示了突變體H84S、H84M、H84Y和H84A的促有絲分裂活性。如圖1所述，評(píng)價(jià)了促有絲分裂活性。rBanLec代表克隆的野生型BanLec，而H84S、H84M、H84Y和H84A分別代表其中組氨酸84已變?yōu)榻z氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸或丙氨酸的克隆的BanLec。表I提供示例性BanLec突變體的抗病毒活性和促有絲分裂活性的總結(jié)。表I =BanLec突變體的抗HIV活性和促有絲分裂活性的總結(jié)
權(quán)利要求
1.一種包含變體BanLec多肽的組合物，其中所述變體BanLec多肽表現(xiàn)出抗病毒或抗微生物活性，并且其中所述BanLec多肽表現(xiàn)出相對(duì)于野生型BanLec多肽降低的促有絲分裂活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述變體BanLec多肽選自由SEQID N0:l_3組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述變體BanLec多肽由選自由SEQID NO :4_6組成的組的核酸編碼。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述變體BanLec多肽具有SEQID NO 7的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述變體BanLec多肽由SEQID NO :8的核酸編碼。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物是抗病毒、抗微生物、抗真菌和/或抗寄生蟲的藥物組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物治療或預(yù)防呈遞表面甘露糖的微生物的感染。
8.一種治療和/或預(yù)防微生物感染的方法，所述方法包括施用根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述組合物是局部施用的。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述組合物全身地治療和/或預(yù)防所述感染。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述感染由包含表面甘露糖的微生物引起。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述微生物是病毒、細(xì)菌、寄生蟲或真菌。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述病毒是HIV。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中將所述組合物施用給被診斷有感染的受治療者。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中將所述組合物施用給處于感染風(fēng)險(xiǎn)的受治療者。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中將所述組合物施用給疑似有感染的受治療者。
17.—種表達(dá)載體，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物的核酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體還包含蛋白質(zhì)純化標(biāo)簽。
19.一種宿主細(xì)胞,其包含根據(jù)權(quán)利要求18所述的表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及化合物、其發(fā)現(xiàn)方法及其治療和研究用途。具體地，本發(fā)明提供了從香蕉分離的抗病毒和抗微生物的凝集素化合物(BanLec)。這些化合物具有低的促有絲分裂性和促炎活性同時(shí)保持抗HIV-1活性。
文檔編號(hào)C07K14/47GK103025756SQ201180029440
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月14日
發(fā)明者D.馬科維奇, M.斯萬森, I.戈德斯坦, H.溫特 申請(qǐng)人:密執(zhí)安大學(xué)評(píng)議會(huì)