專利名稱：蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的純化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于一種蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的純化方法。
背景技術：
蠶蛹是人類的一種新營養(yǎng)源，是衛(wèi)生部批準的作為普通食品管理的食品新資源名單中唯一的昆蟲類食品。蠶蛹具有極高的營養(yǎng)價值，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素。食用蠶蛹對膽固醇酯化，降低血中膽固醇和甘油三酯；降低血液粘稠度，改善血液微循環(huán)有一定的功效。但目前，市場上基本還未出現(xiàn)以蠶蛹中有效成分作為藥物開發(fā)的產(chǎn)品，缺乏這些天然成分的的純化方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是設計一種蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的純化方法，能利用蠶蛹作為原料，通過分離純化獲得具有降低血液粘稠度，改善血液微循環(huán)的天然藥用蛋白，該方法操作簡便，且產(chǎn)量高，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，提純的天然蛋白可作為保健藥物，無毒副作用。為此，本發(fā)明的包括下步驟(1)蠶蛹預處理，將新鮮蠶蛹與預冷的PBS液，溫度1 5°C，pH值為7. 4，按重量比1 1加入到榨汁機中勻漿30sec，在冰上冰浴4 8min，繼續(xù)勻漿，重復三次，使蠶蛹中的蛋白充分溶解，將所得品轉(zhuǎn)移到離心杯中4°C，12000rpm離心20min，取上清液通過九層紗布過濾除去大顆粒不溶雜質(zhì)，將濾液再次離心過濾，重復三次，收集過濾后的濾液4°C，60 %硫酸銨沉淀蛋白，去除油脂，8000rpm離心30min，棄上清，用預冷的PBS液重懸沉淀，0. 45 μ m濾膜真空抽濾，得預處理上清液，4°C保存；(2)人生長激素類似脂蛋白的初步分離，選擇AKTA explorer 10中的Size Exclusion對預處理上清液進行分離并脫去色素，流動相為PBS液，pH值為7. 4，壓力 0. 5Mpa，流速1. 5ml/min ；程序結(jié)束后，共出現(xiàn)6個蛋白吸收峰，根據(jù)目的出峰時間判斷第5 和第6號蛋白吸收峰為17kDa以下的色素及小分子物質(zhì)，人生長激素類似脂蛋白，分子量 30kDa,應出現(xiàn)在第4號峰，因此收集前面4個蛋白吸收峰，并進行SDS-PAGE電泳和Wfestern Blot檢測，結(jié)果表明人生長激素類似脂蛋白存與第4號蛋白峰中，用4號蛋白吸收峰的所得品進行后續(xù)純化；(3)親和層析純化，用4號蛋白吸收峰的所得品進行親和層析純化，親和層析柱的制備取2mL 50%的Plus coupling Resin裝入柱殼中，平衡至室溫， 放出殘余液體，加入 3 倍柱體積 Coupling Buffer,0. IM Sodium phosphate,0. 15M NaCl, pH值為7. 2，平衡柱子，之后加入2mL hGH標準品lmg/ml和40 μ L Cyanoborohy dride，室溫下?lián)u床孵育4h或4°C保持7 9h，在通風櫥里打開蓋子，收集放出的液體，用BCA蛋白定量，計算偶聯(lián)效率；再加入5倍柱體積Quenching Buffer, IM Tris-HCl，pH值為7. 4，0. 05% NaN3,洗填料，之后加入 2mL Quenching Buffer 和 40 μ L Cyanoborohy dride，室溫下?lián)u床孵育30min ；在通風櫥打開蓋子放出反應的氣體和溶液，加入5倍體積Wash Solution, IM NaCl，0.05% Na^洗柱子；再用Coupling Buffer平衡柱子，4°C保存；
親和純化人生長激素類似脂蛋白，室溫平衡柱子，之后打開蓋子棄去保護液，用5 倍柱體積的Binding Buffer, 0. 15M PBS, pH值為7. 4，再次平衡柱子；所得品經(jīng)過0. 45 μ m 濾膜過濾后上柱，室溫搖床孵育lh，放出溶液，用Wash Buffer, 0. 15M PBS，pH7. 4，洗去未結(jié)合樣品，最后加入Elution Buffer (0. IM Glycine-HCl，pH值為2. 5，洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白，用 Neutralization Buffer,0. 5M Tris_HCl，pH值為 8. 5，調(diào) pH值至中性；收集樣品， BCA蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳檢測；(4)超濾濃縮，使用中空纖維膜進行超濾，選擇合適的中空纖維膜規(guī)格，截留分子量為3kDa，進行清洗后加樣，用適量無菌PBS，pH值為7. 4，超濾濃縮，無菌分裝，_50°C冷凍干燥，制成凍干粉，得本發(fā)明的成品。所述的親和層析純化是用4號蛋白吸收峰的所得品進行親和層析純化。上述方法實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明的優(yōu)點是能利用蠶蛹作為原料，通過分離純化獲得具有降低血液粘稠度， 改善血液微循環(huán)的天然藥用蛋白，該方法操作簡便，且產(chǎn)量高，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，提純的天然蛋白可作為保健藥物，無毒副作用。


圖1(1)、(2)和圖2是蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的初步分離圖。其中M.為低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標準；1.總蠶蛹蛋白樣品；2. 1#吸收峰蛋白樣品； 3. 2#吸收峰蛋白樣品；4. 3#吸收峰蛋白樣品；5. 4#吸收峰蛋白樣品。圖3是蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的Western Blot檢測圖。其中M.為低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標準；1. 4#吸收峰蛋白樣品；3.純化樣品。圖4和圖5是K562細胞體外檢測人生長激素類似脂蛋白促生長作用比較圖。
具體實施例方式如圖1至圖5所示，一種蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的純化方法。包括下步驟 ⑴蠶蛹預處理，將新鮮蠶蛹與預冷的PBS液，溫度1 5°C，pH值為7. 4，按重量比1 1 加入到榨汁機中勻漿30sec，在冰上冰浴4 8min，繼續(xù)勻漿，重復三次，使蠶蛹中的蛋白充分溶解。所得品轉(zhuǎn)移到離心杯中4°C，12000rpm離心20min，取上清液通過九層紗布過濾除去大顆粒不溶雜質(zhì)，將濾液再次離心過濾，重復三次。收集過濾后的濾液4°C，(重量比)60%硫酸銨沉淀蛋白，去除油脂，SOOOrpm離心30min，棄上清，用預冷的PBS液重懸沉淀，0.45μπι濾膜真空抽濾，得預處理上清液，4°C保存。( 人生長激素類似脂蛋白的初步分離，選擇AKTA explorerlO中的Size Exclusion對預處理上清液進行分離并脫去色素， 流動相為PBS液，pH值為7. 4，壓力0. 5Mpa，流速1. 5ml/min ；程序結(jié)束后，共出現(xiàn)6個蛋白吸收峰，根據(jù)目的出峰時間判斷第5和第6號蛋白吸收峰為17kDa以下的色素及小分子物質(zhì)，人生長激素類似脂蛋白，分子量30kDa，應出現(xiàn)在第4號峰，因此收集前面4個蛋白吸收峰，并進行SDS-PAGE電泳和Western Blot檢測，結(jié)果表明人生長激素類似脂蛋白存與第4號蛋白峰中，用4號蛋白吸收峰的所得品進行后續(xù)純化。(3)親和層析純化，用4號蛋白吸收峰的所得品進行親和層析純化。親和層析柱的制備取2mL 50%的Plus coupling Resin裝入柱殼中，平衡至室溫，放出殘余液體，加入3倍柱體積Coupling Buffer,0. IM Sodium phosphate, 0. 15M NaCl，pH值為 7. 2，平衡柱子，之后加入 2mL hGH標準品 lmg/ml 和 40 μ L Cyanoborohy dride，室溫下?lián)u床孵育4h或4°C保持7 9h，在通風櫥里打開蓋子， 收集放出的液體，用BCA蛋白定量，計算偶聯(lián)效率；再加入5倍柱體積Quenching Buffer, IM Tris-HCl，pH 值為 7· 4，0· 05% NaN3,洗填料，之后加入 2mL Quenching Buffer 禾口 40 μ L Cyanoborohy dride，室溫下?lián)u床孵育30min ；在通風櫥打開蓋子放出反應的氣體和溶液，加入 5 倍體積 Wash Solution，IMNaCl，0· 05% NaN3 洗柱子；再用 Coupling Buffer 平衡柱子， 4°C保存。親和純化人生長激素類似脂蛋白，室溫平衡柱子，之后打開蓋子棄去保護液，用5 倍柱體積的Binding Buffer, 0. 15M PBS, pH值為7. 4，再次平衡柱子；所得品經(jīng)過0. 45 μ m 濾膜過濾后上柱，室溫搖床孵育lh，放出溶液，用Wash Buffer, 0. 15M PBS，pH7. 4，洗去未結(jié)合樣品，最后加入Elution Buffer (0. IM Glycine-HCl，pH值為2. 5，洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白，用 Neutralization Buffer,0. 5M Tris_HCl，pH值為 8. 5，調(diào) pH值至中性；收集樣品， BCA蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳檢測。(4)超濾濃縮，使用中空纖維膜進行超濾，選擇合適的中空纖維膜規(guī)格，截留分子量為3kDa，進行清洗后加樣，用適量無菌PBS，pH值為7.4， 超濾濃縮，無菌分裝，_50°C冷凍干燥，制成凍干粉，得本發(fā)明的成品。所述的親和層析純化是用4號蛋白吸收峰的所得品進行親和層析純化。本發(fā)明的保存及檢測是將所得品無菌分裝，-50°C冷凍干燥，制成凍干粉。12% SDS-PAGE跑電泳，檢測樣品，在30kDa處有目的蛋白的條帶。本發(fā)明的生物活性鑒定是取凍干后的0. 5mg樣品溶于ImlPBS緩沖液中(0. 5mg/ ml)用Cy5標記蛋白，尾靜脈注射小鼠，24h后檢測血脂含量。通過K562細胞體外檢測其促生長作用。從圖1可看出，其中圖1(1)為參考曲線圖，圖1(2)為實驗數(shù)據(jù)圖，蠶蛹蛋白組分經(jīng)蛋白純化系統(tǒng)處理后，得到了很好的分離效果，共得到6個蛋白吸收峰，根據(jù)參考曲線已知分子量樣品出峰時間判斷，實驗組中4號峰樣品分子量大小介于17-43kDa之間，5號6號峰為17kDa以下的小分子物質(zhì)。從圖2可看出分子量為30kDa左右的蛋白群得到了很好的分離，主要集中在4號蛋白峰上。從圖3可看出人生長激素類似脂蛋白分布在4號蛋白峰中，且分子量為30kDa，在天然狀態(tài)下是以單體形式存在。從圖4可看出經(jīng)過親和層析純化后，可得到高純度的人生長激素類似脂蛋白從圖5可看出，選用K562細胞體外檢測系統(tǒng)檢測人生長激素類似脂蛋白的促生長作用，以人生長激素作為陽性對照，3天后測得給藥劑量為200ng/ml濃度時K562細胞明顯擴增，其效果為人生長激素對照組的一半?？傊?，本發(fā)明能利用蠶蛹作為原料，通過分離純化獲得具有降低血液粘稠度，改善血液微循環(huán)，促生長的天然藥用蛋白，該方法操作簡便，且產(chǎn)量高，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，提純的天然蛋白無毒副作用，可作為保健藥物開發(fā)，彌補市場該領域的空白。
權(quán)利要求
1.一種蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的純化方法，其特征在于包括下步驟，(1)蠶蛹預處理，將新鮮蠶蛹與預冷的PBS液，溫度1 5°C，PH值為7.4，按重量比 1 1加入到榨汁機中勻漿30sec，在冰上冰浴4 8min，繼續(xù)勻漿，重復三次，使蠶蛹中的蛋白充分溶解，將所得品轉(zhuǎn)移到離心杯中4°C，12000rpm離心20min，取上清液通過九層紗布過濾除去大顆粒不溶雜質(zhì)，將濾液再次離心過濾，重復三次，收集過濾后的濾液4°C，60%硫酸銨沉淀蛋白，去除油脂，SOOOrpm離心30min，棄上清， 用預冷的PBS液重懸沉淀，0. 45 μ m濾膜真空抽濾，得預處理上清液，4°C保存；(2)人生長激素類似脂蛋白的初步分離，選擇AKTAexplorerlO中的Size Exclusion 對預處理上清液進行分離并脫去色素，流動相為PBS液，pH值為7. 4，壓力0. 5Mpa,流速 1. 5ml/min ；程序結(jié)束后，共出現(xiàn)6個蛋白吸收峰，根據(jù)目的出峰時間判斷第5和第6號蛋白吸收峰為17kDa以下的色素及小分子物質(zhì)，人生長激素類似脂蛋白，分子量30kDa，應出現(xiàn)在第4號峰，因此收集前面4個蛋白吸收峰，并進行SDS-PAGE電泳和flfestern Blot檢測， 結(jié)果表明人生長激素類似脂蛋白存與第4號蛋白峰中，用4號蛋白吸收峰的所得品進行后續(xù)純化；(3)親和層析純化，用4號蛋白吸收峰的所得品進行親和層析純化，親和層析柱的制備取2mL 50%的Plus coupling Resin裝入柱殼中，平衡至室溫，放出殘余液體，加入3倍柱體積 Coupling Buffer,0. IM Sodium phosphate,0· 15M NaCl，pH 值為 7. 2，平衡柱子，之后加入2mL hGH標準品lmg/ml和40 μ L Cyanoborohy dride,室溫下?lián)u床孵育4h或4°C保持 7 9h，在通風櫥里打開蓋子，收集放出的液體，用BCA蛋白定量，計算偶聯(lián)效率；再加入5 倍柱體積 Quenching Buffer, IM Tris-HCl，pH值為 7. 4,0. 05% NaN3，洗填料，之后加入 2mL Quenching Buffer和40 μ L Cyanoborohy dride，室溫下?lián)u床孵育30min ；在通風櫥打開蓋子放出反應的氣體和溶液，加入5倍體積Wash Solution, IM NaCl，0.05% NaR洗柱子；再用Coupling Buffer平衡柱子，4°C保存；親和純化人生長激素類似脂蛋白，室溫平衡柱子，之后打開蓋子棄去保護液，用5倍柱體積的Binding Buffer, 0. 15M PBS，pH值為7. 4，再次平衡柱子；所得品經(jīng)過0. 45 μ m濾膜過濾后上柱，室溫搖床孵育lh，放出溶液，用Wash Buffer, 0. 15M PBS，pH7. 4，洗去未結(jié)合樣品，最后加入Elution Buffer (0. IMGlycine-HCl, pH值為2. 5，洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白， 用 Neutralization Buffer, 0. 5M Tris-HCl，pH值為 8· 5，調(diào) pH值至中性；收集樣品，BCA 蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳檢測；(4)超濾濃縮，使用中空纖維膜進行超濾，選擇合適的中空纖維膜規(guī)格，截留分子量為 3kDa,進行清洗后加樣，用適量無菌PBS，pH值為7. 4，超濾濃縮，無菌分裝，_50°C冷凍干燥， 制成凍干粉，得本發(fā)明的成品。
2.按權(quán)利要求1所述的蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的純化方法，其特征在于所述的親和層析純化是用4號蛋白吸收峰的所得品進行親和層析純化。
全文摘要
本發(fā)明屬于一種蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的純化方法，方法包括蠶蛹預處理，人生長激素類似脂蛋白的初步分離，用4號蛋白吸收峰的所得品進行親和層析純化和超濾濃縮等步驟。本發(fā)明能利用蠶蛹作為原料，通過分離純化獲得具有降低血液粘稠度，改善血液微循環(huán)的天然藥用蛋白，該方法操作簡便，且產(chǎn)量高，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，提純的天然蛋白可作為保健藥物，無毒副作用。
文檔編號C07K1/22GK102424701SQ201110309518
公開日2012年4月25日 申請日期2011年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月13日
發(fā)明者葉曼, 張耀洲, 陳劍清, 陳昊 申請人:天津耀宇生物技術有限公司