專(zhuān)利名稱(chēng)：抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療牛乳房炎的 產(chǎn)品，尤其是涉及一種不產(chǎn)生耐藥性的可有效預(yù)防和治療各種細(xì)菌、真菌和霉形體以及病毒引發(fā)的牛乳房炎的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY。
背景技術(shù)：
奶牛乳房炎是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)而又最難防治的奶牛疾病之一。目前全世界約有2. 2億頭奶牛，其中1/3患有各種類(lèi)型的乳房炎。據(jù)統(tǒng)計(jì)，臨床型乳房炎占奶牛總發(fā)病的2成多，一般造成產(chǎn)奶量下降，乳液廢棄，嚴(yán)重時(shí)，患牛乳區(qū)腫脹硬化、化膿、壞疽甚至萎縮，失去泌乳能力，被迫淘汰，每年因乳房炎而最終淘汰的病牛約占總淘汰率的10%。在所有的牛乳房炎中，隱性乳房炎在奶牛群中最普遍，在一個(gè)牛群中，大多數(shù)乳房炎(大約90%)是隱性型。因此，造成經(jīng)濟(jì)損失的主要是隱性乳房炎，其損失占每頭泌乳母牛每年總生產(chǎn)能力的10% 11% [。即使在飼養(yǎng)水平較高的發(fā)達(dá)國(guó)家，隱性乳房炎的發(fā)病率也在50%以上。因此，給世界各國(guó)以及我國(guó)的乳牛業(yè)造成相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，全球?qū)δ膛Ｈ榉垦灼毡椴捎每股剡M(jìn)行治療。但是，使用抗生素治療一方面會(huì)造成牛乳中抗生素殘留，另一方面會(huì)誘發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，使抗生素失效，造成慢性乳房炎特別是隱性乳房炎比例越來(lái)越來(lái)大。而且，抗生素只對(duì)細(xì)菌性乳房炎有一定療效，對(duì)由真菌和霉形體以及病毒引起的牛乳房炎是無(wú)效的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種不產(chǎn)生耐藥性的可有效預(yù)防和治療各種細(xì)菌、真菌和霉形體以及病毒引發(fā)的牛乳房炎的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的，一種抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法，包括以下步驟(SI)、制取不同類(lèi)的牛乳房炎致病微生物抗原分別按致病微生物的分類(lèi)培養(yǎng)并純化一種或任意幾種同類(lèi)不同種的致病微生物，按任意比例混合均勻，然后加以超聲粉碎；最后按重量1-10 : 10-1的重量比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以8，000-30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，重復(fù)上述方法分別制得各類(lèi)不同類(lèi)的致病微生物抗原；(S2)、制取免疫蛋采用淘汰法篩選具有高免疫應(yīng)答能力的選擇產(chǎn)蛋禽類(lèi)，再分別采用上一步驟制備不同類(lèi)的致病微生物抗原對(duì)高免疫應(yīng)答能力的選擇產(chǎn)蛋禽類(lèi)進(jìn)行免疫；每隔二周再?gòu)?qiáng)化注射一次，計(jì)免疫三次；第一次免疫20天后，檢取免疫的母雞所產(chǎn)免疫蛋，并進(jìn)行編碼標(biāo)記；(S3)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉根據(jù)免疫所用不同類(lèi)的致病微生物抗原，將免疫蛋分類(lèi)并標(biāo)記編碼，用流動(dòng)水洗凈免疫蛋，再用蘇打水消毒，打蛋機(jī)打碎免疫蛋，篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；按蛋黃液體積的4-6倍加入蒸餾水稀釋并混合均勻，用I. ON HCI溶液調(diào)pH至5. 5-6. 0，將調(diào)整好pH值的稀釋液進(jìn)一步充分?jǐn)嚢杈鶆?，然后將其冷卻至2-60°C，靜置12小時(shí)-24小時(shí)；將稀釋液于10，OOOrpm離心20分鐘；取分離所得的上清液置超濾器中進(jìn)行超濾濃縮10-20倍；繼而加入2. 0%海藻酸鈉水溶液，稀釋至O. I %的濃度，攪拌至出現(xiàn)渾濁；再加入2.0%CaC12液，稀釋至O. 1%的濃度，攪拌均勻，40°C靜置8-12小時(shí)；8，OOOrpm離心20分鐘，取上清液；0. 45 μ m膜串連O. 22 μ mil過(guò)濾除菌；使用除病毒過(guò)濾器除去病毒；冷凍干燥，即分別制得不同類(lèi)的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉；最后，將所制備的對(duì)應(yīng)不同致病微生物抗原的特異性TgY粗提物進(jìn)行編碼標(biāo)記；(S4)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品將同類(lèi)的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉分別經(jīng)過(guò)蛋白層析裝置進(jìn)行純化處理，制得不同類(lèi)的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品；(S5)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY :將所制備的不同類(lèi)的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品混合，充分?jǐn)嚢杈鶆?，即制得抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY。 作為一種優(yōu)選方式，所述步驟(S4)后為步驟(S41)、制取納米化抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品對(duì)各類(lèi)所述抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品進(jìn)行納米化處理，制得不同類(lèi)的納米化抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品；步驟(S42)、制取納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品對(duì)各類(lèi)所述納米化抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品進(jìn)行脂質(zhì)體化處理，制得不同類(lèi)的納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品；所述步驟(S5)更換為步驟(S50)、制取納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY :將所制備的不同類(lèi)的納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品混合，充分?jǐn)嚢杈鶆颍粗频眉{米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY。具體的，所述致病微生物包括致病細(xì)菌、致病真菌、致病霉形體以及病毒。更具體的，所述致病細(xì)菌包括致病細(xì)菌包括無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及乳房鏈球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、星形諾卡氏菌、化膿鏈球菌、表皮葡萄球菌、變形桿菌、愛(ài)德華氏菌、腸桿菌、結(jié)核桿菌、多殺性巴氏桿菌和綠膿桿菌中的任意一種或任意幾種組合；所述致病真菌包括隱球菌、奴卡氏菌、毛孢子菌、煙曲霉菌、酵母菌和白色念珠菌中的任意一種或任意幾種組合；所述致病霉形體包括牛霉形體、牛生殖道霉形體和產(chǎn)堿霉形體中的任意一種或任意幾種組合；所述病毒包括口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、牛瘟病毒、牛皰疹性乳頭炎病毒和牛傳染性鼻氣管炎病毒中的任意一種或任意幾種組合。其中所選的微生物來(lái)源為向ATCC(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心)購(gòu)買(mǎi)以下代表性致病真菌和霉形體以及病毒(括號(hào)內(nèi)數(shù)字是ATCC商品編號(hào))，并采用常規(guī)方法培養(yǎng)和純化這些真菌和霉形體以及病毒，I.細(xì)菌無(wú)乳鏈球菌Streptococcus agalactiae (編號(hào)4768)停乳鏈球菌Streptococcus dysgalactiae (編號(hào)6644)金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus (編號(hào)BBA_1681)
大腸桿菌Escherichia coli (編號(hào)35150)乳房鏈球菌Streptococcus uberis (編號(hào)19436)肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae (編號(hào)29011)星形諾卡氏菌Nocardia asteroides (編號(hào)"55)化胺鏈球菌Streptococcus pyogenes (編號(hào)8669)表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis (編號(hào)35983)
變形桿菌Proteus vulgaris (編號(hào)8427)愛(ài)德華氏菌Edwardsiella tarda(編號(hào)=I5M7)結(jié)核桿菌Mycobacterium tuberculosis (編號(hào)25177)多殺性巴氏桿菌Pasteurella multocida(編號(hào)BBA_1113)綠胺桿菌Pseudomonas aeruginosa (編號(hào)12175)2.真菌隱球菌(編號(hào)32040)、奴卡氏菌(編號(hào)22338)、毛孢子菌(編號(hào)4155)、煙曲霉菌(編號(hào)1022)、酵母菌(編號(hào)22873)、白色念珠菌(編號(hào))3.霉形體牛霉形體(編號(hào)27367)、牛生殖道霉形體(編號(hào)14173)產(chǎn)堿霉形體(編號(hào)29103)4.病毒口蹄疫病毒(編號(hào)VR_1432)、水皰性口炎病毒(編號(hào)VR-1415)、牛瘟病毒(編號(hào)VR_128)、牛皰疹性乳頭炎病毒(編號(hào)VR_845)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(編號(hào)VR_2160)。具體的，所述步驟(SI)中制備牛乳房炎病毒復(fù)合抗原將所培養(yǎng)并純化的口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、牛瘟病毒、牛皰疹性乳頭炎病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒按重量10-1 : 10-1 : 10-1 : 1-10 : 1-10比例混合均勻得到病毒混合物，然后采用以下病毒裂解法進(jìn)行裂解分別取上述提純的病毒混合物加入20%十二烷基硫酸鈉，最終濃度為2. 0%，裂解30分鐘，即得到病毒裂解液，再將所得的病毒裂解液按重量1-10 10-1的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以8，000-30, OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得病
毒復(fù)合抗原。作為一種優(yōu)選方式，所述步驟(S5)后增加步驟(S6)、制備組合制劑將制得的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY加工成針劑或加入乳膏輔料加工成乳膏。作為另一種優(yōu)選方式，所述步驟(S50)后增加步驟(S60)、制備組合制劑將制得的納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY加工成針劑或加入乳膏輔料加工成乳膏。本發(fā)明加工的產(chǎn)品能定向殺滅引起牛乳房炎的多種致病細(xì)菌、真菌和致病霉形體以及致病病毒，有效預(yù)防和治療這些病原體引起的臨床牛乳房炎和隱性牛乳房炎；尤其是對(duì)那些采用常規(guī)藥物治療無(wú)效的頑固性牛乳房炎的療效特別明顯。同時(shí)，本發(fā)明的抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY、抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY和抗牛乳房炎致病霉形體特異性復(fù)合TgY以及抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY，包括抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性IgY，還會(huì)明顯增強(qiáng)奶牛體內(nèi)白細(xì)胞的吞噬功能，提升其抗病原體感染的能力；這一點(diǎn)是抗生素和化學(xué)藥無(wú)法做到的。本發(fā)明還將抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY、抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY和抗牛乳房炎致病霉形體特異性復(fù)合TgY以及抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY，包括抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性IgY加以輔料制成一種肌肉注射用的IgY針劑。給奶牛注射這種特殊針劑，可直接補(bǔ)充抗體，抑滅奶牛體內(nèi)的病原體，消除感染，迅速降低鮮奶體細(xì)胞數(shù)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例I各種抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法，一、制備抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY·I.制備細(xì)菌復(fù)合抗原I. I根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，乳房炎的致病細(xì)菌病原體有幾十種，其中主要的為無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌。向ATCC(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心)購(gòu)買(mǎi)以下有代表性致病細(xì)菌無(wú)乳鏈球菌Streptococcus agalactiae (編號(hào)4768)停乳鏈球菌Streptococcus dysgalactiae (編號(hào)6644)金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus (編號(hào)BBA_1681)大腸桿菌Escherichia coli (編號(hào)35150)I. 2采用常規(guī)方法培養(yǎng)和純化這些細(xì)菌，然后按(10-1) (10-1) (1-10) (1-10)比例混合均勻，得細(xì)菌混合物。I. 3超聲處理細(xì)菌混合物，得到菌株和菌體成份混合物。I. 4把超聲處理后的細(xì)菌菌株和菌體成份混合物按(1-10) (10-1)的比例(通常為I : I)加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以8，000-30, OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得細(xì)菌蛋白復(fù)合抗原。2.制備含高活性抗體的免疫蛋可選用任何產(chǎn)蛋禽類(lèi)免疫制備免疫蛋，限于篇幅僅以母雞為例說(shuō)明，其它禽類(lèi)完全可依下文所述方法同樣進(jìn)行。2. I采用淘汰法選擇具有高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞2. I. I選擇正在產(chǎn)蛋的健康無(wú)特定病原體攜帶的(SPF)健康產(chǎn)蛋雞200只并一一用數(shù)字進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記。然后用上述制得的細(xì)菌蛋白復(fù)合抗原對(duì)這些產(chǎn)蛋雞進(jìn)行注射免疫。在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開(kāi)始揀取高免疫蛋。對(duì)所檢取的免疫蛋按每只雞的編號(hào)不同進(jìn)行編碼標(biāo)記。2. 1.2當(dāng)每種編碼的免疫蛋數(shù)量達(dá)到10只左右時(shí)，將檢取的每批免疫蛋分別用0. 5%新潔而滅溶液或0. I % KMn04溶液或其它同類(lèi)消毒液將免疫蛋浸泡15 30分鐘消毒，無(wú)菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4 8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/1 NaOH液或者lmol/1 HCL液調(diào)節(jié)PH值至5. 5 6. O，4 6°C下靜置過(guò)夜，稀釋液8，OOO 12，000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮，得到200批抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY濃縮液體。2. I. 3分別以無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌作為抗原，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)所制得的200批抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY濃縮液體中每批對(duì)無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抗體結(jié)合效價(jià)。2. I. 4將凡是對(duì)無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抗體結(jié)合效價(jià)達(dá)到I : 1024以上的該批抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY濃縮液體單獨(dú)挑選出來(lái)；找出其對(duì)應(yīng)的產(chǎn)蛋母雞的編號(hào)，把這些產(chǎn)蛋母雞作為選擇的“具有高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞”，其它不符合高免疫應(yīng)答能力的母雞則淘汰不用。3.制備抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY粗品檢取選擇的高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞所產(chǎn)的免疫蛋，將所獲得的高免疫蛋分別用O. 5%新潔而滅溶液或O. I % KMn04溶液或其它同類(lèi)消毒液將免疫蛋浸泡15 30分鐘·消毒，無(wú)菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4 8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/1 NaOH液或者lmol/1 HCL液調(diào)節(jié)PH值至5. 5 6. 0，4 6°C下靜置過(guò)夜，稀釋液8，000 12，000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮。然后，采用美國(guó)Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒過(guò)濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，確保所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌。第一道細(xì)菌濾除裝置是用0. 22 μ m膜除菌過(guò)濾器除去沙門(mén)菌(Salmonella)等細(xì)菌；第二道支原體濾除裝置是用0. I μ m膜除支原體過(guò)濾器除去支原體；第三道病毒濾除裝置是用Ultipor VFTM DV50除病毒過(guò)濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內(nèi)的多種病毒。最后，將所得濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY粗品。4.制備抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY純品將所制得的抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY粗品分別過(guò)離子交換柱和凝膠交換柱再經(jīng)過(guò)親和層析柱進(jìn)行純化，即制得高活性的抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY。采用常規(guī)“水稀釋法”或“聚乙二醇法”等普通方法，而未經(jīng)過(guò)親和層析柱層析純化的，所得到的只是初級(jí)的IgY粗制品，并不是純化的IgY，其生物活性達(dá)不到醫(yī)療要求。將所制得的抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY純品應(yīng)用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY純品干粉。應(yīng)用SDS-PAGE電泳測(cè)定法，對(duì)按以上工藝所制取的抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY純品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得其中IgY含量都在98%以上。5.制備納米化抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY純品干粉取所制得的抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY純品干粉，加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在I IOOnm之間、粒度超過(guò)> 15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY純品干粉。6.制備納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY將以上所制得的納米化抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY純品作脂質(zhì)體化處理，具體實(shí)施方法如下
把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將納米化抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY純品加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配成IgY溶液；然后將含卵磷脂和膽固醇的混懸液與IgY溶液混合，超聲處理2min(每處理O. 5min,間歇.O. 5min),立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至呈凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而超速離心(35000r/min，30min)分離除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，離心，得沉淀，用lOmmol/L PBS稀釋?zhuān)粗频眉{米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY。二、制備抗牛乳房炎致病真菌特 異性IgYI.制備真菌復(fù)合抗原I. I向ATCC(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心)購(gòu)買(mǎi)以下有代表性致病真菌隱球菌、奴卡氏菌、毛孢子菌、煙曲霉菌、酵母菌。I. 2采用常規(guī)方法培養(yǎng)和純化這些真菌，然后按(10-1) (10-1) (10-1) (1-1O) : (1-10)比例混合均勻，得真菌混合物。I. 3超聲處理真菌混合物，得到菌株和菌體成份混合物。I. 4把超聲處理后的真菌菌株和菌體成份混合物按(1-10) (10-1)的比例(通常為I : I)加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以8，000-30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得真菌蛋白復(fù)合抗原。2.制備含高活性抗體的免疫蛋本發(fā)明可選用任何產(chǎn)蛋禽類(lèi)免疫制備免疫蛋，限于篇幅僅以母雞為例說(shuō)明，其它禽類(lèi)完全可依下文所述方法同樣進(jìn)行。2. I采用淘汰法選擇具有高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞2. I. I選擇正在產(chǎn)蛋的健康無(wú)特定病原體攜帶的(SPF)健康產(chǎn)蛋雞200只并一一用數(shù)字進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記。然后用上述制得的真菌蛋白復(fù)合抗原對(duì)這些產(chǎn)蛋雞進(jìn)行注射免疫。在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開(kāi)始揀取高免疫蛋。對(duì)所檢取的免疫蛋按每只雞的編號(hào)不同進(jìn)行編碼標(biāo)記。2. 1.2當(dāng)每種編碼的免疫蛋數(shù)量達(dá)到10只左右時(shí)，將檢取的每批免疫蛋分別用O. 5%新潔而滅溶液或O. I % KMn04溶液或其它同類(lèi)消毒液將免疫蛋浸泡15 30分鐘消毒，無(wú)菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4 8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/1 NaOH液或者lmol/1 HCL液調(diào)節(jié)PH值至5. 5 6. 0，4 6°C下靜置過(guò)夜，稀釋液8，000 12，000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮，得到200批抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY濃縮液體。2. I. 3分別以隱球菌、奴卡氏菌、毛孢子菌、煙曲霉菌、酵母菌作為抗原，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)所制得的200批抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY濃縮液體中每批對(duì)隱球菌、奴卡氏菌、毛孢子菌、煙曲霉菌、酵母菌的抗體結(jié)合效價(jià)。2. I. 4將凡是對(duì)隱球菌、奴卡氏菌、毛孢子菌、煙曲霉菌、酵母菌的抗體結(jié)合效價(jià)達(dá)到I : 102，400以上的該批抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY濃縮液體單獨(dú)挑選出來(lái)；找出其對(duì)應(yīng)的產(chǎn)蛋母雞的編號(hào)，把這些產(chǎn)蛋母雞作為選擇的“具有高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞”，其它不符合高免疫應(yīng)答能力的母雞則淘汰不用。3.制備抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY粗品
檢取選擇的高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞所產(chǎn)的免疫蛋，將所獲得的高免疫蛋分別用O. 5%新潔而滅溶液或O. I % KMn04溶液或其它同類(lèi)消毒液將免疫蛋浸泡15 30分鐘消毒，無(wú)菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4 8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/1 NaOH液或者lmol/1 HCL液調(diào)節(jié)PH值至5. 5 6. 0，4 6°C下靜置過(guò)夜，稀釋液8，000 12，000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮。然后，采用美國(guó)Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒過(guò)濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，確保所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌。第一道細(xì)菌濾除裝置是用0. 22 μ m膜除菌過(guò)濾器除去沙門(mén)菌(Salmonella)等細(xì)菌；第二道支原體濾除裝置是用0. I μ m膜除支原體過(guò)濾器除去支原體；第三道病毒濾除裝置是用Ultipor VFTM DV50除病毒過(guò)濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內(nèi)的多種病毒。最后，將所得濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY 粗品。4.制備抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY純品將所制得的抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY粗品分別過(guò)離子交換柱和凝膠交換柱再經(jīng)過(guò)親和層析柱進(jìn)行純化，即制得高活性的抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY。采用常規(guī)“水稀釋法”或“聚乙二醇法”等普通方法，而未經(jīng)過(guò)親和層析柱層析純化的，所得到的只是初級(jí)的IgY粗制品，并不是純化的IgY，其生物活性達(dá)不到醫(yī)療要求。將所制得的抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY純品應(yīng)用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY純品干粉。應(yīng)用SDS-PAGE電泳測(cè)定法，對(duì)按以上工藝所制取的抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY純品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得其中IgY含量都在98%以上。5.制備納米化抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY純品干粉取所制得的抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY純品干粉，加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在I IOOnm之間、粒度超過(guò)> 15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY純品干粉。6.制備納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY將以上所制得的納米化抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY純品作脂質(zhì)體化處理，具體實(shí)施方法如下把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將納米化抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY純品加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配成IgY溶液；然后將含卵磷脂和膽固醇的混懸液與IgY溶液混合，超聲處理2min(每處理0. 5min,間歇.0. 5min),立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至呈凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而超速離心(35000r/min，30min)分離除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，離心，得沉淀，用lOmmol/L PBS稀釋?zhuān)粗频眉{米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY。三、制備抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgYI.制備霉形體復(fù)合抗原1I. I向ATCC(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心)購(gòu)買(mǎi)以下有代表性致病霉形體牛霉形體、牛生殖道霉形體和產(chǎn)堿霉形體。
I. 2采用常規(guī)方法培養(yǎng)和純化這些霉形體，然后按(10-1) (10-1) (10_1)比例混合均勻,得霉形體混合物。I. 3超聲處理霉形體混合物，得到菌株和菌體成份混合物。I. 4把超聲處理后的菌株和菌體成份混合物按(1-10) (10-1)的比例(通常為I I)加入福氏佐劑， 置入高速勻漿機(jī)中，以8，000-30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得霉形體蛋白復(fù)合抗原。2.制備含高活性抗體的免疫蛋本發(fā)明可選用任何產(chǎn)蛋禽類(lèi)免疫制備免疫蛋，限于篇幅僅以母雞為例說(shuō)明，其它禽類(lèi)完全可依下文所述方法同樣進(jìn)行。2. I采用淘汰法選擇具有高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞2. I. I選擇正在產(chǎn)蛋的健康無(wú)特定病原體攜帶的(SPF)健康產(chǎn)蛋雞200只并一一用數(shù)字進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記。然后用上述制得的霉形體蛋白復(fù)合抗原對(duì)這些產(chǎn)蛋雞進(jìn)行注射免疫。在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開(kāi)始揀取高免疫蛋。對(duì)所檢取的免疫蛋按每只雞的編號(hào)不同進(jìn)行編碼標(biāo)記。2. 1.2當(dāng)每種編碼的免疫蛋數(shù)量達(dá)到10只左右時(shí)，將檢取的每批免疫蛋分別用O. 5%新潔而滅溶液或O. I % KMn04溶液或其它同類(lèi)消毒液將免疫蛋浸泡15 30分鐘消毒，無(wú)菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4 8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/1 NaOH液或者lmol/1 HCL液調(diào)節(jié)PH值至5. 5 6. 0，4 6°C下靜置過(guò)夜，稀釋液8，000 12，000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮，得到200批抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY濃縮液體。2. I. 3分別以牛霉形體、牛生殖道霉形體和產(chǎn)堿霉形體作為抗原，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)所制得的200批抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY濃縮液體中每批對(duì)牛霉形體、牛生殖道霉形體和產(chǎn)堿霉形體的抗體結(jié)合效價(jià)。2. I. 4將凡是對(duì)牛霉形體、牛生殖道霉形體和產(chǎn)堿霉形體的抗體結(jié)合效價(jià)達(dá)到
I 102，400以上的該批抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY濃縮液體單獨(dú)挑選出來(lái)；找出其對(duì)應(yīng)的產(chǎn)蛋母雞的編號(hào)，把這些產(chǎn)蛋母雞作為選擇的“具有高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞”，其它不符合高免疫應(yīng)答能力的母雞則淘汰不用。3.制備抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY粗品檢取選擇的高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞所產(chǎn)的免疫蛋，將所獲得的高免疫蛋分別用O. 5%新潔而滅溶液或O. I % KMn04溶液或其它同類(lèi)消毒液將免疫蛋浸泡15 30分鐘消毒，無(wú)菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4 8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/1 NaOH液或者lmol/1 HCL液調(diào)節(jié)PH值至5. 5 6. 0，4 6°C下靜置過(guò)夜，稀釋液8，000 12，000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮。然后，采用美國(guó)Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒過(guò)濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，確保所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌。第一道細(xì)菌濾除裝置是用0. 22 μ m膜除菌過(guò)濾器除去沙門(mén)菌(Salmonella)等細(xì)菌；第二道支原體濾除裝置是用0. Iym膜除支原體過(guò)濾器除去支原體；第三道病毒濾除裝置是用Ultipor VFTM DV50除病毒過(guò)濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內(nèi)的多種病毒。最后，將所得濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY粗品。4.制備抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY純品將所制得的抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY粗品分別過(guò)離子交換柱和凝膠交換柱再經(jīng)過(guò)親和層析柱進(jìn)行純化，即制得高活性的抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY。采用常規(guī)“水稀釋法”或“聚乙二醇法”等普通方法，而未經(jīng)過(guò)親和層析柱層析純化的，所得到的只是初級(jí)的IgY粗制品，并不是純化的IgY，其生物活性達(dá)不到醫(yī)療要求。將所制得的抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY純品應(yīng)用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY純品干粉。應(yīng)用SDS-PAGE電泳測(cè)定法，對(duì)按以上工藝所制取的抗牛乳房炎致病霉形體特異`性IgY純品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得其中IgY含量都在98%以上。5.制備納米化抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY純品干粉取所制得的抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY純品干粉，加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在I IOOnm之間、粒度超過(guò)> 15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY純品干粉。6.制備納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY將以上所制得的納米化抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY純品作脂質(zhì)體化處理，具體實(shí)施方法如下把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將納米化抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY純品加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配成IgY溶液；然后將含卵磷脂和膽固醇的混懸液與IgY溶液混合，超聲處理2min(每處理O. 5min,間歇.O. 5min),立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至呈凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而超速離心(35000r/min，30min)分離除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，離心，得沉淀，用10mmol/LPBS稀釋?zhuān)粗频眉{米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY。四、制備抗牛乳房炎致病病毒特異性IgYI.制備病毒復(fù)合抗原I. I向ATCC(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心)購(gòu)買(mǎi)以下有代表性致病病毒口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、牛瘟病毒、牛皰疹性乳頭炎病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒。I. 2采用常規(guī)方法培養(yǎng)和純化這些病毒，然后按(10-1) (10-1) (10-1) (1-1O) : (1-10)比例混合均勻，得病毒混合物。I. 3采用特殊方法裂解病毒混合物，得到病毒蛋白成份混合物。取病毒混合物加入20%十二烷基硫酸鈉(SDS)，最終濃度為2. 0%，裂解30分鐘，即得到病毒裂解液。經(jīng)SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢驗(yàn)分析，濃縮膠4%，分離膠7%，240V，電泳30分鐘?？棘斒狭了{(lán)染色，觀察蛋白帶。I. 4把病毒蛋白成份混合物按(1-10) (10-1)的比例(通常為I : I)加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以8，000-30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得病毒蛋白復(fù)合抗原。2.制備含高活性抗體的免疫蛋
本發(fā)明可選用任何產(chǎn)蛋禽類(lèi)免疫制備免疫蛋，限于篇幅僅以母雞為例說(shuō)明，其它禽類(lèi)完全可依下文所述方法同樣進(jìn)行。2. I采用淘汰法選擇具有高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞2. I. I選擇正在產(chǎn)蛋的健康無(wú)特定病原體攜帶的(SPF)健康產(chǎn)蛋雞200只并一一用數(shù)字進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記。然后用上述制得的病毒蛋白復(fù)合抗原對(duì)這些產(chǎn)蛋雞進(jìn)行注射免疫。在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開(kāi)始揀取高免疫蛋。對(duì)所檢取的免疫蛋按每只雞的編號(hào)不同進(jìn)行編碼標(biāo)記。2. 1.2當(dāng)每種編碼的免疫蛋數(shù)量達(dá)到10只左右時(shí)，將檢取的每批免疫蛋分別用
O.5%新潔而滅溶液或O. I % KMn04溶液或其它同類(lèi)消毒液將免疫蛋浸泡15 30分鐘消毒，無(wú)菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入·4 8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/1 NaOH液或者lmol/1 HCL液調(diào)節(jié)PH值至5. 5 6. 0，4 6°C下靜置過(guò)夜，稀釋液8，000 12，000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮，得到200批抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY濃縮液體。2. I. 3分別以口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、牛瘟病毒、牛皰疹性乳頭炎病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒作為抗原，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)所制得的200批抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY濃縮液體中每批對(duì)口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、牛瘟病毒、牛皰疹性乳頭炎病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒的抗體結(jié)合效價(jià)。2. I. 4將凡是對(duì)口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、牛瘟病毒、牛皰疹性乳頭炎病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒的抗體結(jié)合效價(jià)達(dá)到I : 102,400以上的該批抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY濃縮液體單獨(dú)挑選出來(lái)；找出其對(duì)應(yīng)的產(chǎn)蛋母雞的編號(hào)，把這些產(chǎn)蛋母雞作為選擇的“具有高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞”，其它不符合高免疫應(yīng)答能力的母雞則淘汰不用。3.制備抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY粗品檢取選擇的高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞所產(chǎn)的免疫蛋，將所獲得的高免疫蛋分別用O. 5%新潔而滅溶液或O. I % KMn04溶液或其它同類(lèi)消毒液將免疫蛋浸泡15 30分鐘消毒，無(wú)菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4 8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/1 NaOH液或者lmol/1 HCL液調(diào)節(jié)PH值至5. 5 6. 0，4 6°C下靜置過(guò)夜，稀釋液8，000 12，000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮。然后，采用美國(guó)Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒過(guò)濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，確保所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌。第一道細(xì)菌濾除裝置是用0. 22 μ m膜除菌過(guò)濾器除去沙門(mén)菌(Salmonella)等細(xì)菌；第二道支原體濾除裝置是用0. Iym膜除支原體過(guò)濾器除去支原體；第三道病毒濾除裝置是用Ultipor VFTM DV50除病毒過(guò)濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內(nèi)的多種病毒。最后，將所得濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY粗品。4.制備抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY純品將所制得的抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY粗品分別過(guò)離子交換柱和凝膠交換柱再經(jīng)過(guò)親和層析柱進(jìn)行純化，即制得高活性的抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY。采用常規(guī)“水稀釋法”或“聚乙二醇法”等普通方法，而未經(jīng)過(guò)親和層析柱層析純化的，所得到的只是初級(jí)的IgY粗制品，并不是純化的IgY，其生物活性達(dá)不到醫(yī)療要求。將所制得的抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY純品應(yīng)用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY純品干粉。應(yīng)用SDS-PAGE電泳測(cè)定法，對(duì)按以上工藝所制取的抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY純品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得其中IgY含量都在98%以上。5.制備納米化抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY純品干粉取所制得的抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY純品干粉，加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在I IOOnm之間、粒度超過(guò)> 15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的 納米化抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY純品干粉。6.制備納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY將以上所制得的納米化抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY純品作脂質(zhì)體化處理，具體實(shí)施方法如下把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將納米化抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY純品加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配成IgY溶液；然后將含卵磷脂和膽固醇的混懸液與IgY溶液混合，超聲處理2min(每處理O. 5min,間歇.O. 5min),立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至呈凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而超速離心(35000r/min，30min)分離除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，離心，得沉淀，用lOmmol/L PBS稀釋?zhuān)粗频眉{米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY。實(shí)施例2抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY注射劑生產(chǎn)。具體實(shí)施方案如下配方(重量百分比)使用實(shí)施例I制備的抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY 1.0%棉籽油84.0%吐溫80 5. 0%蒸餾水適量10.0%工藝I.取配方量棉籽油加熱至100°C混勻，泠卻至38°C得溶液A。2.取480ml純水，加入配方量納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY，攪拌完全溶解得溶液B。3.加入配方量吐溫80到溶液B，攪拌完全溶解得溶液C。4.將溶液C加入溶液A中，攪拌均勻得懸浮液成品。5.分裝，每支 10ml。實(shí)施例3抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY注射劑生產(chǎn)。具體實(shí)施方案如下配方(重量百分比)使用實(shí)施例I制備的抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY 1.0%
棉籽油84.0%吐溫80 5. 0%蒸餾水適量10.0%工藝6.取配方量棉籽油加熱至100°C混勻，泠卻至38°C得溶液A。7.取480ml純水，加入配方量納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY，攪拌完全溶解得溶液B。8.加入配方量吐溫80到溶液B，攪拌完全溶解得溶液C。9.將溶液C加入溶液A中，攪拌均勻得懸浮液成品。 10.分裝，每支 10ml。實(shí)施例4抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY注射劑生產(chǎn)。具體實(shí)施方案如下配方(重量百分比)使用實(shí)施例I制備的抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY 1.0%棉籽油84.0%吐溫80 5. 0%蒸餾水適量10.0%工藝I.取配方量棉籽油加熱至100°C混勻，泠卻至38°C得溶液A。2.取480ml純水，加入配方量抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY，攪拌完全溶解得溶液B。3.加入配方量吐溫80到溶液B，攪拌完全溶解得溶液C。4.將溶液C加入溶液A中，攪拌均勻得懸浮液成品。5.分裝，每支 10ml。實(shí)施例5抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY注射劑生產(chǎn)。具體實(shí)施方案如下配方(重量百分比)使用實(shí)施例I制備的抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY 1.0%棉籽油84.0%吐溫80 5. 0%蒸餾水適量10.0%工藝I.取配方量棉籽油加熱至100°C混勻，泠卻至38°C得溶液A。2.取480ml純水，加入配方量抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY，攪拌完全溶解得溶液B。3.加入配方量吐溫80到溶液B，攪拌完全溶解得溶液C。4.將溶液C加入溶液A中，攪拌均勻得懸浮液成品。5.分裝，每支 10ml。實(shí)施例6
抗牛乳房炎致病真菌和霉形體特異性IgY注射劑生產(chǎn)。首先將使用實(shí)施例I制備的抗牛乳房炎致病真菌和霉形體特異性IgY和抗牛乳房炎致病真菌和霉形體特異性IgY按(1-10) (10-1)比例混合均勻，得到抗牛乳房炎致病真菌和霉形體特異性IgY。然后按以下配方和工藝操作配方(重量百分比)抗牛乳房炎致病真菌和霉形體特異性IgY 1.0%棉籽油84.0%吐溫80 5. 0%蒸餾水適量10.0%工藝·I.取配方量棉籽油加熱至100°C混勻，泠卻至38°C得溶液A。2.取480ml純水，加入配方量抗牛乳房炎致病真菌和霉形體特異性IgY，攪拌完全溶解得溶液B。3.加入配方量吐溫80到溶液B，攪拌完全溶解得溶液C。4.將溶液C加入溶液A中，攪拌均勻得懸浮液成品。5.分裝，每支 10ml。實(shí)施例7抗牛乳房炎致病真菌和病毒特異性IgY注射劑生產(chǎn)。首先將使用實(shí)施例I制備的抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY和抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY按(1-10) (10-1)比例混合均勻，得到抗牛乳房炎致病真菌和病毒特異性IgY。然后按以下配方和工藝操作配方(重量百分比)抗牛乳房炎致病真菌和病毒特異性IgY 1.0%棉籽油84.0%吐溫80 5. 0%蒸餾水適量10.0%工藝I.取配方量棉籽油加熱至100°C混勻，泠卻至38°C得溶液A。2.取480ml純水，加入配方量抗牛乳房炎致病真菌和病毒特異性IgY，攪拌完全溶解得溶液B。3.加入配方量吐溫80到溶液B，攪拌完全溶解得溶液C。4.將溶液C加入溶液A中，攪拌均勻得懸浮液成品。5.分裝，每支 10ml。實(shí)施例8牛乳房炎致病霉形體和病毒特異性IgY注射劑生產(chǎn)。首先將使用實(shí)施例I制備的抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY和抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY按(1-10) (10-1)比例混合均勻，得到抗牛乳房炎致病霉形體和病毒特異性IgY。然后按以下配方和工藝操作配方(重量百分比)
抗牛乳房炎致病霉形體和病毒特異性IgY I. 0%棉籽油84.0%吐溫80 5. 0%蒸餾水適量10.0%工藝I.取配方量棉籽油加熱至100°C混勻，泠卻至38°C得溶液A。2.取480ml純水，加入配方量抗牛乳房炎致病霉形體和病毒特異性IgY，攪拌完全溶解得溶液B。 3.加入配方量吐溫80到溶液B，攪拌完全溶解得溶液C。4.將溶液C加入溶液A中，攪拌均勻得懸浮液成品。5.分裝，每支 10ml。實(shí)施例9抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性IgY注射劑生產(chǎn)。首先將使用實(shí)施例I制備的抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY、抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY和抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY以及抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY按(1-10): (1-10) : (1-10) (10-1) (I 10)比例混合均勻，得到抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性IgY。然后按以下配方和工藝操作配方(重量百分比)抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性IgY 1.0%棉籽油84.0%吐溫80 5. 0%蒸餾水適量10.0%工藝I.取配方量棉籽油加熱至100°C混勻，泠卻至38°C得溶液A。2.取480ml純水，加入配方量抗牛乳房炎致病真菌和霉形體以及病毒特異性IgY，攪拌完全溶解得溶液B。3.加入配方量吐溫80到溶液B，攪拌完全溶解得溶液C。4.將溶液C加入溶液A中，攪拌均勻得懸浮液成品。5.分裝，每支 10ml。實(shí)施例11抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY乳膏生產(chǎn)。具體實(shí)施方案如下配方原料重量百分比)I.使用實(shí)施例I制備的抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY I. O2.鈦白粉 153.微粉硅膠I. 54.棉籽油 82. 5工藝I.將配方量棉籽油加熱至100°C，然后冷卻至30 45°C成溶液A。
2.將配方量抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY加入溶液A，充分?jǐn)嚢杈鶆颍瞥扇芤築03.邊攪拌邊分別加入鈦白粉和微粉硅膠至溶液B，充分?jǐn)嚢杈鶆蛑瞥沙善?乳膏狀)。4.將成品分裝，檢驗(yàn)出廠。
實(shí)施例11抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY乳膏生產(chǎn)。具體實(shí)施方案如下配方原料百分比(％ )I.使用實(shí)施例I制備的抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY I. O2.鈦白粉 153.微粉硅膠I. 54.棉籽油 82. 5工藝5.將配方量棉籽油加熱至100°C，然后冷卻至30 45°C成溶液A。6.將配方量抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY加入溶液A，充分?jǐn)嚢杈鶆?，制成溶液B07.邊攪拌邊分別加入鈦白粉和微粉硅膠至溶液B，充分?jǐn)嚢杈鶆蛑瞥沙善?乳膏狀)。8.將成品分裝，檢驗(yàn)出廠。實(shí)施例12抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY乳膏生產(chǎn)。具體實(shí)施方案如下配方原料重量百分比(％ )I.使用實(shí)施例I制備的抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY I. O2.鈦白粉 153.微粉娃膠I. 54.棉籽油 82. 5工藝I.將配方量棉籽油加熱至100°C，然后冷卻至30 45°C成溶液A。2.將配方量抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY加入溶液A，充分?jǐn)嚢杈鶆?，制成溶液B。3.邊攪拌邊分別加入鈦白粉和微粉硅膠至溶液B，充分?jǐn)嚢杈鶆蛑瞥沙善?乳膏狀)。4.將成品分裝，檢驗(yàn)出廠實(shí)施例12抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY乳膏生產(chǎn)。具體實(shí)施方案如下配方原料重量百分比(％ )
I.使用實(shí)施例I制備的抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY I. O2.鈦白粉 153.微粉娃膠I. 54.棉籽油 82. 5工藝I.將配方量棉籽油加熱至100°C，然后冷卻至30 45°C成溶液A。2.將配方量抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY加入溶液A，充分?jǐn)嚢杈鶆?，制成溶液B03.邊攪拌邊分別加入鈦白粉和微粉硅膠至溶液B，充分?jǐn)嚢杈鶆蛑瞥沙善?乳膏·狀)。4.將成品分裝，檢驗(yàn)出廠實(shí)施例14抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性IgY乳膏生產(chǎn)。首先將使用實(shí)施例I制備的抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY、抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY和抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY以及抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY按(1-10): (1-10) (10-1) (I 10)比例混合均勻，得到抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性IgY。然后按以下配方和工藝操作配方原料重量百分比(％ )I.抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性IgY 1.02.鈦白粉 153.微粉硅膠I. 54.棉籽油 82. 5工藝I.將配方量棉籽油加熱至100°C，然后冷卻至30 45°C成溶液A。2.將配方量抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性IgY加入溶液A，充分?jǐn)嚢杈鶆?，制成溶液B。3.邊攪拌邊分別加入鈦白粉和微粉硅膠至溶液B，充分?jǐn)嚢杈鶆蛑瞥沙善?乳膏狀)。4.將成品分裝，檢驗(yàn)出廠。實(shí)施例15抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性IgY肌肉注射用針劑生產(chǎn)。首先將使用實(shí)施例I制備的抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY純品、抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY純品和抗牛乳房炎致病霉形體特異性IgY純品以及抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY純品按(1-10) : (1-10) (10-1) (I 10)比例混合均勻，得到抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性復(fù)合純IgY。然后按以下配方和工藝操作一 ·配方(重量百分比)抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性復(fù)合純IgY 10.0%聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 1.0%
吐溫80 I. 0%注射用水88.0%二·生產(chǎn)工藝I.取注射用水，加入PVP,加熱溶解加入吐溫-80，得到澄清液A，密閉加熱IOO0C 30min，冷卻至室溫備用。2.將牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性復(fù)合純IgY加入溶液A，攪拌均勻得溶液B。3.用 O. IN NaOH 調(diào)節(jié) ρΗ7· 2-7. 5。4.采用O. 22的微孔濾膜將溶液B過(guò)濾除菌。 5.于無(wú)菌灌封機(jī)中灌封于無(wú)菌容器中。燈檢、檢漏、印字、包裝即得100支IgY注射劑。規(guī)格IOmL/支。實(shí)施例16抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY肌肉注射用針劑生產(chǎn)。一 .配方使用實(shí)施例I制備的抗牛乳房炎致病病毒特異性復(fù)合純IgY 10. 0%聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 1.0%吐溫80 I. 0%注射用水88.0%二.生產(chǎn)工藝I.取注射用水，加入PVP,加熱溶解加入吐溫-80，得到澄清液Α，密閉加熱IOO0C 30min，冷卻至室溫備用。2.將牛乳房炎致病病毒特異性復(fù)合純IgY加入溶液A，攪拌均勻得溶液B。3.用 O. IN NaOH 調(diào)節(jié) ρΗ7· 2-7. 5。4.采用O. 22的微孔濾膜將溶液B過(guò)濾除菌。5.于無(wú)菌灌封機(jī)中灌封于無(wú)菌容器中。燈檢、檢漏、印字、包裝即得100支IgY注射劑。規(guī)格IOmL/支。采用本發(fā)明制備的「抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性IgY注射齊U」治療頑固性乳房炎患牛。試驗(yàn)地點(diǎn)中國(guó)廣州市某奶牛場(chǎng)。試驗(yàn)時(shí)間2010年9月I日 9月15日。試驗(yàn)對(duì)象患隱性乳房炎奶牛302頭，用“便攜式牛奶體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀”檢測(cè)鮮奶體細(xì)胞數(shù)，平均值75萬(wàn)/ml。試驗(yàn)方法及結(jié)果采用本方法治療前已采用多種抗生素治療，解奶體細(xì)胞數(shù)居高不下，產(chǎn)奶量下降很多。使用本發(fā)明制備的「抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性IgY注射劑」進(jìn)行治療，注射前用酒精消毒，每頭奶牛注射4針(每個(gè)乳池一針)，注射后用本發(fā)明制備的「抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體以及病毒特異性IgY乳膏」揉摸2分鐘。注射時(shí)間間隔24小時(shí)。連續(xù)注射三天。第四天復(fù)查病牛所產(chǎn)奶的體細(xì)胞數(shù)，平均下降至20萬(wàn)/ml，產(chǎn)奶量也全部恢復(fù)正常。采用本發(fā)明制備的「抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性IgY注射齊U」防治牛乳房炎。試驗(yàn)地點(diǎn)中國(guó)上海市乳業(yè)集團(tuán)下屬奶牛場(chǎng)。試驗(yàn)時(shí)間2010年4月5日 2011年3月31日。試驗(yàn)對(duì)象30個(gè)牧場(chǎng)16000頭奶牛，每月用“便攜式牛奶體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀”抽查鮮奶體細(xì)胞數(shù)。試驗(yàn)前鮮奶體細(xì)胞數(shù)平均值45萬(wàn)/ml。試驗(yàn)方法使用本發(fā)明制備的「抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性IgY注射劑」進(jìn)行防治，注射前用酒精消毒，每頭奶牛注射4針(每個(gè)乳池一針)，注射后用本發(fā)明制備的「抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性IgY乳膏」揉摸2分鐘。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí),30個(gè)牧場(chǎng)全面進(jìn)行注射；以后每三個(gè)月注射一次。試驗(yàn)一年，參加試驗(yàn)的30個(gè)牧場(chǎng)的奶牛的鮮奶體細(xì)胞數(shù)平均下降了 25萬(wàn)/ml，達(dá)到了國(guó)際優(yōu)質(zhì)奶標(biāo)準(zhǔn)，每頭奶牛產(chǎn)奶量平均增加了 450公斤/年，每頭奶牛凈增加收入為 1650元/年。實(shí)驗(yàn)例I抗牛乳房炎致病細(xì)菌、真菌和霉形體及病毒特異性IgY純品中的IgY含量檢測(cè)應(yīng)用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉一聚丙烯凝膠)電泳測(cè)定法，對(duì)按以上方法所制取的抗牛乳房炎致病細(xì)菌特異性IgY、抗牛乳房炎致病真菌特異性IgY和抗牛乳房炎致病霉形體特異性復(fù)合TgY以及抗牛乳房炎致病病毒特異性IgY粗品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果含IgY 45 52%。將這四種IgY粗品經(jīng)二次過(guò)柱純化后，得到純IgY。經(jīng)SDS-PAGE分析，純度達(dá)到PAGE純，如下表所示
權(quán)利要求
1.一種抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (51)、制取不同類(lèi)的牛乳房炎致病微生物抗原分別按致病微生物的分類(lèi)培養(yǎng)并純化任意一種或任意幾種同類(lèi)不同種的致病微生物，按任意比例混合均勻，然后加以超聲粉碎；最后按重量1-10 : 10-1的重量比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機(jī)中，以8，000-30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，重復(fù)上述方法分別制得各類(lèi)不同類(lèi)的致病微生物抗原； (52)、制取免疫蛋采用淘汰法篩選具有高免疫應(yīng)答能力的選擇產(chǎn)蛋禽類(lèi)，再分別采用上一步驟制備不同類(lèi)的致病微生物抗原對(duì)高免疫應(yīng)答能力的選擇產(chǎn)蛋禽類(lèi)進(jìn)行免疫；每隔二周再?gòu)?qiáng)化注射一次，計(jì)免疫三次；第一次免疫20天后，檢取免疫的母雞所產(chǎn)免疫蛋，并進(jìn)行編碼標(biāo)記； (53)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉根據(jù)免疫所用不同類(lèi)的致病微生物抗原，將免疫蛋分類(lèi)并標(biāo)記編碼，用流動(dòng)水洗凈免疫蛋，再用蘇打水消毒，打蛋機(jī)打碎免疫蛋，篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；按蛋黃液體積的4-6倍加入蒸餾水稀釋并混合均勻，用I. ON HCI溶液調(diào)pH至5. 5-6. 0，將調(diào)整好pH值的稀釋液進(jìn)一步充分?jǐn)嚢杈鶆颍缓髮⑵淅鋮s至2-60°C，靜置12小時(shí)-24小時(shí)；將稀釋液于10，OOOrpm離心20分鐘；取分離所得的上清液置超濾器中進(jìn)行超濾濃縮10-20倍；繼而加入2. 0%海藻酸鈉水溶液，稀釋至O. 1%的濃度，攪拌至出現(xiàn)渾濁；再加入2.0% CaC12液，稀釋至O. 1%的濃度，攪拌均勻，40°C靜置8-12小時(shí)；8，OOOrpm離心20分鐘，取上清液；0. 45 μ m膜串連O. 22 μ m膜過(guò)濾除菌；使用除病毒過(guò)濾器除去病毒；冷凍干燥，即分別制得不同類(lèi)的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉；最后，將所制備的對(duì)應(yīng)不同致病微生物抗原的特異性TgY粗提物進(jìn)行編碼標(biāo)記； (54)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品將同類(lèi)的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉分別經(jīng)過(guò)蛋白層析裝置進(jìn)行純化處理，制得不同類(lèi)的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品； (55)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性復(fù)合IgY:將所制備的不同類(lèi)的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品混合，充分?jǐn)嚢杈鶆?，即制得抗牛乳房炎致病微生物特異性?fù)合 IgYo
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法，其特征在于所述步驟(S4)后為 步驟(S41)、制取納米化抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品對(duì)各類(lèi)所述抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品進(jìn)行納米化處理，制得不同類(lèi)的納米化抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品； 步驟(S42)、制取納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品對(duì)各類(lèi)所述納米化抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品進(jìn)行脂質(zhì)體化處理，制得不同類(lèi)的納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品； 所述步驟(S5)更換為步驟(S50)、制取納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY 將所制備的不同類(lèi)的納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品混合，充分?jǐn)嚢杈鶆颍粗频眉{米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病微生物特異性復(fù)合IgY。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法，其特征在于所述致病微生物包括致病細(xì)菌、致病真菌、致病霉形體以及病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法，其特征在于所述致病細(xì)菌包括致病細(xì)菌包括無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及乳房鏈球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、星形諾卡氏菌、化膿鏈球菌、表皮葡萄球菌、變形桿菌、愛(ài)德華氏菌、腸桿菌、結(jié)核桿菌、多殺性巴氏桿菌和綠膿桿菌中的任意一種或任意幾種組合；所述致病真菌包括隱球菌、奴卡氏菌、毛孢子菌、煙曲霉菌、酵母菌和白色念珠菌中的任意一種或任意幾種組合；所述致病霉形體包括牛霉形體、牛生殖道霉形體和產(chǎn)堿霉形體中的任意一種或任意幾種組合；所述病毒包括口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、牛瘟病毒、牛皰疹性乳頭炎病毒和牛傳染性鼻氣管炎病毒中的任意一種或任意幾種組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法，其特征在于所述步驟(Si)中制備牛乳房炎病毒復(fù)合抗原，將所培養(yǎng)并純化的口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、牛瘟病毒、牛皰疹性乳頭炎病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒按重量10-1 : 10-1 : 10-1 : 1-10 : 1-10比例混合均勻得到病毒混合物，然后采用以下病毒裂解法進(jìn)行裂解 分別取上述提純的病毒混合物加入20%十二烷基硫酸鈉，最終濃度為2. 0%，裂解30分鐘，即得到病毒裂解液，再將所得的病毒裂解液按重量1-10 10-1的比例加入福氏佐齊U，置入高速勻漿機(jī)中，以8，000-30，OOOrpm高速粉碎勻化，形成油包水溶液，制得病毒復(fù)合抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法，其特征在于所述步驟(S5)后增加步驟(S6)、制備組合制劑將制得的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY加工成針劑或加入乳膏輔料加工成乳膏。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法，其特征在于所述步驟(S50)后增加步驟(S60)、制備組合制劑將制得的納米脂質(zhì)體抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY加工成針劑或加入乳膏輔料加工成乳膏。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療牛乳房炎的產(chǎn)品，公開(kāi)了一種抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY的制備方法，包括以下步驟(S1)、制取不同類(lèi)的牛乳房炎致病微生物抗原；(S2)、制取免疫蛋；(S3)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY粗提物干粉；(S4)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY純品；(S5)、制取抗牛乳房炎致病微生物特異性IgY。按本發(fā)明生產(chǎn)的產(chǎn)品具有對(duì)采用常規(guī)藥物治療無(wú)效的頑固性牛乳房炎的療效特別明顯；同時(shí)，還會(huì)明顯增強(qiáng)奶牛體內(nèi)白細(xì)胞的吞噬功能，提升其抗病原體感染的能力；可直接給奶牛補(bǔ)充抗體，抑滅奶牛體內(nèi)的病原體，消除感染，迅速降低鮮奶體細(xì)胞數(shù)。
文檔編號(hào)C07K16/08GK102898518SQ20111020895
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月25日
發(fā)明者包晟, 楊榮鑒, 包海威, 張善鈞, 汪玲 申請(qǐng)人:深圳雅臣生物科技有限公司