專利名稱：擬穴青蟹抗脂多糖因子及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及擬穴青蟹基因工程，特別涉及擬穴青蟹抗脂多糖因子及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
擬穴青蟹(Scylla paramamosain)屬于梭子蟹科(Portunidae)暖水廣鹽性海洋蟹類，在中國(guó)大陸東南沿海分布最廣，數(shù)量最多。隨著擬穴青蟹集中養(yǎng)殖規(guī)模地不斷擴(kuò)大，由細(xì)菌、真菌和病毒等因素引起的疾病對(duì)蟹類養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失。眾所周知，甲殼類動(dòng)物主要依靠先天性免疫系統(tǒng)來(lái)抵御外界病原微生物，多種先天性免疫因子參與其抗感染過(guò)程，包括凝集素(agglutinin)、溶血素(hemolysin)、溶菌酶(lysozeme)、酚氧化酶 (phenoloxidase)系統(tǒng)、蛋白酶抑制劑、抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)等?？怪嗵且蜃?Anti-lipopolysaccharidefactor, ALF)是最初發(fā)現(xiàn)于當(dāng)(1. TanakaS, Nakamura T, Morita T, Iwanaga S. Limulus anti-LPS factor :an anticoagulant which inhibits the endotoxin mediated activation of Limulus coagulation system[J]. Biochem Biophys Res Commun,1982,105(2) :717-723)體內(nèi) 的一種抗菌肽，與細(xì)胞內(nèi)毒素(脂多糖，LPS)具有高親和力，已證明它具有結(jié)合LPS的類脂A部位并能夠在體外中和LPS的生物學(xué)活性，通過(guò)一些動(dòng)物模型的體內(nèi)研究，發(fā)現(xiàn)鱟抗脂多糖因子(LALF)和其環(huán)肽部分(LALF31-52，LALF35-52)在內(nèi)毒素血癥和對(duì)抗內(nèi)毒素休克的效用。隨后的研究也表明，鱟抗脂多糖因子(LALF)對(duì)R-型革蘭氏陰性菌生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制作用，故認(rèn)為L(zhǎng)ALF具有免疫調(diào)控功能，并對(duì)鱟抵御病原微生物感染具有重要意義。近年來(lái)，研究者們陸續(xù)從中國(guó)明對(duì)蝦O.Liu F，Liu Y，Li F，Dong B，Ximg J. Molecular cloning and expression profile of putative antilipopolysaccharide factor in Chinese shrimp(Fenneropenaeus chinensis)[J]Mar Biotechnol(NY)，2005， 7(6) :600-608)、南美白對(duì)蝦(3.Vega Edl, 0，Leary NA，Shockey JE，Robalino J，Payne C，Browdy CL, Warr GW, Gross PS. Anti-lipopolysaccharide factor in Litopenaeus vannamei(LvALF) :a broad spectrum antimicrobial peptide essential for shrimp immunity against bacterial and fungal infection[J]. Mol Immunol,2008,45 (7) 1916-1925)、 草蟲下(4.Somboonwiwat K， Marcos M， Tassanakajon A， Klinbunga S， Aumelas A， Romestand B， Gueguen Y， Boze H， Moulin G， Bachere E.Recombinant expression and anti-microbial activity of anti-lipopolysaccharide factor(ALF) from the black tiger shrimp Penaeus monodon[J]. Dev Comp Immunol，2005，29(10) 841-851) ^ (5. Yue F, Pan L, Miao J, Zhang L， Li J. Molecular cloning, characterization and mRNA expression of two antibacterial peptides :Crustin and anti-lipopolysaccharide factor in swimming crab Portunus trituberculatus[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B :Biochemistry and Molecular Biology, 2010,156 (2) :77-85.)、中華絨螯蟹(6. Li C，Zhao J，Song L，Mu C，Zhang H，GaiY，Qiu LjYu Y，Ni DiXing K. Molecular cloning，genomic organization and functional analysis of an anti~lipopolysaccharide factor from Chinese mitten crab Eriocheir sinensis [J]. Dev Comp Immunol，2008，32 (7) :784-794.)、鋸緣青蟹(7. Yedery RD,Reddy KV. Identification,cloning,characterization and recombinant expression of an anti-lipopoIysaccharide factor from the hemocytes of Indian mud crab， Scylla serrata[J]. Fish Shellfish Immunol,2009,27(2) :275_284·)、日本囊對(duì)蝦 (8. Mekata Τ,Sudhakaran R，Okugawa S，Kono T，Sakai M，Itami Τ. Molecular cloning and transcriptional analysis of a newly identified anti-lipopoIysaccharide factor gene in kuruma shrimp,Marsupenaeus japonicus[J]Lett Appl Microbiol，2010，50(1) 112-119.)等其他甲殼動(dòng)物分離鑒定了抗脂多糖因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供擬穴青蟹抗脂多糖因子及其制備方法與應(yīng)用。 根據(jù)擬穴青蟹(Scylla paramamosain)和抗脂多糖因子 -Iipopolysaccharide factor, ALF)可將擬穴青蟹抗脂多糖因子簡(jiǎn)寫為Sp-ALF。 所述擬穴青蟹抗脂多糖因子的基因序列為
cagtatgaaa ctctgatagc ctccgttctt ggaaaactca ctggactgtg gcacaacaac tcagtggact tcatgggcca cacctgtcac ttccgccgcc gtcctaaggt caggaaattc aagctgtacc acgagggcaa gttttggtgt cctggctggg cgccttttga gggcaggtcg aggacaaaga gcaggtcggg gtcatccagg gaagccatca aggacttcgt gcgcaaagct ttacagaacg gactcatcac acagcaggac gctacggtgt gggtgaataa t 所述擬穴青蟹抗脂多糖因子的氨基酸序列為 Gln Tyr Glu Thr Leu lie Ala Ser Val Leu Gly Lys Leu Thr
1
Trp
Arg Arg
5
His Asn Asn 20 Lys
10
Gly His
Cys 50
Ser
Pro
35
Pro
Ser Val Asp Phe Met 25
Val Arg Lys Phe Lys Leu Tyr 40
Gly Trp Ala Pro Phe Glu Gly Arg 55
Glu Ala lie
Gly Ser Ser Arg Glu Ala lie Lys Asp 7075
Gln Asn Gly Leu lie Thr Gln Gln Asp Ala 8590
Thr Cys His 30
His Glu Gly 45
Ser Arg Thr 60
Phe Val Arg Thr Val Trp
Trp
Arg 65 Leu
Asn
所述擬穴青蟹抗脂多糖因子的制備方法包括以下步驟
1)構(gòu)建擬穴青蟹抗脂多糖因子重組表達(dá)載體；
2)將步驟1)所得重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并將宿主細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得
Gly Leu 15
Phe Arg
Lys Phe
Lys Ser
Lys Ala 80 Val Asn 95
60 120 180 240 291
表達(dá)產(chǎn)物；
4
3)分離純化步驟幻所得的表達(dá)產(chǎn)物，獲得重組蛋白，即擬穴青蟹抗脂多糖因子。在步驟1)中，所述表達(dá)載體可選用pPICTk等。在步驟幻中，所述宿主細(xì)胞可為畢赤酵母等。在步驟幻中，所述分離純化可為先將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行透析，再進(jìn)行親和層析。所述擬穴青蟹抗脂多糖因子對(duì)革蘭氏陰性菌弗氏志賀氏菌、解藻朊酸弧菌、副溶血性弧菌、施氏假單胞菌和熒光假單胞菌，革蘭氏陽(yáng)性菌谷氨酸棒桿菌具有明顯抑制生長(zhǎng)作用和殺菌作用，在制備抑菌新藥和作為動(dòng)物飼料抗菌添加劑中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明分離出擬穴青蟹抗脂多糖因子Sp-ALF的基礎(chǔ)上，根據(jù)Sp-ALF基因序列特征成功構(gòu)建重組表達(dá)載體并在畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)并純化獲得Sp-ALF蛋白，該重組蛋白具有廣譜的抗菌活性，表明Sp-ALF可能廣泛參與了擬穴青蟹抗微生物感染的先天免疫反應(yīng)，重組蛋白在動(dòng)物飼料添加劑和抗病原微生物新藥物開(kāi)發(fā)上顯示出誘人的應(yīng)用前景。


圖1為pPICTk載體雙酶切前后電泳圖譜。1為酶切前的pPICTk載體；2為酶切后 pPIC9k 載體，bp 為堿基，2000 為分子量；M 為 DS2000DNA Marker。圖 2 為表達(dá)載體 pPIC9k、pPIC9k/Sp-ALFl 和 pPIC9k/Sp_ALF2Sal I 線性化前后電泳圖譜。1 為 pPIC9k，2 為酶切后 pPIC9k，3 為 pPIC9k/Sp_ALF，4 為酶切后的 pPIC9k/Sp_ALF， M 為 DS2000DNA Marker, bp 為堿基，2000 為分子量。圖3為pPIC9k/Sp_ALF重組畢赤酵母克隆子甲醇誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)SDS-PAGE電泳圖譜。1為誘導(dǎo)前表達(dá)情況；2 4分別為甲醇誘導(dǎo)12h、Mh、48h的表達(dá)產(chǎn)物；M為SDS-PAGE 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker，18和14為電泳的重組蛋白Sp-ALF。圖4為pPIC9k/Sp_ALF重組畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物純化檢測(cè)電泳圖譜。1 上樣前產(chǎn)物；2 3 穿過(guò)峰的產(chǎn)物；4 8 溶液D洗脫峰的產(chǎn)物；M =SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) Marker, 18和14為電泳的重組蛋白Sp-ALF。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例1擬穴青蟹抗脂多糖因子Sp-ALF真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)pPIC9k載體多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增編碼擬穴青蟹Sp-ALF(cDNA)基因ORF的特異性上游引物Fl和下游引物R1。在上游引物Fl的5'端添加SnaB I酶切位點(diǎn)和編碼 His-tag的堿基；在下游引物Rl的5'端添加終止密碼子和Avr II酶切位點(diǎn)上游引物Fl:5' -CGTACGTACACCATCATCATCATCATCAGTATGAAACTCTGATAG-3'，下游引物Rl:5' -AA CCTAGGTTAATTATTCACCCACACCGTAG-3‘。擴(kuò)增Sp-ALF的編碼區(qū)片段。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s， 60°C退火30s，72°C延伸30s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠純化試劑盒回收，回收的PCR產(chǎn)物用SnaB I和Avr II 進(jìn)行酶切后純化回收，與用SnaB I和Avr II雙酶切線性化pPICTk載體連接，構(gòu)建好酵母表達(dá)重組載體pPIC9k/Sp-ALF，點(diǎn)樣進(jìn)行電泳檢測(cè)(參見(jiàn)圖1)。實(shí)施例2pPIC9k/Sp_ALF重組質(zhì)粒在畢赤酵母GS 115中的誘導(dǎo)表達(dá)
用Ml I對(duì)測(cè)序正確的質(zhì)粒pPIC9k/Sp_ALF進(jìn)行酶切線性化(參見(jiàn)圖2)，再將其用電擊法轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GSl 15感受態(tài)細(xì)胞中，并誘導(dǎo)表達(dá)。以pPICTk空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母GSl 15為對(duì)照，以pPIC9k/Sp_ALF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母GS115為實(shí)驗(yàn)組，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，以pPIC9k/Sp_ALF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母GSl 15在經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后與誘導(dǎo)前相比具有明顯的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白條帶在14kDa左右(參見(jiàn)圖幻，與計(jì)算的理論分子量相似，另外重組子的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物中還有一條ISkDa左右大小的條帶，經(jīng)質(zhì)譜鑒定后亦為Sp-ALF，推測(cè)是表達(dá)分泌過(guò)程中可能發(fā)生潛在的糖基化修飾。實(shí)施例3pPIC9k/Sp-ALF重組質(zhì)粒在畢赤酵母GS115中誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的純化及抗菌活性鑒定 1、親和層析法純化目的蛋白將重組陽(yáng)性畢赤酵母GS115菌株大量誘導(dǎo)表達(dá)后，離心去除菌體收集培養(yǎng)基上清 1L，PBS透析兩次(12h換一次新透析液)后，4°C，12000rpm離心35min，取上清，得到上柱樣品。接著采用金屬鏊合層析柱對(duì)透析后的蛋白進(jìn)行親和層析。收集洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分析及質(zhì)譜鑒定為Sp-ALF重組蛋白(參見(jiàn)圖4)。2、Sp-ALF重組蛋白抗菌活性鑒定應(yīng)用Bradford法測(cè)定BSA標(biāo)準(zhǔn)品得到蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)公式可計(jì)算出 Sp-ALF重組蛋白的濃度。Sp-ALF重組蛋白抗菌活性的測(cè)定目的蛋白的稀釋按照最低抑菌濃度(MIC)設(shè)定濃度進(jìn)行，用口皿為單位進(jìn)行稀釋配比，如25、12.5、6.25、3. 12和1.6μΜ為梯度在96孔微量培養(yǎng)板上進(jìn)行。蛋白樣品要經(jīng)過(guò)0. 22 μ m過(guò)濾膜過(guò)濾除菌菌再進(jìn)行稀釋配比，每個(gè)濃度設(shè)置一個(gè)平行孔。取被測(cè)細(xì)菌，在MH或2216平板上劃線，倒置培養(yǎng)12 16h;挑取單克隆接種于MH或2216斜面，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜達(dá)到中期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段；用DPBS (1. 58mM NaH2PO4, 8. 42mMNa2HP04,pH 7. 2 7. 4)清洗斜面培養(yǎng)物，調(diào)整稀釋至 OD600 = 0. 1，取 18 μ 1 OD600 = 0. 1的稀釋菌加入終體積為Iml的MH稀釋培養(yǎng)基(DPBS :600μ 1,MH :400 μ 1)中，該菌濃度則為MIC工作濃度。其中大腸桿菌模式株、谷氨酸棒桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌和弗氏志賀氏菌培養(yǎng)溫度為37°C，副溶血性弧菌、解藻朊酸弧菌、熒光假單胞菌和施氏假單胞菌培養(yǎng)溫度為^°C。MIC在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行，每種被測(cè)細(xì)菌按照以下操作設(shè)置空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和待測(cè)樣品實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置2個(gè)平行樣，加樣體系分別為①空白對(duì)照組力卩50 μ 1蛋白樣品和50 μ 1 DPBS ；②陰性對(duì)照組力口 50 μ 1菌懸液和50 μ 1 DPBS ；③樣品實(shí)驗(yàn)組加50 μ 1待測(cè)各濃度蛋白樣品和50 μ 1菌懸液。28 "C 培養(yǎng) 24h 后，判定 Sp-ALF 重組蛋白對(duì)細(xì)菌的 MIC (Minimum Inhibitory Concentration，最低抑菌濃度)，判定標(biāo)準(zhǔn)為該濃度細(xì)菌數(shù)少于或等于對(duì)照(未添加抗菌肽)中的一半。利用測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)以上各孔培養(yǎng)物，分別吸取5μ1，移種在瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)孵育過(guò)夜，判定Sp-ALF重組蛋白對(duì)細(xì)菌的MBC (Minimum Bactericidal Concentration，最低殺菌濃度)，即殺死某種菌株的藥物最低濃度。
6
結(jié)果顯示，真核表達(dá)的Sp-ALF蛋白產(chǎn)物能夠?qū)κ茉嚲竽c桿菌模式株、弗氏志賀氏菌、副溶血性弧菌、解藻朊酸弧菌、施氏假單胞菌、熒光假單胞菌，谷氨酸棒桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌(均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心)均具有較強(qiáng)殺傷作用(參見(jiàn)表1)。表 權(quán)利要求
1.擬穴青蟹抗脂多糖因子，其特征在于所述擬穴青蟹抗脂多糖因子的基因序列為 c
2.如權(quán)利要求1所述的擬穴青蟹抗脂多糖因子，其特征在于所述擬穴青蟹抗脂多糖因子的氨基酸序列為
3.如權(quán)利要求1所述的擬穴青蟹抗脂多糖因子的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)構(gòu)建擬穴青蟹抗脂多糖因子重組表達(dá)載體；2)將步驟1)所得重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并將宿主細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)產(chǎn)物；3)分離純化步驟幻所得的表達(dá)產(chǎn)物，獲得重組蛋白，即擬穴青蟹抗脂多糖因子。
4.如權(quán)利要求3所述的擬穴青蟹抗脂多糖因子的制備方法，其特征在于在步驟1)中， 所述表達(dá)載體選用pPICTk。
5.如權(quán)利要求3所述的擬穴青蟹抗脂多糖因子的制備方法，其特征在于在步驟2)中， 所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母。
6.如權(quán)利要求3所述的擬穴青蟹抗脂多糖因子的制備方法，其特征在于在步驟3)中， 所述分離純化為先將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行透析，再進(jìn)行親和層析。
7.如權(quán)利要求1所述的擬穴青蟹抗脂多糖因子在制備抑菌藥中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求1所述的擬穴青蟹抗脂多糖因子在制備動(dòng)物飼料抗菌添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
擬穴青蟹抗脂多糖因子及其制備方法與應(yīng)用。涉及擬穴青蟹基因工程，提供擬穴青蟹抗脂多糖因子及其制備方法與應(yīng)用。制備方法包括以下步驟構(gòu)建擬穴青蟹抗脂多糖因子重組表達(dá)載體；將所得重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并將宿主細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)產(chǎn)物；分離純化步所得的表達(dá)產(chǎn)物，獲得重組蛋白，即擬穴青蟹抗脂多糖因子。擬穴青蟹抗脂多糖因子對(duì)革蘭氏陰性菌弗氏志賀氏菌、解藻朊酸弧菌、副溶血性弧菌、施氏假單胞菌和熒光假單胞菌，革蘭氏陽(yáng)性菌谷氨酸棒桿菌具有明顯抑制生長(zhǎng)作用和殺菌作用，在制備抑菌藥和作為動(dòng)物飼料抗菌添加劑中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K14/435GK102212124SQ201110127379
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月17日
發(fā)明者丁建, 劉海鵬, 王克堅(jiān), 陳榮元 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)