專利名稱：針對β淀粉樣肽的人源化抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體技術(shù)的領(lǐng)域，更具體地涉及針對β -淀粉樣肽的人源化抗體的領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默氏病(AD)是年齡相關(guān)的神經(jīng)變性失調(diào)，在2006年其影響了 2660萬 人。一些預(yù)測預(yù)計(jì)，到2050年，發(fā)病率將是四倍，到時(shí)，在世界范圍內(nèi)每85人中有1人將患 有該疾病(Brookmeyer et al. (2007))。AD自身顯現(xiàn)為漸進(jìn)性的認(rèn)知缺陷，例如記憶喪失 和認(rèn)知能力的降低。AD的病理的中心是腦部β -淀粉樣肽(Abeta)的積累。Abeta是淀粉樣前體蛋白 質(zhì)(APP)的裂解產(chǎn)物，其在淀粉樣變性途徑中首先被分泌酶、然后被Y分泌酶相繼裂 解。產(chǎn)生的Abeta片段具有可變的大小，而40個(gè)氨基酸的肽(Abeta4ci)是最豐富的種類，42 個(gè)氨基酸的肽(所謂的Abeta42)被認(rèn)為是最有害的種類。Abeta可以在腦的細(xì)胞外隙中積 累，在此它在多步驟的過程中聚集，形成神經(jīng)毒性寡聚體，最后與其他物質(zhì)一起產(chǎn)生淀粉樣 斑塊，其是阿爾茨海默氏病的典型標(biāo)志。治療阿爾茨海默氏病的有前景的臨床免疫學(xué)方法是被動(dòng)免疫，在其中，針對Abeta 的抗體被施用給受試者來從腦從除去Abeta。已經(jīng)提出了通過抗Abeta抗體的三種不同 但不互相排斥的Abeta清除機(jī)制(1)纖維狀A(yù)beta向較低毒性形式的催化轉(zhuǎn)化(Bard et al. (2000) ；Bacskai et al. (2001) ；Frenkelet al. (2000)) ； (2) Abeta 沉積的調(diào)理作 用，引起小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用(Bardet al. (2000) ；Bacskai et al. (2002) ；Frenkel et al. (2000)；和(3)促進(jìn)Abeta從腦向循環(huán)的流出(DeMattos et al. (2001))，所謂的外周 沉沒假說。蘇黎士大學(xué)的Mohajera等人(2004)和Gaugler等人(2005)產(chǎn)生了針對Abeta 的小鼠抗體，并研究了單克隆鼠抗Abeta抗體在體內(nèi)的生物活性。然而，當(dāng)施用給人類時(shí)，鼠抗體常常產(chǎn)生免疫原性。引發(fā)的抗球蛋白反應(yīng)限制了鼠 抗體的臨床實(shí)用性(Miller et al. (1983) ；Schroff et al. (1985))。因此，需要新的、非免疫原性的和有效的抗體，用于Abeta相關(guān)疾病、特別是阿爾 茨海默氏病的治療和/或診斷
發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一般目的是提供特異性結(jié)合Abeta (特別是Abeta的C-末端部分) 的且被人類免疫系統(tǒng)良好地耐受的抗體。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了分離的抗體，其選擇性地在C-末端區(qū)域與Abeta結(jié) 合，特別是氨基酸30到40 (SEQ ID NO :26)之間，并且是人源化的或完全人類的。所述抗 體展示了對Abeta42和Abeta4ci的高親和力，此外，在體內(nèi)基本上不識別淀粉樣前體蛋白質(zhì) (APP)。
所謂的人源化抗體的優(yōu)點(diǎn)在于它們引發(fā)人類免疫系統(tǒng)的一般是最小的反應(yīng)、或沒有反應(yīng)的能力，因而可以被認(rèn)為是在人類施用時(shí)是低免疫原性的或非免疫原性的。因而，與 鼠抗體相反，人源化的抗體適合于治療目的和臨床應(yīng)用。術(shù)語“人源化”是指降低異種抗體的免疫原性的公認(rèn)的技術(shù)。人源化抗體被遺傳工 程化，從而存在盡可能少的非人類結(jié)構(gòu)。一種策略是基于異種抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移 植到人類接受體框架的可變輕鏈VL和可變重鏈VH上。在另一種策略中，異種抗體的框架向 人類框架突變。在兩種情況中，抗原結(jié)合部分的功能的保存是關(guān)鍵的。為了這個(gè)目的，例如， 通過使用技術(shù)人員公知的分子建模的計(jì)算機(jī)程序，分析親本序列和各種概念上的人源化產(chǎn) 物的三維模型。所述分析，除其它之外例如允許鑒定可能直接或間接涉及抗原結(jié)合的框架 殘基。通常，少量的供體框架殘基對于抗原結(jié)合是重要的，因?yàn)樗鼈冞M(jìn)入與抗原的直接接 觸，或者它們影響特定CDR的構(gòu)象(Davies et al (1990) ；Chothia et al (1987))。因此，如 果尚不存在，希望的是朝著被鑒定為對于抗原結(jié)合重要的那些供體框架殘基來突變相應(yīng)的 接受體框架殘基。還可能的是，人源化抗體包含既不在體內(nèi)的人類種系全集(repertoire) 中、也不在供體CDR或甚至供體框架中存在的殘基?？贵w的人源化的程度可以通過計(jì)算人源化抗體的框架與原始人類接受體框架的 序列同一性百分比來表明，所述原始的人類接受體框架被用于產(chǎn)生人源化抗體并且是可從 人類文庫獲得的。優(yōu)選的，本發(fā)明的抗體包含與可從人類文庫獲得的框架具有至少60%的 同一性、(按以下順序)更優(yōu)選至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %和最優(yōu)選95 %或 甚至100%同一性的框架。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)”或“⑶R”是指構(gòu)成由 Kabat et al. (1991)所定義的抗原結(jié)合環(huán)體的、抗體的互補(bǔ)決定區(qū)。本發(fā)明的⑶R和框架 殘基根據(jù)Kabat (Kabat et al. (1987))的定義來確定。在此使用的術(shù)語“抗體”是指全長抗體，例如單克隆抗體，以及具有對選定抗原足 夠的結(jié)合能力的其任何抗原結(jié)合片段或單鏈。本發(fā)明涵蓋的抗原結(jié)合片段的實(shí)例包括Fab 片段、F(ab' ) 2片段、Fd片段、Fv片段；單結(jié)構(gòu)域或dAb片段、分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)； 可任任選地通過合成的接頭連接的兩個(gè)或更多個(gè)分離的CDR的組合以及單鏈可變片段 (scFv)?！叭L抗體”包括嵌合抗體，其中一個(gè)來源的抗原結(jié)合可變域聯(lián)結(jié)到不同的來源的 恒定域，例如，鼠抗體的可變域Fv結(jié)合到人類抗體的恒定域Fe。以上例舉的抗體片段使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得，與完整抗體 一樣來篩選所述片段的有用性。在本發(fā)明中，CDR來自單克隆的小鼠抗體22C4(Moha jeri et al. (2002), J. Biol. Chem. 277, pp. 33012-33017 and Neurodegenerative Dis. 1(2004), pp. 160-167)。所述鼠抗 體針對Abeta的C-末端部分，更具體地針對氨基酸30到40之內(nèi)的表位(SEQ ID NO 26)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗體通過與它的目標(biāo)結(jié)合來阻止Abeta、特別是 Abeta40和/或Abeta42的寡聚化。本發(fā)明提供了包含一個(gè)或更多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)序列的抗體，所述互補(bǔ)決定區(qū) 序列具有與由 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6構(gòu)成的組的序列的至少80%的同一性。如已經(jīng)提及的，本發(fā)明的CDR，即，SEQID NO =USEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6，可以移植到適合的接受體框架中。術(shù)語“框架”是指存在于更為趨異的CDR區(qū)域之間的、抗體可變區(qū)的本領(lǐng)域公認(rèn)的部分。這樣的框架區(qū)域一般被稱為框架1到4(FR1、FR2、FR3和FR4)，提供了將重鏈和輕鏈抗體可變區(qū)內(nèi)存在的三個(gè) CDR保持在三維空間中的支架，從而所述CDR可以形成抗原結(jié)合表面。適合的接受體框架優(yōu) 選的是免疫球蛋白衍生的抗原結(jié)合多肽的框架，它們是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于，VhH 結(jié)構(gòu)域、V-NAR 結(jié)構(gòu)域、Vh 結(jié)構(gòu)域、Fab、scFv、Bis-scFv、路輪 IG、IfNAR、IgG、Fab2、Fab3、 迷你抗體(minibody)、雙抗體(diabodies)、三抗體(triabodies)禾口四抗體(tetrabodies) (參見，Holliger，P. and Hudson, P. (2005)，Nat. Biotechnol. 23 (9)，pp. 1126-1136)?？?架序列還可以是人類框架序列的共有序列。抗體選自免疫球蛋白的任何種類，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及同種型，可 以包括超過一種種類或同種型的序列。優(yōu)選的，所述抗體包含與可從人類文庫獲得的框架具有至少60%的同一性、(按 以下順序)更優(yōu)選至少75%、至少80%、至少85%、至少90%和最優(yōu)選95%或甚至100% 同一性的框架。本發(fā)明的抗體是重組分子，因?yàn)棰荝可以嫁接到人類框架上，產(chǎn)生的抗體包含非 人類CDR，和人類的或基本上人類的框架。做為選擇，所述抗體來自非人類抗體，它的框架向 人類抗體突變。兩種可選方案都被術(shù)語“可從人類文庫獲得的”所涵蓋。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體是scFv抗體。scFv可以是包含通過短接 頭肽連接的VL和VH結(jié)構(gòu)域的全長scFv，所述短接頭肽例如包含序列GGGGS的1到4次重 復(fù)的接頭，優(yōu)選(GGGGS)4 肽(SEQ ID NO 25)，或在 Alfthan etal. (1995)Protein Eng. 8 725-731)中公開的接頭，或可以僅是具有對選定抗原的足夠結(jié)合能力的VL或VH結(jié)構(gòu)域。 VL和VH的連鍵可以是任何方向的，VL-接頭-VH，或VH-接頭-VL。在一個(gè)實(shí)施方式中，scFv的框架是在還原環(huán)境下是穩(wěn)定和可溶的。這些特征可 以通過如W001/48017中公開的所謂的質(zhì)量控制系統(tǒng)(Quality Controlsystem)來鑒定。 所述抗體的穩(wěn)定性優(yōu)選的是特別穩(wěn)定的lambda移植物的穩(wěn)定性的至少一半那么好，更優(yōu) 選至少與lambda移植物一樣好，最優(yōu)選超過lambda移植物。WSrilet al. (2000)描述 了在約2. OM GdnHCl下lambda移植物的變性的發(fā)動(dòng)。已經(jīng)顯示的是，在質(zhì)量控制系統(tǒng)中 進(jìn)行良好的scFvs在氧化條件下也是穩(wěn)定和可溶的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)Atha和 Ingham(1981)的方法測量的，本發(fā)明的抗體的溶解度是至少5mg/ml、更優(yōu)選至少10mg/ml， 最優(yōu)選至少20mg/ml。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗體包含可變輕鏈片段(VL)框架，其相同于或 衍生自由 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14,SEQ ID N0:15禾口 SEQ IDNO :16構(gòu)成的組的序列中所包含的框架 序列。在衍生的序列的情況下，所述序列顯示了與由SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14、SEQ ID N0:15 禾口 SEQ ID NO :16構(gòu)成的組的序列至少60%的同一性、(按以下順序)更優(yōu)選至少75%、至少80%、 至少85 %、至少90 %和最優(yōu)選95 %或甚至100 %的同一性。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包含可變重鏈片段(VH)框架，其相同 于或來自于由 SEQ ID N0:17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO 20, SEQ IDNO :21、SEQ ID NO 22 和SEQ ID NO :23構(gòu)成的組的序列中所包含的框架序列。在衍生的序列的情況下，所述序列顯示了與由 SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO 22 和SEQ ID NO :23構(gòu)成的組的序列至少60%的同一性、(按以下順序)更優(yōu)選至少75%、至 少80 %、至少85 %、至少90 %和最優(yōu)選95 %或甚至100 %的同一性。序列SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO: 12、SEQID NO: 13、 SEQ ID NO 14,SEQ ID NO15,SEQ ID NO 16,SEQ ID NO : 20、SEQ ID N0:21、SEQ ID NO: 22和SEQ ID而23在恥03/097697中公開。這些框架序列來自人免疫球蛋白來源，它們在 還原條件下的溶解度和穩(wěn)定性特征已經(jīng)在所謂的質(zhì)量控制系統(tǒng)中證實(shí)了，如在W001/48017 中公開的。更優(yōu)選的，所述抗體包含SEQ ID NO 7的VH片段和SEQ ID NO 17的VL序列。最優(yōu)選的，所述抗體具有與SEQ ID NO :24至少60%相同的、更優(yōu)選至少75%、 80%、90%、95%相同的序列。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體在結(jié)構(gòu)上由SEQ ID N0:24定義。在所述抗體中，SEQ ID NO :7和SEQ ID N0:17通過(GGGGS)4接頭連接。產(chǎn) 生的scFv抗體命名為ESBA212。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的是，本發(fā)明的序列可以被改變，從而它們在氨基酸序列上與在此公開的序列不同，而保持了與Abeta的C-末端部分的選擇性結(jié)合能力。因此， 人源化抗體的框架區(qū)或CDR區(qū)都不需要精確地對應(yīng)于供體CDR或接受體框架。其中的改變 可以通過通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變向抗體的核苷酸序列中導(dǎo)入一個(gè) 或更多個(gè)核苷酸取代、添加或刪除來產(chǎn)生。這樣的突變可以為不同的目的導(dǎo)入，例如，用于 改善抗體的結(jié)合、溶解度或穩(wěn)定性特征。本發(fā)明的抗體還可以包含在一個(gè)或更多個(gè)非必需 氨基酸殘基處的保守性氨基酸替換。在另一個(gè)實(shí)施方式中，例如通過飽和誘變，突變可以沿 著編碼序列的全部或部分被隨機(jī)地導(dǎo)入，產(chǎn)生的突變體可以篩選它們結(jié)合期望的目標(biāo)的能 力。兩個(gè)序列之間的同一性百分比是序列共有的相同位置的數(shù)量的函數(shù)，考慮到為了 兩個(gè)序列的最佳比對需要引入的缺口的數(shù)量、每個(gè)缺口的長度。兩個(gè)序列之間的序列比較 和同一性百分比的確定可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的數(shù)學(xué)算法來實(shí)現(xiàn)。同一性在此是 指通過使用可在互聯(lián)網(wǎng)上訪問的BLAST程序(BasicLocal Alignment Search Tools ；參見 Altschul, S. F. ，Gish, W. ，Miller, W. ，Myers, Ε. W. & Lipman，D. J. (1990) “ Basic local alignment search tool. " J. Mol. Biol. 215 :403_410)測定的?？梢杂?XBLAST 程序進(jìn) 行BLAST蛋白檢索，分值=50，字長=3，來比較本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子和氨基酸序列。為了 獲得用于比較目的的有缺口的比對，可以利用如Altschul et al.，(1997)NucleicAcids Res. 25 (17) 3389-3402 中描述的 Gapped BLAST。當(dāng)利用 BLAST 和 GappedBLAST 程序時(shí)，可 以使用各個(gè)程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步用作“查詢序列”來對公眾數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，例 如，來鑒定相關(guān)的序列。這樣的檢索可以使用前述的XBLAST程序(版本2.0)來進(jìn)行。本發(fā)明涵蓋的人源化成完全人類的抗體顯示了以下特征(i)結(jié)合Abeta的C-末端，因而以高親和力和基本上相同的親和力結(jié)合Abeta40和 Abeta42 兩者；(ii)展示了對Abeta的寡聚和單體形式的高度親和力；(iii)在體內(nèi)基本上不識別淀粉樣前體蛋白質(zhì)(APP)；
(iv)具有至少5mg/ml、優(yōu)選至少10mg/ml、更優(yōu)選至少20mg/ml的溶解度；和(ν)顯示了在人類施用時(shí)低的免疫原性或沒有免疫原性。進(jìn)一步的，所述抗體優(yōu)選地顯示了至少一種、更優(yōu)選超過一種、最優(yōu)選所有的以下特征(vi)介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞對纖維狀A(yù)beta的撮?。?vi)結(jié)合β _淀粉樣斑塊；(vii)除去腦中的β -淀粉樣斑塊和/或防止腦中淀粉樣斑塊的形成；(viii)降低Abeta毒性和神經(jīng)元對發(fā)作產(chǎn)生的興奮毒素性事件的相關(guān)易感性；(ix)跨越血腦屏障；和/或(χ)基本上恢復(fù)了正常的行為；(xi)除去腦中的β -淀粉樣纖維和/或防止腦中淀粉樣纖維的形成。本發(fā)明的抗體在體內(nèi)基本上不識別淀粉樣前體蛋白質(zhì)(APP)。優(yōu)選的，當(dāng)與對APP 的結(jié)合親和力相比時(shí)，對Abeta的結(jié)合親和力是更高至少2、更優(yōu)選至少5、再更優(yōu)選至少 10、特別優(yōu)選至少50、最優(yōu)選至少100倍。因而，在所述抗體向受試者施用時(shí)，APP不與Abeta競爭結(jié)合，因而所述抗體不干 擾未裂解的APP的生物學(xué)。例如，這種特征對于與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Abeta的異常積累和/ 或沉積相關(guān)的神經(jīng)失調(diào)的診斷目的和/或醫(yī)學(xué)治療是特別令人感興趣的。在此使用的術(shù)語“神經(jīng)失調(diào)”包括但不限于阿爾茨海默氏病、輕微的認(rèn)知損傷、失 語癥、額顳癡呆、Lewy-體疾病、帕金森氏病、Pick' s病、Binswanger‘ s病、腦淀粉樣血管 病、Down' s綜合癥、多梗塞癡呆、Huntington' s病、Creutzfeldt-Jakob病、愛滋病癡呆 綜合征、抑郁、焦慮失調(diào)、恐怖癥、Bell' s麻痹、癲癇癥、腦炎、多發(fā)性硬化；神經(jīng)肌肉失調(diào)、 神經(jīng)腫瘤失調(diào)、腦腫瘤、神經(jīng)血管的失調(diào)包括中風(fēng)、神經(jīng)免疫頭調(diào)、神經(jīng)耳科疾病、神經(jīng)損 傷，包括脊髓損傷、疼痛，包括神經(jīng)性疼痛、兒科神經(jīng)學(xué)和神經(jīng)精神病學(xué)的失調(diào)、睡眠失調(diào)、 Tourette綜合征、輕微的認(rèn)知損傷、血管性癡呆、多梗塞性癡呆、囊性纖維化、高雪氏病、其 他運(yùn)動(dòng)障礙、青光眼和一般的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的疾病。更優(yōu)選的，本發(fā)明的抗體用于阿 爾茨海默氏病、中風(fēng)、神經(jīng)外傷和青光眼的治療、預(yù)防、延緩發(fā)展或診斷。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的抗體被化學(xué)地修飾?；瘜W(xué)修飾可以改變抗體的性質(zhì)，例 如，穩(wěn)定性、溶解度、抗原結(jié)合特異性或親和力、體內(nèi)半衰期、細(xì)胞毒性和組織穿透能力?；?學(xué)修飾是技術(shù)人員公知的。本發(fā)明的抗體的優(yōu)選的化學(xué)修飾是PEG化。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體綴合到治療試劑，例如，毒素或化學(xué)治療化合物。所 述抗體可以綴合到放射性同位素，例如，而不限于，212Bi、125I、mI、9°Y、67Cu、212Bi、212At、211Pb、 47SC9Pd和188Re,用于諸如免疫治療。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體可以與標(biāo)記物連接。所述標(biāo)記物可以容許 抗體的比色檢測。做為選擇，所述抗體被放射性標(biāo)記。最優(yōu)選的，所述放射性標(biāo)記物是64Cu。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含在此公開的抗體的診斷工具或科學(xué)工具。本發(fā)明的抗體可以用于診斷或篩選淀粉樣變性或阿爾茨海默氏病的受試者，或測 定受試者發(fā)生淀粉樣變性或阿爾茨海默氏病的風(fēng)險(xiǎn)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明此外涵蓋診斷方法，包括向受試者、優(yōu)選的哺乳動(dòng) 物施用有效量的本發(fā)明的抗體的步驟。所述方法進(jìn)一步包括檢測標(biāo)記物的步驟。
在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋了包含在此描述的抗體的免疫分析，其中所述分析可以是體內(nèi)或體外的免疫分析。所述抗體可以在液相中使用，或結(jié)合于固相。這樣 的免疫分析的實(shí)例包括放射免疫分析(RIA)、流式細(xì)胞計(jì)、Western印跡和微陣列。此外，本發(fā)明涵蓋了包含在此公開的抗體的測試試劑盒。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的纖維狀A(yù)beta的攝取，從 而降低體內(nèi)Abeta水平。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體在施用有效量時(shí)改善了認(rèn)知行為，拯 救了患有阿爾茨海默氏病的患者中的不成熟的神經(jīng)元的數(shù)量。此外，本發(fā)明涵蓋包含在此公開的抗體的藥物組合物，來治療、預(yù)防和/或延遲發(fā) 展以中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的Abeta的異常積累和/或沉積為特征的神經(jīng)失調(diào)或淀粉樣變性，特 別是阿爾茨海默氏病。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了制造用于治療、預(yù)防和/或延遲發(fā)展上述 神經(jīng)失調(diào)(優(yōu)選阿爾茨海默氏病)的藥物組合物的方法，包括將在此公開的抗體與至少一 種適合的藥物載體組合的步驟。優(yōu)選的，在此公開的藥物組合物阻止和/或降低在受試者的腦中Abeta積累的作用。所述抗體可以與藥學(xué)上可接受的載體組合地或與一種或更多種進(jìn)一步的有效試 劑組合地施用。有效試劑可以是小的有機(jī)分子和/或抗Abeta抗體。在此公開的抗體和/或藥物組合物可以以不同的方式，例如，靜脈內(nèi)地、腹膜內(nèi)、 鼻內(nèi)地、皮下地、肌內(nèi)注射地、表面地或皮內(nèi)地、頭骨內(nèi)地、鞘內(nèi)地施用到腦脊液中。優(yōu)選的 施用種類是(以這個(gè)順序)經(jīng)鼻內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)向腦脊液和顱內(nèi)的施用。一般使用的制劑是技術(shù)人員已知的。例如，氣霧制劑例如鼻噴霧制劑包括活性試 劑與防腐劑和等滲試劑的純化的水溶液或其他溶液。這樣的制劑優(yōu)選的被調(diào)節(jié)到與鼻粘膜 相容的PH值和等滲狀態(tài)。此外，其他試劑的共同施用或相繼施用也是期望的。優(yōu)選的，在阿爾茨海默氏病的 情況下所述抗體以足夠恢復(fù)正常的行為和/或認(rèn)知性質(zhì)的量存在。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了治療、預(yù)防和/或延遲發(fā)展如上所述的神 經(jīng)疾病的方法，包括向有需要的受試者施用有效量的本發(fā)明的抗體的步驟。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供哺乳動(dòng)物的被動(dòng)免疫的方法，包括向哺乳動(dòng)物施用在 此公開的抗體的步驟。優(yōu)選的，所述被動(dòng)免疫在抗Abeta免疫治療的范疇內(nèi)進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的特征是分離的核酸序列，其包含編碼本發(fā)明所涵 蓋的氨基酸序列的序列。所述核酸可以是DNA或RNA，可以是單鏈的或雙鏈的。此外，本發(fā)明提供了含有DNA序列的克隆或表達(dá)載體，所述DNA序列編碼本發(fā)明的 多肽、最優(yōu)選的抗體。此外，提供了攜帶載體和/或核酸序列的適合的宿主細(xì)胞，所述載體和/或核酸序 列包含編碼在此公開的氨基酸序列的序列。這可以是原核或真核細(xì)胞，特別是大腸桿菌、酵 母、植物、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明的抗體可以使用重組分子生物學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生。知道多肽的序列， 本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過基因合成產(chǎn)生編碼所述多肽的相應(yīng)的cDNA。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了生產(chǎn)本發(fā)明的抗體的方法，包括在容許所述抗體的合成的條件下，培養(yǎng)用編碼所述抗體的DNA轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，并從所述培養(yǎng)物回收所述分 子。優(yōu)選的，所述方法提供了從大腸桿菌包涵體，或如果使用的scFv構(gòu)建體包含指導(dǎo)多肽 進(jìn)入周質(zhì)的信號序列，從大腸桿菌周質(zhì)純化的scFv抗體?？赡鼙匦璧氖前ㄖ匦聫?fù)性的步 驟來將抗體重折疊為功能分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了治療的方法，包括向有需要的受試者施用 治療有效量的在此描述的多核苷酸、載體或宿主細(xì)胞的步驟。在第二方面，本發(fā)明提供了診斷的方法，包括步驟⑴標(biāo)記抗體；(ii)向受試者鼻內(nèi)地或全身地施用有效劑量的所述抗體；和(iii)檢測所述受試者的身體部分中所述標(biāo)記的抗體的濃度和/或存在。所述抗體優(yōu)選的是針對本發(fā)明的Abeta的氨基酸30到40之內(nèi)形成的表位的人源 化抗體，優(yōu)選的是單鏈抗體(scFv)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗體是用正電子發(fā)射同位 素、最優(yōu)選的64Cu標(biāo)記的。在此使用的術(shù)語“有效劑量”是指足夠?qū)崿F(xiàn)或至少部分實(shí)現(xiàn)期望的效果，例如，可 檢測的信號的量。針對這種用途的有效的量將取決于標(biāo)記物的檢測強(qiáng)度、受試者的體重以 及要檢查的區(qū)域的程度。優(yōu)選的，所述受試者是哺乳動(dòng)物；更優(yōu)選的，所述受試者是人類。產(chǎn)生身體部分的三維圖像的醫(yī)學(xué)成像技術(shù)電子發(fā)射斷層掃描(PET)是基于來自 正電子的發(fā)射的放射性的檢測。一般地，生物分子是放射活性標(biāo)記的，例如，它包括放射性 示蹤劑同位素。在一般通過注射到血液循環(huán)中來向受試者施用標(biāo)記的生物分子之時(shí)，放射 活性標(biāo)記的生物分子變?yōu)樵诟信d趣的組織濃縮的。受試者然后被置于成像掃描器中，其檢 測正電子的發(fā)射。在一個(gè)實(shí)施方式中，64Cu標(biāo)記的抗體被施用給受試者，通過將受試者置于成像掃描 器中并檢測正電子的發(fā)射來進(jìn)行步驟iii)。因而本發(fā)明涵蓋PET成像的方法，包括向受試者施用本發(fā)明的64Cu標(biāo)記的抗體的 步驟。本發(fā)明的序列是以下的SEQ. ID. No. 1 :VL 的 CDRlRASSSVNYMHSEQ. ID. No. 2 :VL 的 CDR2ATSNLASSEQ. ID. No. 3 :VL 的 CDR3QQffRTNPPT SEQ. ID. No. 4 :VH 的 CDRlEYTMHSEQ. ID. No. 5 :VH 的 CDR2GVNPYNDNTSYIRKLQGSEQ. ID. No. 6 :VH 的 CDR3
YGGLRPYYFPMDF
SEQ. ID. No. 7 :ESBA212 的 VLADIVLTQSPSSLSASV⑶RVTLTCRASSSVNYMHWYQQRPGKPPKALIYATSNLASGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPEDVAVYYCQQWRTNPPTFGQGTKLEVKRSEO. ID. No. 8 框架 2. 3 的 VLAEIVLTQSPSSLSASV⑶RVTLTCRASQGIRNELAWYQQRPGKAPKRLIYAGSILQSGVPSFSGSGSGT EFTLTISSLQPEDVAVYYCQQYYSLPYMFGQGTKVDIKRSEO. ID. No. 9 :22C4 的 VLDIVLTQSPAILSASPGEKVTLTCRASSSVNYMHWYQQKPGSPPKAWIYATSNLASGVPDRFSASGSGTS YSLTISRVEAEDAATYYCQQffRTNPPTFGAGTKLELKRSEQ. ID. No. 10 :VL AEIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGA EFTLTISSLQPDDFATYYCQQYKSYffTFGQGTKLTVLG ；SEQ. ID. No. 11 :VL BEIVLTQSPSSLSASV⑶RVTLTCRASQGIRNELAWYQQRPGKAPKRLIYAGSILQSGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPEDVAVYYCQQYYSLPYMFGQGTKVDIKR ；SEQ. ID. No. 12 :VL CEIVMTQSPATLSVSPGESAALSCRASQGVSTNVAWYQQKPGQAPRLLIYGATTRASGVPARFSGSGSGT EFTLTINSLQSEDFAAYYCQQYKHWPPWTFGQGTKVEIKR ；SEQ. ID. No. 13 :VL DQSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNI⑶NYVSWYQQLPGTAPQLLIYDNTKRPSGIPDRFSGSKSG TSATLGITGLQTCDEADYYCGTWDSSLSGWFGGGTKLTVLG ；SEQ. ID. No. 14 :VL EEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQTLTHYLAWYQQKPGQAPRLLIYDTSKRATGVPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDSALYYCQQRNSWPHTFGGGTKLEIKR ；SEQ. ID. No. 15 :VL FSYVLTQPPSVSVAPGQTATVTCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNT ATLTIRRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHNVFGSGTKVEIKR ；SEQ. ID. No. 16 :VL GLPVLTQPPSVSVAPGQTARISCGGNNIETISVHWYQQKpGQAPVLVVSDDSVRPSGIPERFSGSNSGNT ATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDYVVFGGGTKLTVLG ；SEO. ID. No. 17 :ESBA212 的 VHQVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCTASGYTFTEYTMHWVRQAPGQGLEWMGGVNPYNDNTSYIRKLQGRVT LTVDRSSSTAYMELTSLTSDDTAVYYCARYGGLRPYYFPMDFWGQGTLVTVSSSEQ. ID. No. 18 框架 2. 3 的 VHQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYSFTGYFLHWVRQAPGQGLEWMGRINPDSGDTYAQKFQDRVTL TRDTSIGTVYMELTSLTSDDTAVYYCARVPRGTYLDPWDYFDYWGQGTLVTVSSSEQ. ID. No. 19 :22C4 的 VHQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGVNPYNDNTSYIRKLQGKVTLTVDRSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCARYGGLRPYYFPMDFWGQGTSVTVSS
SEQ. ID. No. 20 :VH HQVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAHVLRFLEWLPDAFDIWGQGTLVTVS SSEQ. ID. No. 21 :VH IEIVLTQSPSSLSASL⑶RVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSSQSGVPSRFRGSESGT DFTLTISNLQPEDFATYYCQQSYRTPFTFGPGTKVEIKRSEQ. ID. No. 22 :VH JVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYSFTGYFLHWVRQAPGQGLEWMGRINPDSGDTIYAQKFQDRVTL TRDTSIGTVYMELTSLTSDDTAVYYCARVPRGTYLDPWDYFDYWGQGTLVTVSSSEQ. ID. No. 23 :VH KEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDAGIAVAGTGFDYWGQGTLVTVSSSEQ. ID. No. 24 :ESBA212 (根據(jù)Kabat的CDR被劃了下劃線，接頭序列以斜體顯示)ADIVLTQSPSSLSASV⑶RVTLTCRASSSVNYMHWYQQRPGKPPKALIYATSNLASGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPEDVAVYYCQQffRTNPPTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGPEVKKPGASV KVSCTASGYTFTEYTMHWVRQAPGQGLEWMGGVNPYNDNTSYIRKLQGRVTLTVDRSSSTAYMELTSLTSDDTAVYY CARYGGLRPYYFPMDFffGQGTLVTVSSSEQ. ID. No. 2S 接頭GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSEQ. ID. No. 26 =Abeta30^0 表位AIIGLMVGGVV除非另外定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè) 普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。雖然類似于或等同于在此描述的那些的方法和材料 可以被用于本發(fā)明的實(shí)踐和測試，但是以下描述了適合的方法和材料。在沖突的情況下，當(dāng) 前的說明書，包括定義，是支配性的。此外，材料、方法和實(shí)施例僅是說明性的，而不意圖是 限制性的。要理解的是，各種實(shí)施方式、優(yōu)選項(xiàng)和范圍可以隨意地組合。進(jìn)一步的，根據(jù)特定 的實(shí)施方式，選定的定義、實(shí)施方式或范圍可能不適用。附圖的簡要描述當(dāng)參考以下的詳細(xì)描述時(shí)，本發(fā)明將被更好地理解，上文所述以外的目的將變得 顯而易見。這樣的描述引用了附隨的圖畫，其中附

圖1顯示了 ESBA212的輕鏈可變區(qū)與ESBATech的框架2. 3的VL的序列比較， 在所述VL上移植了來自22C4的Abeta特異性CDR。在附圖2中，說明了 ESBA212的可變重鏈VH與ESBATech的框架2. 3的VH的序列 比較。附圖3描繪了 ESBA212的VH與來自小鼠22C4抗體的原始VH之間的序列比對。附圖4顯示了 ESBA212、22C4和框架的VH的序列比時(shí)。附圖5顯示了 AD小鼠模型中通過ESBA212的斑塊離體標(biāo)記的結(jié)果。使用了石蠟切片或冷凍切片(非固定的和后固定的)。附圖5A:小鼠模型SwePSl，石蠟切片；附圖5B:小鼠模型SwePSl，冷凍切片；附圖5C 小鼠模型SweArc，石蠟切片；附圖5D 小鼠模型SweArc， 冷凍切片。附圖6描述了在人類AD腦中通過ESBA212的斑塊離體標(biāo)記的結(jié)果。使用了石蠟 切片或冷凍切片(非固定的和后固定的)。附圖6A:石蠟切片；附圖6B:冷凍、丙酮固定的； 附圖6C 冷凍，末處理的；附圖6D 冷凍；丙酮固定的，在檸檬酸鹽緩沖液中沸騰10分鐘。附圖7 顯示了 ESBA212(附圖 7A)和硫磺素(Thioflavine) S (附圖 7B)對 SwePSl 小鼠的腦切片的淀粉樣斑塊的離體染色。附圖8說明了與FITC標(biāo)記的Abeta42單體結(jié)合的ESBA212的大小排阻層析的結(jié) 果(附圖8A)，在附圖8B中是框架FW2. 3與FITC標(biāo)記的Abeta42單體孵育的對照。附圖9顯示了利用轉(zhuǎn)基因的SwePSl小鼠(附圖9A 泳道1 :ESBA212，泳道2 :6E10) 的腦組織勻漿和ADDLs (附圖9B ；泳道1 :Fw 2. 3，泳道2 :ESBA212，泳道3 :6E10)作為抗原 的兩個(gè)Abeta42免疫印跡。ESBA212主要識別單體，較弱地識別三聚體。附圖10 通過ELISA的ESBA212的親和力的鑒定(附圖IOA 對于Abeta40 ；親合 常數(shù)6. 26nM ；附圖10B，對于Abeta42 ；親合常數(shù)6. 3InM)。附圖11 :ESBA212的質(zhì)譜法。附圖12描繪了 FT-IR光譜，顯示了在25到95°C的不同溫度下ESBA212的解折疊 的百分比。附圖13 顯示了在存在(泳道1)或不存在(泳道2)小鼠腦組織勻漿的情況下孵 育的ESBA212的穩(wěn)定性的Western印跡。附圖14 硫黃素T分析的結(jié)果展現(xiàn)了 ESBA212在體外抑制Abeta42寡聚化。附圖15 在單次靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射之后，隨著時(shí)間的過去，ESBA212的平均血清 濃度。附圖16 在鼻內(nèi)的(附圖16A)或靜脈內(nèi)的(附圖16B)施用之后結(jié)合的ESBA212 的檢測。ESBA212獨(dú)立于所選的施用途徑在腦中與淀粉樣斑塊結(jié)合。附圖17 在鼻內(nèi)的施用(附圖17A)和硫黃素S染色(附圖17A)之后SwePSl小 鼠腦中結(jié)合的ESBA212的檢測確認(rèn)了 ESBA212結(jié)合淀粉樣斑塊。附圖18 與ESBA212(附圖18A和C)相比的，64Cu_ESBA212 (附圖18B和D)對淀粉 樣斑塊的離體標(biāo)記。附圖18A和B顯示了石蠟切片，而附圖18C和D顯示了冷凍切片。附圖19 在鼻內(nèi)的施用24小時(shí)和48小時(shí)之后小鼠(SwePSl)腦切片上結(jié)合的 ESBA212和CU-ESBA212的檢測。附圖19A 24小時(shí)后的ESBA212 ；附圖19B 48小時(shí)后的 ESBA212 ；附圖 19C :24 小時(shí)后的 Cu_ESBA212 ；附圖 19D :48 小時(shí)后的 Cu_ESBA212。附圖20 在靜脈內(nèi)的ESBA212注射之后腎中ESBA212的檢測。附圖21 類似于附圖16A的進(jìn)一步的鼻內(nèi)施用，顯示了在用200 μ g的ESBA212的 鼻內(nèi)處理1小時(shí)之后灌注的動(dòng)物的固定SwePSl小鼠腦切片上的Αβ-染色。附圖21Α 用抗His抗體染色的附圖21B:用6E10染色的對照附圖21C 用抗兔Cy3染色的陰性對照附圖21D 用22c4IgG染色的對照。
附圖22 在用PBS、22c4IgG禾口 ESBA212治療3個(gè)月之后APPswe/PSl ΔE9小鼠中的腦A β 40和42水平。附圖22Α 可溶級分(TBS)附圖22Β 不溶的級分(GuHCl)附圖22C 膜結(jié)合的級分(TBS-Triton)附圖23 用6Ε10染色的和使用ImageJ軟件評估的治療的APPswe/PSl ΔΕ9小鼠 的石蠟切片。附圖23Α:斑塊數(shù)量附圖23Β:斑塊面積。實(shí)施本發(fā)明的方法實(shí)施例1 :ESBA212的產(chǎn)生來自鼠抗體22C4的單鏈抗體ESBA212的抗原結(jié)合部分由蘇黎士大學(xué)鑒定。Abeta 特異性小鼠IgG抗體22C4通過用Abeta3crt2免疫小鼠產(chǎn)生，因而是針對Abeta的C-末端的。 根據(jù)Burmester and Pluckthun (2001)通過RT-PCR進(jìn)行VL和VH結(jié)構(gòu)域的克隆。簡要地， mRNA來源于產(chǎn)生抗體22C4的雜交瘤細(xì)胞。進(jìn)行利用Burmester和PlUckthun描述的引物 的RT-PCR，來擴(kuò)增VL和VH結(jié)構(gòu)域。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域通過SOE-PCR (通過重疊延伸的剪接)來組 裝。然后，擴(kuò)增的單鏈可變片段(scFv)通過SfiI消化，克隆到適合的表達(dá)載體中并測序。 因而獲得小鼠scFv片段，其保持了它對Abeta42的特異性。所述scFv被人源化產(chǎn)生單鏈抗 體ESBA212(序列比較參見附圖1到4。附圖1和2顯示了 ESBA212與框架2. 3的序列比 對，在框架2. 3上移植了來自22C4的Abeta特異性O(shè)TR)。編碼ESBA212的質(zhì)粒被導(dǎo)入適合的大腸桿菌菌株(例如BL21)，表達(dá)為包涵體。功 能性單鏈抗體通過包涵體的重折疊和隨后通過凝膠過濾純化來獲得。實(shí)施例2 在組織切片上與淀粉樣斑塊結(jié)合為了測試scFv ESBA212是否能夠識別Abeta，對含有淀粉樣斑塊的腦組織進(jìn)行離 體免疫染色。因而，使用了表達(dá)引起Abeta斑塊形成的人類APP的各種轉(zhuǎn)基因小鼠(SweArc， SwePSl)的腦組織切片和來自人類阿爾茨海默氏病患者的腦切片。ESBA212獨(dú)立于使用的阿爾茨海默氏病小鼠模型在來自小鼠的冷凍和石蠟切片上 與淀粉樣斑塊反應(yīng)(附圖5)。ESBA212還在固定的人類阿爾茨海默氏病組織上染色斑塊 (附圖6A)。特別是在血管周圍，可以觀察到稱為淀粉樣血管病的強(qiáng)染色。淀粉樣血管病是 指β-淀粉樣蛋白在大腦皮層和柔腦膜的小的和中等大小的血管中的沉積。然而，ESBA212 不結(jié)合人類冷凍切片上的淀粉樣斑塊，非固定的(附圖6Β)和后固定的(附圖6C、D)切片 也都不結(jié)合。在人類和嚙齒動(dòng)物切片之間的不同結(jié)果可以解釋為轉(zhuǎn)基因小鼠過量表達(dá)人類 ΑΡΡ，因而不同斑塊種類的豐度與人類相比可能不同。GUntert等(2006)描述了，在轉(zhuǎn)基因 小鼠模型和人類AD腦中分散的斑塊之間存在超微結(jié)構(gòu)差異。在小鼠腦中，不同大小的致密 的斑塊代表了大多數(shù)的。在人類AD患者的皮層和海馬中，這種斑塊類型僅發(fā)生10%，而核 心的斑塊占優(yōu)勢(-90% ) (GUntert etal.，2006)。由于這些觀察到的差異，在轉(zhuǎn)基因小鼠 的腦中C-末端可能是可接近的，而在AD患者的腦中不是。人類腦組織的固定可能以一定 方式改變淀粉樣斑塊的構(gòu)象，否則被包埋的C-末端表位被暴露，變?yōu)閷SBA212是可接近的。附圖7顯示了 ESBA212與SwePSl腦切片上的淀粉樣斑塊的特異性結(jié)合，因?yàn)镋SBA212的染色模式與硫黃素S的模式相符，硫黃素S是特異性結(jié)合淀粉樣蛋白質(zhì)沉積物的 標(biāo)準(zhǔn)的熒光染料。實(shí)施例3 與Abeta42單體的結(jié)合通過大小排阻層析可以顯示的是，ESBA212結(jié)合FITC標(biāo)記的Abeta42。ESBA212與 FITC-Abeta42共同孵育并加載到柱上。ESBA212和FITC-Abeta42 —起洗脫(附圖8A)，因?yàn)?ESBA212的峰和FITC-Abeta42的峰精確地重疊，并顯示了與單獨(dú)的ESBA212 (數(shù)據(jù)未顯示) 相比有5kDa大小的位移，因而代表了結(jié)合的FITC-Abeta42 (5kDa)。然而，框架FW2. 3含有 與ESBA212相同的框架區(qū)域但是沒有Abeta特異性CDR，當(dāng)FITC_Abeta42與框架FW2. 3孵 育時(shí)，存在著觀察到的兩個(gè)明顯不同的峰，一個(gè)是scFv的，第二個(gè)是FITC-Abeta42的(附 圖 8B)。實(shí)施例4 與不同Abeta42構(gòu)象的結(jié)合進(jìn)行Abeta42免疫印跡來進(jìn)一步表征ESBA212的特異性。因而，SwePSl小鼠的腦 組織勻漿以及體外產(chǎn)生的ADDL(淀粉樣β-衍生的可擴(kuò)散的配體，通過Klein的方案)在 SDS凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到膜上。ESBA212和6E10(Abeta特異性IgG作為對照)被用于檢測 Abeta0對照抗體6E10識別Abeta42單體、β -殘端、三聚體以及金長APP。然而，ESBA212 主更識別Abeta42單體(附圖9)。實(shí)施例5 親和力的體外表征ESBA212的結(jié)合性質(zhì)在ELISA中測試，其中Abeta40和Abeta42分別被用作抗原。 96孔平板用稀釋度緩沖液(PBS/0. 01% BSA/0. 2% Tween-20)中的5μ g/ml中性親和素 (neutravidin)包被，在4°C孵育過夜。平板然后用TBS/0. 005% Tween-20洗滌3次。生 物素化的Abeta40或Abeta42 (稀釋緩沖液中1 μ g/ml)添加到每個(gè)反應(yīng)孔，在室溫下孵育 平板15分鐘。如上述洗滌平板，通過添加稀釋緩沖液阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。平板在室溫 下孵育另外1.5小時(shí)，同時(shí)搖動(dòng)。在洗滌之后，從0到500nM的制備的ESBA212稀釋物一式 三份添加到反應(yīng)孔中，在室溫下(RT)搖動(dòng)孵育1小時(shí)。洗滌平板，ESBA212通過純化的兔多 克隆抗ESBA212抗體(稀釋緩沖液中1 10000)在RT下1小時(shí)來檢測。在洗滌之后，辣 根過氧化酶標(biāo)記的抗兔IgG (稀釋緩沖液中1 4000)被用于檢測早先結(jié)合的兔抗體，POD 用作底物。通過添加IM HCl停止反應(yīng)，在450nm讀取光吸收。根據(jù)測量的ESBA212曲線，可以計(jì)算EC50。對于ESBA212，對Abeta40和對Abeta42 的EC50被測定為處在1-15ηΜ的范圍內(nèi)(附圖10)。實(shí)施例6:質(zhì)量測定通過電噴質(zhì)譜法測定ESBA212的精確質(zhì)量。因而，純化ESBA212，在50 %乙腈 /0.2%甲酸(pH2)中測量。質(zhì)譜(neuttral mass(中性質(zhì)量))使用MaxEntl軟件來解卷 積。ESBA212 的質(zhì)量測定為 26517Da(附圖 11)。實(shí)施例7 通過PEG沉淀的溶解度測定ESBA212的表觀溶解度在存在聚乙二醇3000 (PEG3000)的情況下根據(jù) Athaand Ingham (1981)的方法測量。ESBA212 (20mg/ml)與等體積的含有不同濃度的PEG3000 (30-50% )的緩沖液孵育，產(chǎn)生最終蛋白質(zhì)濃度10mg/ml和最終PEG濃度15-25%。在室溫下孵育30分鐘之后，樣品進(jìn)行離心，上清液中的蛋白質(zhì)濃度根據(jù)280nm的吸光度來 測定。表觀溶解度通過相對于上清液中測定的蛋白質(zhì)濃度的對數(shù)標(biāo)繪PEG濃度來計(jì)算。溶 解度通過外推到0% PEG來測定。ESBA212的溶解度被測定為大約20mg/ml。實(shí)施例8 熱穩(wěn)定性的測定ESBA212的熱穩(wěn)定性通過在Bruker Tensor 27光譜儀上在溫度從25_95°C提高時(shí) 測量傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜來測定。在測量光譜之前，ESBA212在每個(gè)溫度下放置 1-2分鐘以平衡。ESBA212的熔解溫度(蛋白質(zhì)的50%解折疊)被測定為在62.8°C。然而，ESBA212 的解折疊在約40°C下已經(jīng)開始(附圖12)。實(shí)施例9 體外的Abeta聚集阻止研究ESBA212是否能夠抑制Abeta42寡聚化的形成。因而，在溶液中進(jìn)行硫黃素 T分析。硫黃素T與聚合的Abeta纖絲快速地締合，產(chǎn)生482nm處的增強(qiáng)的發(fā)射，與游離染 料的445nm的相對。這種改變?nèi)Q于Abeta的聚集的狀態(tài)，因?yàn)閱误w的或二聚的肽不反應(yīng) (LeVine III，1993)。2. 5 μ M Abeta42在存在硫黃素T和500mM NaCl的情況下與或不與2. 27 μ M ESBA212 一起孵育。如在附圖14中可見的，在3小時(shí)內(nèi)，ESBA212的存在明顯地體外抑制 Abeta寡聚化，因?yàn)樵?82nm處測量的熒光沒有提高。相比之下，當(dāng)不向溶液添加ESBA212 時(shí)，測量到更高的熒光值，表明Abeta聚合物的形成。實(shí)施例10 藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的體內(nèi)表征為了測定ESBA212的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，APP轉(zhuǎn)基因小鼠以及非轉(zhuǎn)基因的同窩出生 仔用ESBA212的單次注射靜脈內(nèi)地成腹膜內(nèi)處理。在注射后預(yù)定的時(shí)點(diǎn)，眼窩后抽取血液， 血清中ESBA212的數(shù)量通過定量ELISA來測量，使用Pk-Summit軟件分析數(shù)據(jù)。動(dòng)物對于藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，使用Prof. Dr. R. Nitsch (蘇黎士大學(xué))產(chǎn)生的阿爾茨 海默小鼠模型。這些小鼠(PrP-APP Sw/Arc 10+)過量表達(dá)人類APP695，其在處于朊病毒 蛋白質(zhì)啟動(dòng)子控制下，含有在單個(gè)構(gòu)建體中的Swedish和Arctic突變(Knobloch et al， 2006)。小鼠在C57BL/6和DBA/2的雜交背景下繁殖，防止健康和繁育問題的出現(xiàn)。這個(gè)株 系的特征是i)自6月齡起，與損害的認(rèn)知功能相關(guān)的早期細(xì)胞內(nèi)Abeta沉積的形成；ii) 自7月齡開始斑塊的形成，以及接下來數(shù)月的高度增加。β _淀粉樣斑塊的這種發(fā)展與嚴(yán)重 的腦淀粉樣血管病(CAA)相符(Knobloch et al. 2006)。用于藥物動(dòng)力學(xué)研究的小鼠是6月齡的。實(shí)驗(yàn)過程藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)在ESBA212的靜脈內(nèi)的或腹膜內(nèi)注射之后測定。在靜 脈內(nèi)治療的情況下，使用APP轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因的同窩小鼠。2只動(dòng)物的7個(gè)組接受 PBS pH 6. 5中的15mg/kg ESBA212的單次靜脈內(nèi)注射。在預(yù)定的時(shí)點(diǎn)(10和30分鐘、1、2、 4、8、12和24小時(shí))眼窩后地抽取血液，其以每個(gè)時(shí)點(diǎn)可以采集4個(gè)樣品的方式(例外在 10分鐘和24小時(shí)僅2個(gè)樣品)。血清中的ESBA212濃度通過定量ELISA來測量。在ESBA212的腹膜內(nèi)施用的情況下，僅使用APP轉(zhuǎn)基因小鼠。2只動(dòng)物的7個(gè)組接 受PBS，pH 6. 5中20mg/kg ESBA212的單次腹膜內(nèi)注射。血液樣品是如上文對靜脈內(nèi)的處理描述的。結(jié)果在ESBA212的靜脈內(nèi)注射之后，全身性PK遵循雙相清除。在注射時(shí)，存在 著清楚的分配階段(α-清除，0-1小時(shí))以及觀察到末端清除階段(β-清除，8-12小時(shí)) (附圖15)。在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小鼠中，分別在α-清除(0.26對比0.23h)和末端半衰 期(8.79對比7.1讓)方面沒有顯著差異(表1)。并且，在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小鼠中，另外 計(jì)算的PK值是可比較的。然而，觀察到的分布 體積(Vd)是相當(dāng)高的(77. 69和76. 72ml)。 這可能暗示了 ESBA212非常好和快速地穿透到組織中。相反，當(dāng)腹膜內(nèi)施用ESBA212時(shí)，存 在著在藥物動(dòng)力學(xué)方面觀察到的差異。可以檢測到清楚的吸收階段，具有在注射后1小時(shí) 的峰值ESBA212血清濃度。然后，分布半衰期比靜脈內(nèi)施用之后的長大約5倍，這可以得到 啟示，當(dāng)通過腹膜內(nèi)的途徑注射時(shí)，獲得了沉積效應(yīng)。然而，在腹膜內(nèi)注射后計(jì)算的末端半 衰期比靜脈內(nèi)注射稍短。還在生物體中ESBA212的平均留存時(shí)間(MRT)方面檢測到清楚的 差異，當(dāng)scFv腹膜內(nèi)地注射而不是靜脈內(nèi)地注射時(shí)，其更長約是3倍。在注射的靜脈內(nèi)和腹 膜內(nèi)途徑之間的AUC(曲線下面積)、分布容積(Vd)和清除(CL)中觀察到的差異可以由腹 膜內(nèi)治療的動(dòng)物接受了更高劑量是ESBA212(20mg/kg而不是15mg/kg)來解釋。當(dāng)根據(jù)對 20mg/k g獲得的值計(jì)算15mg/kg的腹膜內(nèi)劑量的PK參數(shù)時(shí)，獲得了以下的參數(shù)在吸收、分 布、清除半衰期方面以及在MRT方面沒有變化。然而，AUC (79. 124μ g-h/ml)、Vd(67. 52mL) 和CL(7. 84ml/h)則是與靜脈內(nèi)注射后獲得的值相當(dāng)?shù)摹１? 在ESBA212的靜脈內(nèi)的和腹膜內(nèi)注射之后的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù) 實(shí)施例11 體內(nèi)斑塊標(biāo)記研究當(dāng)靜脈內(nèi)地或鼻內(nèi)地施用時(shí)，ESBA212是否能夠結(jié)合淀粉樣斑塊。因此，通過靜脈內(nèi)的或鼻內(nèi)的施用途徑，轉(zhuǎn)基因的SwePSl小鼠每24h用210yg的ESBA212治療3次。首次施用72h之后，動(dòng)物用PBS灌注，分析腦中ESBA212的存在。ESBA212 在所述scFv的靜脈內(nèi)和鼻內(nèi)施用之后結(jié)合于腦中的淀粉樣斑塊(附圖16)。硫黃素S染色 確認(rèn)了 ESBA212實(shí)際地結(jié)合淀粉樣斑塊。用ESBA212鼻內(nèi)地治療的SwePSl小鼠的連續(xù)的 腦切片顯示了 ESBA212和硫黃素S的相同染色模式(附圖17)。實(shí)施例12 使用64Cu標(biāo)記的ESBA212的PET成像ESBA212的64Cu標(biāo)記ESBA212偶聯(lián)到結(jié)合了同位素(64Cu的半衰期是12. 7小時(shí)) 的CPTA螯合劑(大約200Da，具有4個(gè)N原子的大環(huán))。螯合劑偶聯(lián)到ESBA212內(nèi)的賴氨 酸殘基。偶聯(lián)是輕度的，不是每個(gè)賴氨酸都被標(biāo)記。通過質(zhì)量測定顯示了，平均兩個(gè)CPTA 分子結(jié)合到每個(gè)ESBA212分子。實(shí)施例13 通過64Cu_ESBA212的斑塊的離體標(biāo)記為了確定64Cu_ESBA212是否仍然能夠結(jié)合淀粉樣斑塊，對固定和非固定的 SwePSl小鼠腦切片進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。64Cu標(biāo)記不改變ESBA212的結(jié)合性質(zhì)，因?yàn)?64Cu-ESBA212仍然能夠結(jié)合固定以及非固定的腦切片上的淀粉樣斑塊(附圖18)。實(shí)施例14 通過64Cu_ESBA212的斑塊體內(nèi)標(biāo)記使用轉(zhuǎn)基因的SwePSl小鼠體內(nèi)研究了低溫標(biāo)記的Cu_ESBA212的結(jié)合性質(zhì)。小鼠 接受210 μ g ESBA212或100μ g Cu_ESBA212的鼻內(nèi)施用。動(dòng)物在施用后24或48小時(shí)處 死，分別分析腦部的ESBA212和CU-ESBA212對淀粉樣斑塊的結(jié)合。如在附圖19中所見，在施用24和48小時(shí)后，ESBA212可被檢測。對Cu標(biāo)記的 ESBA212觀察到了相同的結(jié)果。因此，CU-ESBA212的結(jié)合性質(zhì)與ESBA212相比在體內(nèi)沒有 改變，如已經(jīng)離體標(biāo)記所展現(xiàn)的。實(shí)施例15 經(jīng)由腎臟的清除為了得到關(guān)于ESBA212的清除途徑的某些信息，scFv靜脈內(nèi)地注射到小鼠中。之 后不久處死動(dòng)物，通過免疫組織化學(xué)方法分析腎臟。ESBA212滲入腎臟中的原尿中，在近端小管重吸收，在此它最可能經(jīng)由溶酶體途徑 降解(附圖20)。實(shí)施例16 體內(nèi)斑塊標(biāo)記使用鼻內(nèi)的施用，進(jìn)行類似于實(shí)施例11中進(jìn)行的測試的進(jìn)一步測試。轉(zhuǎn)基因SwePSl小鼠用200 μ g的ESBA212鼻內(nèi)地處理。動(dòng)物在鼻內(nèi)的處理之后Ih 灌注。固定的SwePSl小鼠腦切片上的A β染色如下進(jìn)行并記錄用抗Hi s抗體染色(附圖21Α)用6Ε10對照染色(附圖21Β)用抗兔Cy3 (附圖21C)陰性對照染色用22c4 IgG對照染色(附圖21D)實(shí)施例17 APPswe/PSl ΔΕ9小鼠用PBS、22c4IgG每周一次、和用ESBA212每周兩次治療3個(gè) 月。在治療的結(jié)束時(shí)，灌注動(dòng)物，分離腦，并分成兩個(gè)部分。一個(gè)部分被勻質(zhì)化，產(chǎn)生幾種提取物，使用商售的ELISA測試(The Genetics Company)測定腦A β 40禾口 42水平。發(fā)現(xiàn)的是，Aβ 40和42水平在可溶級分(TBS)中提高，在不溶的級分(GuHCl)中降低。在膜結(jié)合 級分(TBS-Triton)中，Aβ 40水平保持不變，而Aβ 42水平提高(參見附圖22)。這指出了 Aβ從不溶級分到可溶級分的重新分配。另一個(gè)部分用于組織學(xué)。治療的APPswe/PSl ΔΕ9小鼠的石蠟切片用6E10染色。 使用ImageJ軟件評估斑塊數(shù)量和面積。實(shí)驗(yàn)揭示了，用ESBA212治療的動(dòng)物顯示了顯著降低的數(shù)量，以及降低的淀粉樣 斑塊大小(參見附圖23)。這進(jìn)一步支持了以下思想，ESBA212結(jié)合Aβ纖維，隨后將它們 破壞為單體或小的寡聚體，這將平衡朝向可溶的Αβ庫移動(dòng)。上面顯示的結(jié)果支持了以下發(fā)現(xiàn)，ESBA212在靜脈內(nèi)的和鼻內(nèi)的施用后進(jìn)入腦 部，結(jié)合轉(zhuǎn)基因小鼠的皮層和海馬中的Abeta斑塊。此外，用scFv鼻內(nèi)地治療的APPswe/ PSl ΔΕ9小鼠展現(xiàn)了皮層中淀粉樣斑塊的降低的數(shù)量和平均大小，以及在腦提取物中不溶 級分中A β 42的降低的水平。雖然顯示和描述了本發(fā)明的當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方式，明顯地要理解的是，本發(fā)明不 限于此，但是在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)可以被另外不同地包含或?qū)嵤?。參考文獻(xiàn)Alfthan et al. 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權(quán)利要求
一種分離的抗體，其選擇性地結(jié)合Abeta的C-末端部分，并且是人源化的或完全人類的。
2.權(quán)利要求1的抗體，其阻止Abeta的寡聚化。
3.一種抗體，特別是根據(jù)權(quán)利要求1或2的，其特征在于所述抗體包含與由SEQ ID NO USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5 禾口 SEQ ID NO :6 構(gòu)成的組的序 列具有至少80%同一性的一種或更多種序列。
4.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體包含與可從人類文庫獲得的框架具有 至少60%同一性的框架。
5.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的抗體，其中所述框架包含與可從人類文庫獲得的框架具有 至少60%同一性的可變輕鏈片段和/或可變重鏈片段。
6.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體是單鏈抗體(scFv)。
7.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的抗體，其包含與由SEQID NO 7. , SEQ ID NO :8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ IDNO : 14、SEQ ID NO: 15 禾口 SEQ ID NO :16構(gòu)成的組的序列具有至少60%同一性的可變輕鏈片段(VL)序列。
8.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的抗體，其包含與由SEQID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID NO 20,SEQ ID NO :21、SEQ ID N0:22和SEQ ID NO :23構(gòu)成的組的序列具有至少60%相似 性的可變重鏈片段(VH)序列。
9.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的抗體，其包含SEQID NO :7和SEQ ID N0:17。
10.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的抗體，其具有SEQID N0:24。
11.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的抗體，其被化學(xué)修飾。
12.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的抗體，其與治療試劑相連接。
13.與標(biāo)記物(特別是64Cu)連接的權(quán)利要求1到12的任一項(xiàng)的抗體。
14.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的抗體，其展現(xiàn)了特征(i)以高的和基本上相同的親和力結(jié)合Abeta4ci和Abeta42 ；( )展示了對Abeta的寡聚和單體形式的高度親和力；(iii)在體內(nèi)基本上不識別淀粉樣前體蛋白質(zhì)(APP)；(iv)具有至少5mg/ml、優(yōu)選至少10mg/ml、更優(yōu)選至少20mg/ml的溶解度；和(ν)顯示了在人類施用時(shí)低的免疫原性或沒有免疫原性。
15.權(quán)利要求14的抗體，其進(jìn)一步展現(xiàn)了至少一種、優(yōu)選超過一種、最優(yōu)選所有的以下 特征(vi)介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞對纖維狀A(yù)beta的攝??；(vi)結(jié)合β_淀粉樣斑塊；(vii)除去腦中的β-淀粉樣斑塊和/或防止腦中淀粉樣斑塊的形成；(viii)降低Abeta毒性和神經(jīng)元對發(fā)作產(chǎn)生的興奮毒素性事件的相關(guān)易感性；(ix)跨越血腦屏障；和/或(x)基本上恢復(fù)正常的行為；(xi)除去腦中的淀粉樣纖維和/或防止腦中淀粉樣纖維的形成。
16.一種診斷方法，其包括施用權(quán)利要求13的抗體的步驟。
17.權(quán)利要求13的抗體的用途，其用于針對淀粉樣變性或阿爾茨海默氏病診斷或篩選受試者，或測定受試者發(fā)生淀粉樣變性或阿爾茨海默氏病的風(fēng)險(xiǎn)。
18.權(quán)利要求16的方法，其是PET成像。
19.一種診斷或科學(xué)工具，其包含權(quán)利要求1到13的任一項(xiàng)的抗體。
20.一種測試試劑盒，其包含權(quán)利要求1到13的任一項(xiàng)的抗體。
21.一種藥物組合物，其用于治療、預(yù)防和/或延緩神經(jīng)失調(diào)、特別是阿爾茨海默氏病 的發(fā)展和/或針對阿爾茨海默氏病的被動(dòng)免疫，包括權(quán)利要求1到12的任一項(xiàng)的抗體。
22.一種制造治療、預(yù)防和/或延遲神經(jīng)失調(diào)(優(yōu)選阿爾茨海默氏病)的發(fā)展的藥物組 合物的方法，其包括將權(quán)利要求1到12的任一項(xiàng)的抗體與至少一種適合的藥物載體組合的 步驟。
23.—種用于哺乳動(dòng)物的被動(dòng)免疫的方法，其包括向哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求1到12的 抗體的步驟。
24.一種核酸序列，其編碼權(quán)利要求1到10的任一項(xiàng)的抗體。
25.—種載體，其包含權(quán)利要求24的序列。
26.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求24的序列或權(quán)利要求25的載體。
27.—種生產(chǎn)權(quán)利要求1到13的任一項(xiàng)的抗體的方法，其包括步驟 (i)在容許所述抗體的合成的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求24的宿主細(xì)胞； ( )從培養(yǎng)物回收所述抗體。
28.—種診斷的方法，其包括步驟 ⑴標(biāo)記抗體；( )向受試者鼻內(nèi)地或全身地施用有效劑量的所述抗體；和(iii)檢測所述受試者的身體部分中所述標(biāo)記的抗體的濃度和/或存在。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗體是用64Cu標(biāo)記的。
30.權(quán)利要求28或29的方法，其中所述抗體是權(quán)利要求1到13的任一個(gè)。
31.權(quán)利要求28到30的方法，其中所述抗體是單鏈抗體。
32.權(quán)利要求28到31的任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者經(jīng)歷PET成像。
33.治療神經(jīng)失調(diào)的方法，其包括向需要的受試者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1 到13的抗體的步驟。
34.治療的方法，其包括向有需要的受試者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求22的多核 苷酸、根據(jù)權(quán)利要求23的載體或根據(jù)權(quán)利要求24的宿主細(xì)胞的步驟。
35.一種PET成像的方法，其包括向受試者施用根據(jù)權(quán)利要求13的64Cu標(biāo)記的抗體的 步驟。
36.一種藥物組合物，其用于治療、預(yù)防和/或延緩神經(jīng)失調(diào)(特別是阿爾茨海默氏 病)的發(fā)展和/或針對阿爾茨海默氏病的被動(dòng)免疫，包括權(quán)利要求1到12的任一項(xiàng)的抗體， 所述組合物適合于鼻內(nèi)的、皮下的或靜脈內(nèi)的施用。
全文摘要
本發(fā)明公開了分離的抗體，其選擇性地結(jié)合Abeta的C-末端部分，并且是人源化的或完全人類的。本發(fā)明的抗體能夠防止Abeta的寡聚化。此外，公開了診斷的方法，其包括步驟(i)標(biāo)記抗體；(ii)向受試者鼻內(nèi)地或全身地施用有效劑量的所述抗體；和(iii)檢測所述受試者的身體部分中所述標(biāo)記的抗體的濃度和/或存在。
文檔編號C07K16/18GK101842388SQ200880106728
公開日2010年9月22日 申請日期2008年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月13日
發(fā)明者A·奧弗德毛爾, R·尼奇, S·凱特波伊爾, S·埃韋爾特 申請人:德勒尼克斯治療股份公司;蘇黎世大學(xué)