專利名稱：：成熟樹突細(xì)胞中耐受性表型的誘導(dǎo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)樹突細(xì)胞功能的方法。特別地，本發(fā)明涉及產(chǎn)生耐受性樹突細(xì)胞(tolerogenicdendriticcell)的方法和來源于此類方法的用途。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了在例如治療和/或預(yù)防人類病理性免疫反應(yīng)(例如那些與自身免疫病、移植排斥、銀屑病、炎性腸病、變態(tài)反應(yīng)等相關(guān)的免疫反應(yīng))方面的效用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及從本文所述方法獲得的藥物和藥物組合物。
背景技術(shù)：
：能夠抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)的新藥物的發(fā)現(xiàn)對于治療幾種免疫介導(dǎo)的疾病是有用的，該疾病包括急性器官排斥、移植物抗宿主病、自身免疫病和慢性炎癥。骨髓和器官移植目前分別用于治療造血和非造血起源的大量惡性和非惡性疾病以及大多數(shù)必要器官(肝、心臟和肺)的末期衰竭。然而，由供體的免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的針對受體的排斥反應(yīng)(稱為移植物抗宿主病(GvHD))仍然是骨髓移植中發(fā)病的主要原因。類似地，由受體介導(dǎo)的同種異體移植排斥(allograftrejection)是器官移植后長期移植物存活的主要障礙。免疫抑制性藥物可成功地治療GvHD和器官移植排斥。然而，這些方法需要長期治療以及非特異性地抑制整個免疫系統(tǒng)，這4吏得病人暴露于增加的感染和癌癥的危險之下。而且，這些非特異性治療對于長期移植物存活僅具有有限的有益影響(1)。類似地，目前治療針對自身抗原的免疫反應(yīng)是基于對炎癥和非特異性免疫抑制的調(diào)節(jié)，所述免疫反應(yīng)導(dǎo)致自身免疫病中周圍組織破壞。由于免疫抑制的副作用包括感染和癌癥、以及撤銷藥物后疾病復(fù)發(fā)的高危險性，這些方法常常不是長期有效的。在慢性炎性疾病中和變態(tài)反應(yīng)中，發(fā)生了對病原性和非病原性抗原的改變的免疫反應(yīng)。這可能是由于效應(yīng)物與調(diào)節(jié)性免疫反應(yīng)之間的不平衡。常規(guī)的抗炎癥或免疫抑制療法常常不足以恢復(fù)這種平衡。而且，這些療法的益處在撤銷藥物后不是長期持續(xù)的。非特異性免疫抑制的替代策略是基于特異性免疫耐受的誘導(dǎo)，以下調(diào)病原性免疫反應(yīng)同時保持宿主防舉rt幾制完整為最終目標(biāo)的。胸腺中的中樞性耐受發(fā)生在T細(xì)胞個體發(fā)育過程中，并受到自身反應(yīng)T細(xì)胞克隆缺失的調(diào)節(jié)，而外周T細(xì)胞耐受是在整個生命過程中運(yùn)轉(zhuǎn)的，其設(shè)計(jì)為控制針對自身抗原和無害外來抗原例如食物抗原的反應(yīng)。通常涉及外周耐受的正常過程有克隆缺失、克隆失活(麻痹)、細(xì)胞因子依賴性免疫偏離、和抑制。同種異體移植排斥、自身免疫和炎癥中免疫反應(yīng)的主要介質(zhì)是T-和B細(xì)胞。二者均需要通過T和B細(xì)胞受體以及通過共刺激通路的信號發(fā)放(例如，CD28或CD80-86和CD40/CD40L)。干擾T細(xì)胞活化中的這兩類信號可在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)CD4十T細(xì)胞的麻痹，如在幾個臨床前移植模型中所證實(shí)的(2-6)。包括非促有絲分裂的抗CD3mAb、抗CD4mAb和Campath-1H(抗-CD52)在內(nèi)的有希望的藥物正在移植的病人中進(jìn)行測試。一個實(shí)例是非促有絲分裂的抗CD3mAb，其已用于腎臟移植試驗(yàn)中，無副作用(7,8)。而且，利用抗CD3mAb的單一療程改變了I型糖尿病(9，10)和4艮屑病關(guān)節(jié)炎(11)中自身免疫過程的急艮。最近，已證實(shí)除了其耗盡效果(depletingeffect),(12)，Campath-1H誘導(dǎo)T調(diào)節(jié)細(xì)胞(Tr細(xì)胞)的增殖(expansion)，所述T調(diào)節(jié)細(xì)胞最終抑制hu-PBL-SCID小鼠中的致命GvHD(13)。T細(xì)胞共刺激靶標(biāo)CD28和CD154的封閉已顯示出誘導(dǎo)了鼠臨床前模型中的抗原特異性耐受狀態(tài)(4)?？笴D154mAb阻止了非人靈長類中急性腎臟同種異體移植排斥并促進(jìn)了長期的同種異體移植接受(15，16)。盡管存在陽性臨床前結(jié)果，但由于血栓栓子并發(fā)癥，測試抗CD154mAb作為自身免疫病和移植中的免疫調(diào)節(jié)劑的臨床試驗(yàn)被終止(17)。已開發(fā)了備選的抗CD154mAb，并證實(shí)短療程的西羅莫司和與抗CD154mAb相8(transfusion)延長了靈長類中同種異體移植存活并誘導(dǎo)了耐受性(18，19)。除上述之外，免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子例如IL-10和TGF-p的使用也可誘導(dǎo)T細(xì)胞麻痹狀態(tài)。IL-10在控制炎性過程中發(fā)揮著重要作用，其抑制T細(xì)胞反應(yīng)并維持免疫耐受(綜述于(20)中)。IL-10通過T細(xì)胞抑制IFN-y和IL-2產(chǎn)生(21)，其具有抑制促炎細(xì)胞因子例如TNF-(x、IL-1、IL-6和趨4匕因子例如IL-8和MIPla產(chǎn)生的抗炎效果，其由活化的抗原呈遞細(xì)胞(APC)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生。而且，IL-10下調(diào)APC上II類MHC、共刺激和黏著分子的表達(dá)(22-24)，并調(diào)節(jié)它們的刺激能力(25)。重要地是，IL-10對于適應(yīng)性1型T調(diào)節(jié)(Trl)細(xì)胞分化是關(guān)鍵性的(26)。Trl細(xì)胞特征在于獨(dú)特的細(xì)胞因子分泌傳。只要TCR活化，它們就分泌高水平的IL-IO、大量的IL-5和TGF-P、低水平的IFN-y和IL-2，但是無IL-4(26)?？稍隗w外通過高劑量IL-10存在下的重復(fù)TCR刺激來產(chǎn)生Ag特異性鼠Trl細(xì)胞(26)。而且，向混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)培養(yǎng)物中添加IL-IO(以及小鼠中TGF-p(27))導(dǎo)致T細(xì)胞麻痹。重要地是，來自健康個體的同種異體反應(yīng)性Trl細(xì)胞克隆已最初通過有限稀釋而從IL-10麻痹的CD4+T細(xì)胞中得以分離(26)。第一次暗示了人Trl細(xì)胞體內(nèi)涉及維持外周耐受，該暗示來自成功移植了HLA錯配的同種異體干細(xì)胞的重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)病人中的研究。在無免疫抑制性治療下，這些病人未發(fā)生GvHD。有趣的是，在這些病人的血漿中檢測到高水平的IL-10和顯著比例的特異于宿主HLA抗原并產(chǎn)生高水平IL-10的供體來源的T細(xì)胞，這些T細(xì)胞可在體外進(jìn)行分離(29)。在骨髓抑制的臨床前模型中，在IL-10和TGF-P存在下通過宿主APC離體轉(zhuǎn)移麻痹的供體CD4+T細(xì)胞導(dǎo)致錯配受體II類MHC中GvHD顯著減少(27，30)。樹突細(xì)胞(DC)是高度特異的APC，一旦感染其通常啟動Ag特異性免疫反應(yīng)(31)。該過程包括通常由微生物感染相關(guān)物質(zhì)所誘導(dǎo)的DC的最終成熟。目前清楚的是，DC不僅是免疫原性的，而且是耐受性的。在9穩(wěn)定狀態(tài)下，DC表達(dá)未成熟表型并可經(jīng)Ag特異性效應(yīng)T細(xì)胞的缺失和/或Tr細(xì)胞的分化來誘導(dǎo)耐受性(32-36)。用同種異體的未成熟DC反復(fù)刺激幼稚臍帶血CD4+T細(xì)胞導(dǎo)致產(chǎn)生IL-10的Tr細(xì)胞的分化(37)，其抑制經(jīng)細(xì)胞接觸依賴機(jī)制的T細(xì)胞反應(yīng)。我們最近報(bào)道了利用同種異體未成熟DC刺激的外周血幼稚CD4+T細(xì)胞變得對用成熟DC的再活化是低反應(yīng)性(hypo-responsive)，在用未成熟DC刺激三輪后它們完全麻痹并獲得調(diào)節(jié)功能。這些T細(xì)胞在表型上和功能上類似于Trl細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兎置诟咚降腎L-10和TGF-(5，經(jīng)IL-10和TGF-卩依賴性機(jī)制抑制T細(xì)胞反應(yīng)、且它們的誘導(dǎo)可通過抗IL10RmAb而阻斷(38)。不4又是未成熟的DC而且耐受性DC的特異亞類均可驅(qū)動Tr細(xì)胞的分化。DC的成熟和功能可在不同水平上受到調(diào)節(jié)(39)。藥理學(xué)和生物學(xué)物質(zhì)均已顯示出能夠誘導(dǎo)耐受性DC(40)。單獨(dú)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子例如IL-IO、或與TGF-p組合(43)，以及促炎細(xì)胞因子例如IFN-a(44，45)和TNF-P(43)可驅(qū)動耐受性DC的分化并誘導(dǎo)具有抑制活性的麻痹T細(xì)胞。CD45在T細(xì)胞活化中發(fā)揮重要作用。通過備選的剪接產(chǎn)生了胞外結(jié)構(gòu)域大小不同的七種不同的CD45同種型，它們共享相同的細(xì)胞質(zhì)PTP酶結(jié)構(gòu)域。盡管單個淋巴細(xì)胞可同時表達(dá)多種CD45同種型，較高和較低分子量(MW)同種型在具有不同功能和細(xì)胞因子產(chǎn)生譜的CD4+T細(xì)胞亞類中是差異分布的(47,48)。CD45同種型的表達(dá)是高度受調(diào)節(jié)的和動態(tài)的。T細(xì)胞活化與較高M(jìn)W同種型的減少和伴隨的較低MW同種型的上調(diào)是相關(guān)的。不同T細(xì)胞亞類中的CD45同種型的調(diào)節(jié)表達(dá)顯示出其生物學(xué)重要性。CD45的PTP酶活性調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞中的多條通路，包括通過TCR、整聯(lián)蛋白和細(xì)胞因子受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(49，50)。CD45對TCR信號發(fā)放的功能主要是刺激，而CD45在細(xì)胞因子信號發(fā)放中可具有抑制性效果(49)。靶向小鼠中CD45的RB同種型的抗體可在鼠腎臟、胰島和心臟同種異體移植物中誘導(dǎo)長期移植物移入和供體特異的耐受性(51)(52)?？笴D45RBmAb引起CD45同種型表ii^高M(jìn)W向低MW快速轉(zhuǎn)變，這與CD4+T細(xì)胞耗盡無關(guān)，但與CD4+T細(xì)胞上增加的CTLA-4表達(dá)相關(guān)(53)。已證實(shí)CTLA-4的上調(diào)是抗CD45RB介導(dǎo)的耐受性所必需的(54)?？笴D45RBmAb不僅在CD4+CD25效應(yīng)T細(xì)胞中而且在CD4+CD25Tr細(xì)胞中誘導(dǎo)麻痹，其為維持耐受性所必需的(55)。新的胸腺移植物(emigrant)在抗CD45RBmAb的耐受性誘導(dǎo)中的作用最近有所研究，結(jié)果是有爭議的。在胰島移植中，盡管在切除胸腺的小鼠中用抗CD45RB治療顯著降低了早期排斥，但并不改善長期耐受性效果(55)。相反，在心臟移植中，胸腺切除術(shù)完全阻止了抗CD45RB介導(dǎo)的耐受性。有趣的是，抗CD45RBmAb通過來自胸腺的抗原特異性CD4+T細(xì)胞的從頭生成來誘導(dǎo)耐受性(56)。在WO02072832(其全部內(nèi)容并入本文作為參考并向讀者專門提及)中，CD45RO/RB結(jié)合分子顯示出以體外MLR所測定的劑量依賴性形式抑制初級同種異體異體(alio)免疫反應(yīng)。進(jìn)一步證實(shí)了，CD45RO/RB結(jié)合分子直接作用于效應(yīng)T細(xì)胞并調(diào)節(jié)它們的功能。鑒于上述，本領(lǐng)域需要建立可促進(jìn)潛在病理性免疫反應(yīng)的抑制的其他方法和藥物。本發(fā)明試圖通過以利用免疫系統(tǒng)的天然調(diào)節(jié)機(jī)制這樣一種方式調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能來解決該問題。發(fā)明概述本發(fā)明的一方面提供了調(diào)節(jié)樹突細(xì)胞(DC)功能的方法，該方法包括將樹突細(xì)胞暴露于CD45RO/RB結(jié)合分子。本發(fā)明的第二方面提供了調(diào)節(jié)樹突細(xì)胞(DC)功能的方法，該方法包括將樹突細(xì)胞暴露于結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子依次包含高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有^J^醋列Asn-Tyr-Ile-Ile畫His(NYIIH)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys誦Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)，且所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp誦Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)，或者其中所述分子是其直接等價物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合分子包含a)第一結(jié)構(gòu)域，其依次包含高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro畫Tyr-Asn-His-Gly-Thr畫Lys國Tyr畫Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)，且所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly畫Pro-Tyr-Ala誦Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT);且b)第二結(jié)構(gòu)域，其依次包含高變區(qū)CDR1，、CDR2，和CDR3，，CDR1，具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser訓(xùn)Gln-Asn畫Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln(RASQNIGTSIQ),CDR2，具有氨基酸序列Ser畫Ser畫Ser-Glu-Ser-Ile-Ser(SSSESIS)，且CDR3，具有氨基酸序列Gln畫Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr(QQSNTWPFT)，或其直接等價物。優(yōu)選地，結(jié)合分子是嵌合的、人源化的或全人單克隆抗體。因此，在一個實(shí)施方案中，結(jié)合分子是人源化單克隆抗體。在另一實(shí)施方案中，結(jié)合分子是全人單克隆抗體。用于本發(fā)明的合適的結(jié)合分子的例子包括但不限于(a)包含SEQIDNO:l的多肽和/或SEQIDNO:2的多肽的結(jié)合分子；(b)包含SEQIDNO:3的多肽和/或SEQIDNO:4的多肽的結(jié)合分子；(c)為人源化抗體的結(jié)合分子，其包含SEQIDNO:9或SEQIDNO:IO的多肽和/或SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的多肽；且(d)為人源化抗體的結(jié)合分子，其包含SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的多肽和/或SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的多肽。在一個實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)DC功能的方法實(shí)在體外進(jìn)行的。在此類情況下，DC可從生物樣品(例如，離體)獲得或在體外產(chǎn)生，例如通過獲得單核細(xì)胞群體并誘導(dǎo)單核細(xì)胞在體外分化成DC。在后一情形下，單核細(xì)胞的來源可以是生物樣品。在一個實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)DC功能的方法包括獲得未成熟DC的來源并在本文所述結(jié)合分子的存在下誘導(dǎo)未成熟DC的成熟。調(diào)節(jié)DC功能的方法在DC中誘導(dǎo)耐受性表型方面得到應(yīng)用。在一個實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)DC功能的方法還包括在體外將DC暴露于T細(xì)胞群體(例如，同種異體T細(xì)胞)中從而在所述T細(xì)胞中誘導(dǎo)耐受性表型的步驟。此類耐受性T細(xì)胞在本文中也稱為Tr細(xì)胞。調(diào)節(jié)DC功能的方法還在制備例如用于治療和/或預(yù)防與自身免疫病、移植排斥、4艮屑病、炎性腸病和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)疾病的藥物/藥物組合物方面得到應(yīng)用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法、用途和藥物/藥物組合物植)方面得到應(yīng)用。因此，本發(fā)明的另一方面提供了治療和/或預(yù)防與自身免疫病、移植排斥、銀屑病、炎性腸病和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病的方法，其包括對需要此類治療和/或預(yù)防的人受試者施用有效量的DC，所述DC已通逸暴露于本文所述的結(jié)合分子而得以調(diào)節(jié)。本發(fā)明的另一方面提供了治療和/或預(yù)防與自身免疫病、移植排斥、銀屑病、炎性腸病和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病的方法，其包括(a)從人供體獲得單核細(xì)胞群體；(b)體外誘導(dǎo)所述單核細(xì)胞的分化從而產(chǎn)生DC的來源；(c)將DC暴露于本文所迷的結(jié)合分子以便DC變?yōu)槟褪苄缘?，?d)對需要該治療和/或預(yù)防的人受體施用有效量的耐受性DC。在本發(fā)明的另一方面，提供了治療和/或預(yù)防與自身免疫病、移植排斥、銀屑病、炎性腸病和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病的方法，其包括(a)從人供體獲得DC群體；(b)將DC暴露于本文所述的結(jié)合分子以便DC變?yōu)槟褪苄缘模?c)對需要該治療和/或預(yù)防的人受體施用有效量的耐受性DC。在一個實(shí)施方案中，上述方面的供體和受體是同一個體。在一項(xiàng)備選的實(shí)施方案中，供體和受體是不同的個體，從而DC對于受體而言是同種異體的。本發(fā)明的另一方面提供了治療和/或預(yù)防與自身免疫病、移植排斥、銀屑病、炎性腸病和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病的方法，其包括(a)從第一人供體獲得單核細(xì)胞群體；(b)體外誘導(dǎo)所述單核細(xì)胞的分化從而產(chǎn)生DC的來源；(c)如下文所述將DC暴露于權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子以便DC變?yōu)槟褪苄缘模?d)將耐受性DC暴露于從第二人供體獲得的T細(xì)胞，以便T細(xì)胞變?yōu)槟褪苄缘?；?e)對需要該治療和/或預(yù)防的人受體施用有效量的耐受性DC和/或耐受性T細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了治療和/或預(yù)防與自身免疫病、移植排斥、銀屑病、炎性腸病和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病的方法，其包括(a)從第一人供體獲得樹突細(xì)胞群體；(b)如下文所述將樹突細(xì)胞暴露于權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子以便樹突細(xì)胞變?yōu)槟褪苄缘模?c)將耐受性樹突細(xì)胞暴露于從第二人供體獲得的T細(xì)胞，以便T細(xì)胞變?yōu)槟褪苄缘模磺?d)對需要該治療和/或預(yù)防的人受體施用有效量的耐受性樹突細(xì)胞和/或耐受性T細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，第一供體和/或第二供體與受體是同一個體。第一供體可以是與第二供體相同的個體，或者備選地，第一和第二供體可不同以便來自第一供體的DC和來自第二供體的T細(xì)胞對于彼此而言是同種異體的。在一個實(shí)施方案中，第一供體和受體是相同個體且第二供體是不同個體。該實(shí)施方案在GvHD的治療方面具有特定用途，其中第二供體為受體/第一供體提供了用于移植的移植物組織。優(yōu)選地，在上述方法中DC在其暴露于CD45RO/RB結(jié)合分子之前是未成熟DC，且隨后在結(jié)合分子存在下DC纟皮誘導(dǎo)成熟。在本發(fā)明另一方面，提供了調(diào)節(jié)的DC群體和/或耐受性T細(xì)胞(即Tr細(xì)胞)群體用于治療和/或預(yù)防與自身免疫病、移植排斥、銀屑病、炎性腸病和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病的的用途，所述調(diào)節(jié)的DC是由于暴露至本文所述的CD45RO/RB結(jié)合分子而獲得，所述耐受性T細(xì)胞是由于將T細(xì)胞暴露于所述耐受性DC而獲得。在另一方面，本發(fā)明提供了DC群體和/或耐受性T細(xì)胞(即Tr細(xì)胞)群體用于制備治療和/或預(yù)防自身免疫病、移植排斥、4艮屑病、炎性腸病和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)疾病的藥物的用途，所述調(diào)節(jié)的DC是由于暴露至本文所述的CD45RO/RB結(jié)合分子而獲得，所述耐受性T細(xì)胞是由于將T細(xì)胞暴露于所述耐受性DC而獲得。因暴露于本文所述的CD45RO/RB結(jié)合分子而獲得的耐受性DC和/或因暴露T細(xì)胞于所述耐受性DC而獲得的耐受性T細(xì)胞(即Tr細(xì)胞)在藥物和藥物組合物方面得以應(yīng)用。在一個實(shí)施方案中，此類藥物/藥物組合物可另外包含本文所述的CD45RO/RB結(jié)合分子。附圖描述圖1.ChA6mAb不影響DC成熟。在IL-4和GM-CSF中分化5天后，使得單核細(xì)月包來源的DCM呆持未成熟或者通過在chA6mAb(10|ag/ml)存在或缺乏下CD40L活化48小時^f吏其成熟。然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析DC來測定CDla、CD14、CD83、HLA-DR、CD40、CD80和CD86的表達(dá)水平。數(shù)字表明陽性細(xì)胞的比例。顯示了代表20次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖2.ChA6mAb處理調(diào)節(jié)成熟DC上PDL-2和CK45RB的表達(dá)。在IL-4和GM-CSF中分化5天后，使單核細(xì)胞來源的DC保持未成熟或者通過在chA6mAb(10嗎/ml)存在或缺乏下CD40L活化48小時使其成熟。然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析DC來測定指示標(biāo)記物的水平。顯示了在指示的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中所檢測到的平均土SEM量。通過T檢驗(yàn)計(jì)算了P值成熟/chA6DC和成熟DC之間的wp比較，以及成熟/chA6DC和未成熟DC之間的SPt匕較(*P或$卩<0.05,**P或SSP)。圖3.ChA6mAb不影響成熟DC的細(xì)胞因子分泌。在IL-4和GM-CSF中分化5天后，通過在chA6mAb(10pg/ml)存在或缺乏下CD40活化48小時使得單核細(xì)胞來源的DC成熟。培養(yǎng)成熟的(mDC)和chA6-調(diào)整的成熟DC(chA6mDC)，并在48小時后收集上清。通過ELISA檢測分泌的IL-6、IL-IO、TNF-a和lL-12的水平。顯示了十次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中所檢測到的平均士SEM量。未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖4.ChA6調(diào)節(jié)的成熟DC誘導(dǎo)低反應(yīng)性T細(xì)胞。利用未成熟(Timm)、成熟(Tmat)或成熟/chA6(TchA6mat)同種異體DC刺激3輪來反復(fù)活化外周CD4+CD45RO-T細(xì)胞。在第3輪刺激后，測試T細(xì)胞系響應(yīng)于同種異體mDC的增殖能力(A)。另外，在第3輪活化后，在缺乏或存在可溶性抗CD28mAb(10jig/ml)和IL-2(100U/ml)(B)情況下，通過用固定化的抗CD3mAb(1Mg/ml)刺激來測試它們對多克隆活化的增殖反應(yīng)。培養(yǎng)48小時后，加入[3H]-胸苷，再培養(yǎng)16小時。結(jié)果代表了17次(A)和3次(B)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。圖5.ChA6調(diào)節(jié)的成熟DC誘導(dǎo)Tr細(xì)胞。利用未成熟(Timm)、成熟(Tmat)或成熟/chA6(TchA6mat)同種異體DC刺激3輪來反復(fù)刺激外周CD4+CD45RO-T細(xì)胞。在第3輪刺激后，培養(yǎng)2、3和4天之后測試T細(xì)胞系響應(yīng)于同種異體mDC的增殖能力(空心符號)，并測試其抑制經(jīng)mDC活化的自體CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的能力(實(shí)心符號)。單獨(dú)用成熟DC(MLR)或以1:1比例在Timm、Tmat和TchA6maT細(xì)胞系的存在下刺激幼稚CD4+T細(xì)胞。在指定時間加入[3H-胸苷再培養(yǎng)16h。顯示了代表17次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖6.IL-10和TGF-p在由Trl細(xì)胞介導(dǎo)的抑制中的作用，所述Trl細(xì)胞由chA6調(diào)節(jié)的DC誘導(dǎo)。在用成熟/chA6DC活化3輪后，在缺乏或存在抗-IL-10R(30ng/ml)和抗TGF-P(50ng/ml)mAb情況下，測試T(chA6mat)細(xì)胞在響應(yīng)于同種異體單核細(xì)胞中抑制CD4+T細(xì)胞增殖的能力。在指定時間加入[3H-胸苷再培養(yǎng)16h。結(jié)果代表了3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。圖7.通過PDL-2的信號是由chA6調(diào)節(jié)的DC所誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞分化所必需的。在缺乏或存在抗-PDL-2或?qū)φ誌gGmAb(10ng/ml)情況下用16chA6調(diào)節(jié)的同種異體DC來刺激外周血CD4+CD45RO-T細(xì)胞。刺激3輪后，收集T細(xì)胞，并測試其響應(yīng)于成熟DC中的增殖能力以及抑制自體CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的能力。在指定時間加入[3H-胸苷再培養(yǎng)16小時。結(jié)果代表了3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。發(fā)明詳述本發(fā)明是基于下述理解，即結(jié)合CD45的RO和RB同種型的分子能夠誘導(dǎo)樹突細(xì)胞中的耐受性表型。我們發(fā)現(xiàn)，包含結(jié)合至CD45RO和CD45RB的多肽序列的結(jié)合分子(在下文中也稱為"CD45RO/RB結(jié)合分子")可誘導(dǎo)耐受性樹突細(xì)胞，其能夠抑制初級T細(xì)胞應(yīng)答并誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受。本文證實(shí)，抗CD45RO/RB單克隆抗體不能阻止單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞的成熟和活化，但能夠上調(diào)成熟DC上PD-L2和CD45RB的表達(dá)。通過將幼稚外周血CD4+T細(xì)胞反復(fù)暴露于同種異體DC,我們證明了抗CD45RO/RB單克隆抗體調(diào)節(jié)DC功能從而DC誘導(dǎo)外周血CD4+T細(xì)胞分化成表型和功能上類似于Trl細(xì)胞的Tr細(xì)胞群體。如同Trl細(xì)胞，這些Tr細(xì)胞產(chǎn)生IL-10和TGF-p并經(jīng)IL-10和TGF-j5依賴性機(jī)制而抑制T細(xì)胞應(yīng)答。另夕卜，我們已證實(shí)通過PDL-2的信號發(fā)放是抗CD45RO/RB調(diào)節(jié)的DC誘導(dǎo)的Tr分化的基礎(chǔ)。已證實(shí)CD45RO/RB結(jié)合分子通過至少幾種作用模式而起到免疫調(diào)節(jié)劑的作用，所述模式包括效應(yīng)T細(xì)胞的缺失和通過樹突細(xì)胞的調(diào)節(jié)的Tr細(xì)胞誘導(dǎo)。"CD45RO/RB結(jié)合分子"指的是能夠單獨(dú)或與其他分子結(jié)合來特異性結(jié)合CD45的CD45RB和CD45RO同種型的任何分子。該結(jié)合反應(yīng)可通過標(biāo)準(zhǔn)方法(定性測定)來顯示，包括例如任何種類的結(jié)合測定，例如結(jié)合熒光顯微鏡法或細(xì)胞熒光測定法(FACS)分析的直接或間接免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或放射免疫測定，其中可觀察到分子對表達(dá)特定CD45同種型的細(xì)胞的結(jié)合。另外，該分子的結(jié)合可導(dǎo)致表達(dá)這些同種型的細(xì)胞功能的改變，例如可測定出初級或次級混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)的抑制，例如用于在CD45RO/RB結(jié)合分子存在和缺乏下測定初級或次級MLR抑制以及測定初級MLR抑制間差別的體外測定或生物測定。該測定的例子如下在如本文所述的CD45RO/RB結(jié)合分子存在下，或?qū)φ辗肿永缧∈竺庖咔虻鞍?1存在下，將人外周血單核細(xì)胞(PBMC)或人CD3+或CD4+細(xì)胞與經(jīng)輻射的同種異體PBMC或者T細(xì)胞耗盡的經(jīng)輻射(5000rad)的PBMC在96孔培養(yǎng)板的每個孔中混合。在37。C下5%的C02中將細(xì)胞混合物培養(yǎng)4或5天，并在培養(yǎng)的最后16-20小時通過用3H-胸苷脈沖細(xì)胞來測定增殖。與對照分子存在下的細(xì)胞增殖相比而計(jì)算出初級MLR的抑制的百分比。次級MLR抑制也可被評估出來。備選地，通過測定PBMC或T細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生、例如在MLR中細(xì)胞活化之后或者用特定抗原例如石皮傷風(fēng)毒素或其他抗原或多克隆刺激物例如植物凝集素(PHA)或抗-CD3和抗-CD28抗體或佛波酯和03++離子載體刺激之后細(xì)胞表面分子表達(dá)的改變，也可測定出體外功能調(diào)節(jié)效果。以用于MLR所述的類似方式來設(shè)置培養(yǎng)物，除了用刺激物替代同種異體細(xì)胞，可使用例如上述的那些可溶性抗原或多克隆刺激物。優(yōu)選如上所述通過3H-胸苷摻入來檢測T細(xì)胞增殖。通過夾心ELISA來檢測細(xì)胞因子產(chǎn)生，其中細(xì)胞因子捕獲抗體包被于96孔板(tray)的表面，加入培養(yǎng)物上清并在室溫孵育1小時，然后加入對特定細(xì)胞因子特異的檢測抗體，隨后加入綴合至酶例如辣根過氧化物酶的第二步抗體，然后加入相應(yīng)底物并在讀板儀中檢測吸光度。在用特異于特定細(xì)胞表面分子的抗體染色靼T細(xì)胞后，通過直接或間接免疫熒光檢測細(xì)胞表面分子的變化?？贵w即可直接用熒光素標(biāo)記，也可使用熒光標(biāo)記的特異于第一抗體的第二步抗體標(biāo)記，用細(xì)胞焚光測定儀分析細(xì)胞。本發(fā)明所用的結(jié)合分子具有對CD45RO和CD45RB兩者的結(jié)合特異性("CD45RB/RO結(jié)合分子")。優(yōu)選地，結(jié)合分子以(Kd)〈20nM、優(yōu)選Kd<15nM或〈10nM，或優(yōu)選Kd<5nM的解離常數(shù)結(jié)合CD45RO同種型。優(yōu)選地，結(jié)合分子以Kd<50nM、優(yōu)選Kd<15nM或〈10nM，或更優(yōu)選Kd<5nM結(jié)合CD45RB同種型。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所用的結(jié)合分子結(jié)合下列那些CD45同種型1)包括CD45分子的A和B表位但不包括C表位；和/或2)包括CD45分子的B表位但不包括A和C表位；和/或3)不包括CD45分子的A、B或C表位中的任一種。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合分子不結(jié)合下列CD45同種型，其包含1)CD45分子的A、B和C表位中的全部；和/或2)CD45分子的B和C兩種表位，但不包括A表位。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合分子1)識別記憶和體內(nèi)同種異體活性(alloactivated)T細(xì)胞；和/或2)結(jié)合人T細(xì)胞例如PEER細(xì)胞上的其靶標(biāo)，其中所述結(jié)合優(yōu)選以Kd<15nM、更優(yōu)選以Kd<10nM、最優(yōu)選以Kd<5nM來結(jié)合；和/或3)體外抑制同種異體活性T細(xì)胞功能，優(yōu)選具有約小于100nM的IC50、優(yōu)選小于50nM或30nM，更優(yōu)選具有約10或5nM的IC50，最優(yōu)選具有約0.5nM或甚至0.1nM的IC50;和/或4)誘導(dǎo)人T淋巴細(xì)胞中通過細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡；和/或5)在體外誘導(dǎo)同種抗原特異性T細(xì)胞耐受性；和/或6)當(dāng)以有效量施用時，預(yù)防在SCID小鼠中通過注射人PBMC所誘導(dǎo)的致命性異種移;fet物抗宿主病(GvHD);和/或7)結(jié)合T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、干細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和/或粒細(xì)胞，但不結(jié)合血小板或B淋巴細(xì)胞；和/或8)支持具有特征性T調(diào)節(jié)細(xì)胞(Treg)表型的T細(xì)胞的分化；和/或9)誘導(dǎo)能夠抑制幼稚T細(xì)胞活化的T調(diào)節(jié)細(xì)胞；和/或10)抑制介導(dǎo)人同種異體移植物皮膚排斥的炎性過程，特別是，在移植了人皮膚或移入了單核脾細(xì)胞的SCID小鼠體內(nèi)抑制介導(dǎo)人同種異體移植物皮膚排斥的炎性過程；和/或11)在hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型中延長人胰島同種異體移植物的存活。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合與Aversa等CellularImmunology158，314-328(1994)中所述的單克隆抗體"A6"相同的表位。將該參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容并入本文作為參考并向讀者專門提及。由于上述結(jié)合特性和生物活性，本發(fā)明所使用的結(jié)合分子在醫(yī)藥，例如治療和/或預(yù)防中是特別有用的。另外，此類結(jié)合分子在離體調(diào)節(jié)DC功能以便DC展示出耐受性表型方面尤其有用。可以設(shè)想，這些耐受性DC將在治療和/或預(yù)防中有用。其中結(jié)合分子和/或調(diào)節(jié)的DC特別有用的疾病包括自身免疫病、移植排斥、皮炎、4艮屑病、炎性腸病和/或變態(tài)反應(yīng)，將在下文中進(jìn)一步闡述。包含SEQIDNO:l的多肽和SEQIDNO:2的多肽的分子是CD45RO/RB結(jié)合分子。SEQIDNO:l的CD45RO/RB結(jié)合分子中高變區(qū)CDR1，、CDR2，和CDR3，如下；CDR1，具有氨基酸序列Arg-AlaSer-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln(RASQNIGTSIQ)(SEQIDNO:19),CDR2，具有氨基酸序列Ser曙Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser(SSSESIS)(SEQIDNO:20)，且CDR3，具有氨基酸序列Gln畫Gln國Ser-Asn-Thr-Trp-Pro曙Phe-Thr(QQSNTWPFT)(SEQIDNO:21)。我們還發(fā)現(xiàn)了SEQIDNO:2的CD45RO/RB結(jié)合分子中的高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3,CDR1具有^J^財(cái)列Asn國Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)(SEQIDNO:22)，CDR2具有氨基酸序列Tyr隨Phe-Asn-Pro-Tyr畫Asn-His-Gly-Thr畫Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)(SEQIDNO:23)，且CDR3具有氨基酸序列Ser隱Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)(SEQIDNO:24)。CDR是3個特異性互補(bǔ)決定區(qū)，也稱為高變區(qū)，其基本上決定了抗原結(jié)合特性。這些CDR分別是可變區(qū)例如SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的部分，其中這些CDR隨構(gòu)架區(qū)(FR)例如恒定區(qū)而改變。在嵌合抗體中，SEQIDNO:l是輕鏈例如SEQIDNO:3的一部分，SEQIDNO:2是重鏈例如SEQIDNO:4的一部分。重鏈的CDR連同相關(guān)輕鏈的CDR基本上構(gòu)成了本發(fā)明所用的分子的抗原結(jié)合部位。已知，輕鏈可變區(qū)對結(jié)合動力學(xué)所做的貢獻(xiàn)相比相關(guān)重鏈可變區(qū)而言是小的，分離的重鏈可變區(qū)自身具有抗原結(jié)合活性。此類分子通常稱為單鏈抗體。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所使用的結(jié)合分子在至少一個抗原結(jié)合部位包含例如CD45RO/RB結(jié)合分子，其依次包含高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3,所述CDR1具有^J^絲列Asn-Tyr-Ile匿Ile-His(NYIIH)(SEQIDNO:22)，所述CDR2具有#^,列Tyr畫Phe-Asn-Pro-Tyr陽Asn畫His-Gly國Thr-Lys-Tyr畫Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)(SEQIDNO:23)，且所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe畫Asp-Thr(SGPYAWFDT)(SEQIDNO:24)。在另一實(shí)施方案中，結(jié)合分子在結(jié)果上是上述結(jié)合分子的直接等價物。本發(fā)明的另一方面使用了包含至少一個抗原結(jié)合部位的分子，例如CD45RO/RB結(jié)合分子，其包含a)依次包含高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的第一結(jié)構(gòu)域，所述CDR1具有氨基,列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)(SEQIDNO:22)，所述CDR2具有氨基酸序歹'JTyrPhe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His畫Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)(SEQIDNO:23)，且所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro畫Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp畫Thr(SGPYAWFDT)(SEQIDNO:24);和b)依次包含高變區(qū)CDR1'、CDR2，和CDR3，的第二結(jié)構(gòu)域，CDR1，具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile畫Gly-Thr-Ser-Ile-Gln(RASQNIGTSIQ)(SEQIDNO:19),CDR2，具有氨基斷列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser(SSSESIS)(SEQIDNO:20)，且CDR3，具有氨基酸序列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe國Thr(QQSNTWPFT)(SEQIDNO:21)。在備選的實(shí)施方案中，本發(fā)明使用了作為上述結(jié)合分子的直接等價物的結(jié)合分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，依次包含高變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的第21一結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白重鏈，而依次包含高變區(qū)CDR1'、CDR2，和CDR3，的第二結(jié)構(gòu)域M疫球蛋白輕鏈。本發(fā)明的另一方面使用了分子例如CD45RO/RB結(jié)合分子，其包含SEQIDNO:l的多肽和/或SEQIDNO:2的多肽，優(yōu)選在一個結(jié)構(gòu)域中包含SEQIDNO:l的多肽且在另一結(jié)構(gòu)域中包含SEQIDNO:2的多肽，例如嵌合單克隆抗體。本發(fā)明的另一方面使用了分子例如CD45RO/RB結(jié)合分子，其包含SEQIDNO:3的多肽和/或SEQIDNO:4的多肽，優(yōu)選在一個結(jié)構(gòu)域中包含SEQIDNO:3多肽且在另一結(jié)構(gòu)域中包含SEQIDNO:4的多肽，例如嵌合單克隆抗體。當(dāng)抗原結(jié)合部位同時包含第一和第二結(jié)構(gòu)域、或者SEQIDNO:l或SEQIDNO:3的各自多肽以及SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的各自多肽時，這些可以位于同一多肽上，或優(yōu)選每個結(jié)構(gòu)域可位于不同鏈上，例如第一結(jié)構(gòu)域作為重鏈例如免疫球蛋白重鏈或其片段的一部分，第二結(jié)構(gòu)域作為輕鏈例如免疫球蛋白輕鏈或其片段的一部分。從上述描述中可以看出，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所用的CD45RO/RB結(jié)合分子是單克隆抗體(mAb)，其中結(jié)合活性主要由上述CDR區(qū)來決定，例如與其他不具結(jié)合特異性的分子(例如構(gòu)架，例如恒定區(qū))結(jié)合的所述CDR區(qū)，其基本上是人源的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，CD45RO/RB結(jié)合分子是IgGl同種型的單克隆抗體。本發(fā)明可利用CD45RO/RB結(jié)合分子，其為Aversa等CellularImmunology158，314-328(1994)中所述的單克隆抗體"A6"，該文獻(xiàn)被引入作為表征A6的章節(jié)的參考。本發(fā)明的另一方面使用了根據(jù)本發(fā)明的CD45RO/RB結(jié)合分子，其為嵌合的、人源化的或全人單克隆抗體。CD45RO/RB結(jié)合分子的例子的例子包括嵌合或人源化抗體，例如衍生自B細(xì)胞或雜交瘤產(chǎn)生的抗體和/或其任何片段例如F(ab，)2和Fab片段，以及單鏈或單結(jié)構(gòu)域抗體。單鏈抗體由通過肽鍵共價連接的抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)組成，通常由10-30個氛基酸組成，優(yōu)選由15-25個氨基酸組成。因此，該結(jié)構(gòu)不包括重鏈和輕鏈的恒定部分，并且相信小的肽間隔區(qū)應(yīng)當(dāng)22比整個恒定部分有更小的抗原性。嵌合抗體是指其中重鏈和輕鏈或二者的恒定區(qū)是人源的，而重鏈和輕鏈兩者的可變區(qū)是非人源的(例如鼠)。人源化抗體是指抗體中高變區(qū)(CDR)是非人(例如，鼠)源的，而所有或基本上所有其他部分例如恒定區(qū)和可變區(qū)的高保守部分是人源的。然而，人源化抗體在鄰近高變區(qū)的可變區(qū)部分中保留有鼠序列的少量氨基酸。高變區(qū)，即CDR可與任何種類的人源構(gòu)架區(qū)(例如輕鏈和重鏈的恒定部分)相結(jié)合。合適的構(gòu)架區(qū)例如"Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest",Kabat，E.A等，USdepartmentofhealthandhumanservices,Publichealthservice,NationalInstituteofhealth中所述。優(yōu)選人重鏈的恒定部分是IgGl型，包括同種型，優(yōu)選人輕鏈的恒定部分可為K或X型，更優(yōu)選為K型。優(yōu)選地，所述重鏈包含不多于一個糖基化位點(diǎn)，最優(yōu)選糖基化位點(diǎn)是N-糖基化位點(diǎn)，最優(yōu)選一個糖基化位點(diǎn)是位于重鏈的恒定部分。最優(yōu)選地，可變區(qū)中不存在糖基化位點(diǎn)，優(yōu)選在構(gòu)架區(qū)內(nèi)無糖基化位點(diǎn)。重鏈優(yōu)選的恒定部分是SEQIDNO:4的多肽(無上述的CDR1，、CDR2，和CDR3，序列部分)，輕鏈優(yōu)選的恒定部分是SEQIDNO:3多肽(無上述的CDR1、CDR2和CDR3序列部分)。在一個實(shí)施方案中，使用包含氨基酸SEQIDNO:7或氨基酸SEQIDNO:8的輕鏈可變區(qū)和/或SEQIDNO:9或SEQIDNO:IO的重鏈可變區(qū)的人源化抗體，所述輕鏈可變區(qū)包含如上所述的CDR1'、CDR2，和CDR3',所述重鏈可變區(qū)包含如上所述的CDR1、CDR2和CDR3。在另一實(shí)施方案中，使用包含氨基酸SEQIDNO:7或氨基酸SEQIDNO:8的輕鏈可變區(qū)和/或SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的重鏈可變區(qū)的另一人源化抗體，所述輕鏈可變區(qū)包含如上所述的CDR1'、CDR2，和CDR3，，所述重鏈可變區(qū)包含如上所述的CDR1、CDR2和CDR3。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明使用包含SEQIDNO:9或SEQIDNO:IO的多肽和SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的多肽的人源化抗體。在再一實(shí)施方案中，本發(fā)曰/IDNO:7或SEQIDNO:8的多肽的人源化抗體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明使用包含下列的人源化抗體SEQIDNO:9的多肽和SEQIDNO:7的多肽(例如VHE/humV2)，SEQIDNO:9的多肽和SEQIDNO:8的多肽(例如VHE/humVl)，SEQIDNO:10的多肽和SEQIDNO:7的多肽(例如VHQ/humV2)，SEQIDNO:10的多肽和SEQIDNO:8的多肽(例如VHQ/humVl)，SEQIDNO:31的多肽和SEQIDNO:7的多肽(例如VHEN73D/humV2),SEQIDNO:31的多肽和SEQIDNO:8的多肽(例如VHEN73D/humVl)，SEQIDNO:32的多肽和SEQIDNO:7的多肽(例如VHQN73D/humV2),或SEQIDNO:32的多肽和SEQIDNO:8的多肽(例如VHQN73D/h腿Vl)，具有本文所述序列例如CDR1(SEQIDNO:22)、CDR2(SEQIDNO:23)、CDR3(SEQIDNO:24)、CDR1'(SEQIDNO:19)、CDR2'(SEQIDNO:20)、CDR3'(SEQIDNO:21),或具有SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的本發(fā)明所用的多肽包括所述(多)肽(序列)的直接等價物；例如，包括所述多肽的功能衍生物。所述功能衍生物可包括特定序列的共價修飾，和/或所述功能衍生物可包括特定序列的氨基酸序列變體。若不另外說明，"多肽"包括包含通過肽鍵彼此連接的氨基酸的任何肽或蛋白質(zhì)，其具有起始于N-末端并終止于C-末端的M酸序列。優(yōu)選本發(fā)明中所使用的多肽是單克隆抗體。更優(yōu)選多肽是嵌合的(V-移植的)或人源化的(CDR-移植的)單克隆抗體。人源化的(CDR-移植的)單克隆抗體可以或可以不包括引入受體抗體構(gòu)架(FR)序列的其他突變。優(yōu)選人源化或嵌合抗體包含不多于一個糖基化位點(diǎn)。最優(yōu)選所述一個糖基化位點(diǎn)是N-糖基化位點(diǎn)。最優(yōu)選在可變區(qū)中不存在糖基化位點(diǎn)，甚至更優(yōu)選在重鏈可變區(qū)中不存在糖基化位點(diǎn)，最優(yōu)選在構(gòu)架區(qū)(FR)中不存在糖基化位點(diǎn)。本文所用多肽的功能衍生物包括具有與本發(fā)明所用多及M目同的定性生物學(xué)活性(即具有結(jié)合CD45RO和CD45RB的能力)的分子。功能衍生物包括本發(fā)明所用多肽的片段和肽類似物。片段包含例如特定序列的多肽序列內(nèi)的區(qū)域。所用的術(shù)語"衍生物"定義了本發(fā)明使用的例如特定序列的氨基酸序列變體和多肽的共價修飾。本發(fā)明所用的例如特定序列的多肽的功能f汴生物優(yōu)選具有與上述結(jié)構(gòu)上限定的(例如特定序列的)多肽M酸序列至少約65%、更優(yōu)選至少約75%、甚至更優(yōu)選至少約85%，最優(yōu)選至少約95%的全序列同源性，并基本上4果持結(jié)合CD45RO和CD45RB的能力。優(yōu)選，功能衍生物至少具有下述分子的結(jié)合親和力包含SEQIDNO:l多肽和/或SEQIDNO:2多肽的結(jié)合分子，包含SEQIDNO:9或SEQIDNO:10的多肽和/或SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的多肽的人源化抗體，或者包含SEQDNO:31或SEQIDNO:32的多肽和/或SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的多肽的人源化抗體。術(shù)語"共價f^飾"包括本文所述的(例如特定序列的)多肽的修飾，或具有有機(jī)蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)的衍生劑的其片段、與異源多肽序列的融合、和翻譯后修飾。共價修飾的(例如特定序列的)多肽，仍然具有通過交聯(lián)而結(jié)合CD45RO和CD45RB的能力。共價修飾傳統(tǒng)上是通過使靶氨基酸殘基與能夠與所選側(cè)或末端殘基反應(yīng)的有機(jī)衍生劑相反應(yīng)、或者通過利用在所選重組宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的翻譯后修飾的機(jī)制來引入。某些翻譯后修飾是重組宿主細(xì)胞對所表達(dá)的多肽作用的結(jié)果。谷氨酰胺酰基和天冬跣胺?；鶜埢３Ｊ峭ㄟ^翻譯后脫酰胺基成為相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基。備選地，這些殘基在溫和酸性條件下脫氨基。其他翻譯后修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨?；?、酪氨酸或蘇氨酰殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的a氨基的甲基化，參見例如T.E.Crdghton，Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,79-86頁(1983)。共價修飾例如包括包含本文所述的(例如特定序列的)多肽及其M酸序列變體的融合蛋白，例如免疫粘附素，以及對異源信號序列的N端融合。本文將相對于天然多肽及其功能衍生物的"同源性"定義為在比對序列并引入間隔之后(為獲得最高百分比同源性，如果需要的話)，候選序列中與相應(yīng)天然多肽殘基相一致的氨基酸殘基的百分比，不將任何保守取代認(rèn)為是序列同一性的部分。N-或C-端延伸或者插入將不被視為降低同一性或同源性。用于比對的方法和計(jì)算枳4呈序是z^P的。"氨基酸"是指所有天然發(fā)生的L-a-氨基酸，例如并包括D-氨基酸。這些氨基酸可通過公知的單字母或三字母命名來確定。術(shù)語"氨基酸序列變體"是指與本文所述(例如特定序列的)多^M目比在其氨基酸序列中具有一些差異。本文所述(例如特定序列的)多肽的氨基酸序列變體仍然具有結(jié)合CD45RO和CD45RB的能力。取代變體是在本文所述(例如特定序列的)多肽中具有至少一個移除的氨基酸和一個在其相同位置上插入的不同氨基酸的那些多肽。這些取代可以是單獨(dú)的，其中分子中僅有一個氨基酸被取代，或者可以是多重的，其中在同一分子中有兩個或更多氨基酸已被取代。插入變體是在本文所述(例如特定序列的)多肽中在緊鄰特定位置氨基酸處具有一個或多個插入的氨基酸的那些多肽。緊鄰氨基酸意味著連接至氨基酸的a-氣基或ot-tt官能團(tuán)。缺失變體是那些在根據(jù)本發(fā)明的(例如特定序列的)多肽中移除了一個或多個氨基酸的多肽。通常，缺失變體在分子的特定區(qū)域具有一個或兩個缺失的氨基酸。本文還描述了下列多核苷酸序列GGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTG(SEQIDNO:25),編碼CDR1的^J^酸序列；TTCTTCTGAGTCTATCTCTGG(SEQIDNO:26)，編碼CDR2的氨基酸序列；ACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTT(SEQIDNO:27),編碼CDR3的#^*列；TTATATTATCCACTG(SEQIDNO:28)，編碼CDR1，的^J^紗列；TTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAG(SEQIDNO:29)，編碼CDR2，的^J^斷列；AGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTG(SEQIDNO:30)，編碼CDR3，的氨基,列；編碼SEQIDNO:l的多肽的SEQIDNO:5，即本發(fā)明所用的mAb的輕鏈可變區(qū)；編碼SEQIDNO:2的多肽的SEQIDNO:6，即本發(fā)明所用的mAb的重鏈可變區(qū)；編碼SEQIDNO:9的多肽的SEQIDNO:11，即包括CDR1、CDR2和CDR3的重鏈可變區(qū)；編碼SEQIDNO:IO的多肽的SEQIDNO:12,即包括CDR1、CDR2和CDR3的重鏈可變區(qū)；編碼SEQIDNO:7的多肽的SEQIDNO:13，即包括CDR1，、CDR2，和CDR3，的輕鏈可變區(qū)；編碼SEQIDNO:8的多肽的SEQIDNO:14，即包括CDR1'、CDR2，和CDR3，的輕鏈可變區(qū)；編碼SEQIDNO:8的多肽的SEQIDNO:33,即包括CDR1，、CDR2，和CDR3，的輕鏈可變區(qū)；編碼SEQIDNO:31的多肽的SEQIDNO:34，即包括CDR1、CDR2和CDR3的重鏈可變區(qū)；編碼SEQIDNO:32的多肽的SEQIDNO:35，即包括CDR1、CDR2和CDR3的重鏈可變區(qū)；包含編碼CD45RO/RB結(jié)合分子(例如編碼本文所述的CDR1、CDR2和CDR3的^J^酸序列和/或編碼本文所述的CDR1，、CDR2，和CDR3，的氨基酸序列)的多核苷酸的多核苷酸可用作產(chǎn)生本發(fā)明所用的結(jié)合分子的來源材料。此類多核苷酸包括上面所列的那些以及下述的那些，如下包含SEQIDNO:5的多核苷酸和/或優(yōu)選包含SEQIDNO:6的多核苷酸的多核苷酸。包含編碼SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的多肽和/或優(yōu)選包含編碼SEQIDNO:9或SEQIDNO:IO的多肽的多核苷酸的多核苷酸，例如編碼SEQIDNO:7的多肽和SEQIDNO:9的多肽，SEQIDNO:7的多肽和SEQIDNO:IO的多肽，SEQIDNO:8的多肽和SEQIDNO:9的多肽，或SEQIDNO:8的多肽和SEQIDNO:IO的多肽；包含SEQIDNO:ll或SEQIDNO:12的多核苷酸和/或優(yōu)選包含SEQIDNO:13的多核苷酸或SEQIDNO:14的多核苷酸的多核苷酸，其優(yōu)選包含SEQIDNO:ll的多核苷酸和SEQIDNO:13的多核苷酸，SEQIDNO:ll的多核苷酸和SEQIDNO:14的多核苷酸，SEQIDNO:12的多核苷酸和SEQIDNO:13的多核苷酸，或SEQIDNO:12的多核苷酸和SEQIDNO:14的多核苷酸；包含編碼SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的多肽和/或優(yōu)選包含編碼SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的多肽的多核苷酸的多核苷酸，例如編碼SEQIDNO:31的多肽和SEQIDNO:7的多肽，SEQIDNO:31的多肽和SEQIDNO:8的多肽，SEQIDNO:32的多肽和SEQIDNO:7的多肽，或SEQIDNO:32的多肽和SEQIDNO:8的多肽；和包含SEQIDNO:34或SEQIDNO:35的多核苷酸和/或優(yōu)選包含SEQIDNO:33、SEQIDNO:14或13的多核普酸的多核苦酸。SEQIDNO:34的多肽和SEQIDNO:33的多肽，SEQIDNO:34的多肽和SEQIDNO:14的多肽，SEQIDNO:34的多肽和SEQIDNO:13的多肽，SEQIDNO:35的多肽和SEQIDNO:33的多肽，28SEQIDNO:35的多肽和SEQIDNO:14的多肽，或SEQIDNO:35的多肽和SEQIDNO:13的多肽。除非另有說明，"多核苷酸"包括多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其可以是未^f奮飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA，包括但不限于單鏈和雙鏈RNA、以及為單鏈與雙鏈區(qū)混合物的RNA。CD45RO/RB結(jié)合分子，例如嵌合、人源化或全人抗體，可通過重組DNA^支術(shù)來生產(chǎn)。因此，可構(gòu)建一種或多種編碼CD45RO/RB的DNA分子，將其置于合適的控制序列下游，并通過合適的載體轉(zhuǎn)移(例如，通過轉(zhuǎn)染)至合適的宿主(生物體)進(jìn)行表達(dá)。此類多核苷酸可例如編碼CD45RO/RB結(jié)合分子的單獨(dú)的重鏈和/或輕鏈。通過常規(guī)方法結(jié)合本文所提供的信息(例如高變區(qū)或可變區(qū)的氨基酸序列以及編碼這些區(qū)域的多核苷酸序列的信息)可獲得CD45RO/RB結(jié)合分子。構(gòu)建可變區(qū)基因的方法如EP239400中所述，并可簡要概述如下可克隆編碼具有任何特異性的mAb可變區(qū)的基因。確定編碼構(gòu)架區(qū)和高變區(qū)的DNA片段并去除編碼高變區(qū)的DNA片段。根據(jù)本文所述的CDR和CDR，序列通過DNA合成來制備雙鏈合成CDR盒。為這些盒提供粘性末端以便它們可以連接至目標(biāo)人源構(gòu)架的連接點(diǎn)處。編碼單鏈抗體的多核苷酸也可根據(jù)例如近似地常規(guī)方法來制備?？蓪⒕幋a本發(fā)明所用多肽的多核苷酸便利地轉(zhuǎn)移至合適的表達(dá)載體。根據(jù)常規(guī)方法，可使用合適的細(xì)胞系(例如CHO細(xì)胞系，例如DG44和其他DHFR—CHO細(xì)胞、Sp/2或NS/0細(xì)胞系)。例如包含合適啟動子和編碼重鏈和輕鏈恒定部分的基因的表達(dá)載體是已知的并是市售的。合適的宿主(包括細(xì)胞培養(yǎng)物或轉(zhuǎn)基因動物)是已知的或可根據(jù)常規(guī)方法找到。合適的表達(dá)載體包括編碼本文所述的CD45RO/RB結(jié)合分子的多核苷酸，例如SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40或SEQIDNO:41的序列。如上所述，本發(fā)明所用的CD45RO/RB結(jié)合分子通過調(diào)節(jié)DC表型發(fā)揮了免疫抑制和至耐受性作用。CD45RO/RB結(jié)合分子顯示出的這些以往未被認(rèn)識到的特性使得它們對于體內(nèi)和離體耐受性誘導(dǎo)同種異體抗原、自身抗原、變應(yīng)原和細(xì)菌菌群抗原均有用。例如，CD45RO/RB結(jié)合分子可用于耐受性DC的離體誘導(dǎo)，可將所述DC在暴露于結(jié)合分子之后引入有此需要的宿主，用于治療和預(yù)防疾病，例如包括自身免疫病，包括但不限于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、4艮屑病關(guān)節(jié)炎、自身免疫甲狀腺炎、毒性彌漫性甲狀腺腫、I型和II型糖尿病、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、硬皮病、自身免疫胃炎、腎小球腎炎；移植排斥，例如但不限于，器官和組織同種異體移植和異種移植排斥(例如用于例如心臟、肺、心肺聯(lián)合、肝臟、腎臟、胰腺、皮膚或角膜移植物的受體的治療)、移植物抗宿主病(GVHD)(例如在骨髓移植后)、和/或胰島細(xì)胞移植排斥；和/或還有4艮屑病、皮炎(例如特應(yīng)性和接觸性皮炎包括變應(yīng)性接觸性皮炎)、炎性腸病和/或變態(tài)反應(yīng)(包括變應(yīng)性哮喘)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物涉及治療和/或預(yù)防銀屑病和移植排斥(例如改善移植了同種異體細(xì)胞例如胰島細(xì)胞的人受體的排斥)。應(yīng)當(dāng)正一見，通過暴露至本文所述的CD45RO/RB結(jié)合分子而受到調(diào)節(jié)的DC將成為治療和/或預(yù)防自身免疫病、移植排斥、例如胰島細(xì)胞移植排斥或移植物抗宿主病(GVHD)、銀屑病、皮炎、炎性腸病和/或變態(tài)反應(yīng)的有效藥物/藥劑。如本文所述的"有效量"的DC和/或Tr細(xì)胞是足以帶來有益或所期望結(jié)果的量，例如直接或間接地減輕一種或多種因自身免疫病、移植排斥、銀屑病、皮炎、炎性腸病和/或變態(tài)反應(yīng)而引起的癥狀，提高患者的生命質(zhì)量，降低治療此類疾病所需的其他藥物的劑量，增強(qiáng)其他藥物的效果，延遲該疾病的t艮，和/或延長病人的存活。可在一次或多次給藥中施用有效量，并可以或可以不與其他藥物、化合物或藥物組合物聯(lián)合完成。因此，"有效量"可在施用一種或多種治療劑的情況下來理解，如果與一種或多種其他藥劑聯(lián)合，可認(rèn)為是以有效量30給予單一藥劑，可獲得或達(dá)到期望的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明所調(diào)節(jié)的DC和/或由T細(xì)胞暴露于調(diào)節(jié)的DC所產(chǎn)生的Tr可作為唯一活性劑施用或與免疫調(diào)節(jié)法中的其他藥物或其他抗炎劑一起施用，例如用于治療或預(yù)防與自身免疫病、移植排斥、銀屑病、皮炎、炎性腸病和/或變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病。例如，DC和/或Tr可與下列物質(zhì)組合使用鈣神經(jīng)素抑制劑(例如，環(huán)孢菌素A、環(huán)孢菌素G、FK-506、ABT-281、ASM981)、mTOR抑制劑(例如雷帕霉素、40-氧-(2-羥基)乙基-雷帕霉素、CCI779、ABT578、AP23573、AP23464、AP23675、AP23841、TAFA-93、biolimus-7或bioimus-9)、皮質(zhì)類固醇、環(huán)磷酰胺、硫唑噤呤、氨甲蝶呤、S1P受體激動劑(例如，F(xiàn)TY720或其類似物)、來氟米特或其類似物、咪哇立賓、霉酚酸、麥考酚酸莫酯、15-deoxyspergualine或其類似物、免疫抑制性單克隆抗體(例如，抗白細(xì)胞受體(例如MHC、CD2、CDS、CD4、CDlla/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、0X40、4-1BB)或其配體(例如CD154)的單克隆抗體)、或其他免疫抑制化合物(例如，具有CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域的至少一部分的重組體結(jié)合分子或其突變體(例如連接至非-CTLA4蛋白序列例如CTLA41g(例如，命名為ATCC68629)或其突變體的至少CTLA4胞外部分或其突變體例如LEA29Y)、或其他黏著分子抑制劑例如mAb、或低分子量抑制劑(包括LFA-1拮抗劑、選擇蛋白拮抗劑和VLA-4拮抗劑)?？赏ㄟ^任何常規(guī)途徑來施用，包括注射或通過隨時間逐步注入。施用可以是例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腔內(nèi)(intracavity)、皮下、局部或透皮的。"共施用，，是指在同一容器中或在單獨(dú)的容器中，共同或基本上同時施用各組分。優(yōu)選，將各成分以固定組合來施用。本發(fā)明的藥物和藥物組合物可包括至少一種藥物可接受載體或稀釋劑。本文所用的術(shù)語"藥物可接受載體或稀釋劑"是指一種或多種相容性31固體或液體填料、稀釋劑或密封物質(zhì)，其適合施用于哺乳動物包括人。術(shù)語"載體"表示天然的或合成的有機(jī)或無機(jī)成分，活性物質(zhì)與之組合從而方{更施用。術(shù)語"藥物可接受的"是指非毒性物質(zhì)，其不干擾活性成分的生物學(xué)活性的有效性。此類制劑通常可含有藥物可接受濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、相容性載體、輔助性免疫加強(qiáng)劑例如佐劑和細(xì)胞因子，以及任選地其他治療劑例如化療劑。當(dāng)用于藥物中時，鹽應(yīng)當(dāng)是藥物可接受的，但非藥物可接受的鹽可方便地用于制備其藥物可接受的鹽。藥物組合物可含有合適的緩沖劑，包括乙酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、和磷酸鹽。藥物組合物還可任選含有合適的防腐劑、例如勤L氯銨、三氯叔丁醇、對羥苯甲酸類和^^柳汞。施用于受試者的DC和/或Tr細(xì)胞的劑量可根據(jù)不同參數(shù)來選擇，特別是根據(jù)施用的方式和受試者的狀態(tài)。其他因素包括所期望的治療周期。在施用初始劑量下受試者的應(yīng)答不充分的情況下，在患者耐受性允許的范圍下可使用更高的劑量。如上所述的本發(fā)明的藥物組合物/藥物可進(jìn)一步包含例如活性成分，例如其他免疫調(diào)節(jié)抗體(例如但不限于本文所述的CD45RO/RB結(jié)合分子、抗-ICOS、抗-CD154、抗-CD134L)、或重組蛋白質(zhì)(例如但不限于rCTLA-4(CD152),rOX40(CD134))、或抗炎劑或免疫調(diào)節(jié)化合物(例如但不限于環(huán)孢菌素A、FTY720、RAD、雷帕霉素、FK506、15-deoxyspergualin、類固醇?？勺鳛樽杂山M合物或可配制成固定組合物來施用本發(fā)明的組合物。絕對劑量將取決于大量因素而不同，例如個體、施用途徑、所期望的周期、活性劑釋i文速率和所治療狀況的性質(zhì)和嚴(yán)重性。根據(jù)本發(fā)明的方法和用途所治療的上述疾病包括但不限于自身免疫病，其包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、4艮屑病關(guān)節(jié)炎、自身免疫甲狀腺炎、毒性彌漫性甲狀腺腫、I型和II型糖尿病、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、系統(tǒng)性紅斑狼瘠、干燥綜合征、硬皮病、自身免疫胃炎和腎小球腎炎；移植排斥，包括但不限于器官和組織同種異體移植和異種移植排斥(例如用于例如心臟、肺、心肺聯(lián)合、肝臟、腎臟、胰腺、皮膚或角膜移植物的受體的治療)、移植物抗宿主病(GVHD)(例如在骨髓移植后)、和/或胰島細(xì)胞移植排斥)；銀屑病、皮炎(例如特應(yīng)性和接觸性皮炎，包括變應(yīng)性接觸性皮炎)；炎性腸病和/或變態(tài)反應(yīng)(包括變應(yīng)性哞喘)。實(shí)施例通過參考下列實(shí)施例，將可更加全面地理解本發(fā)明。這些實(shí)施例僅僅是用于舉例說明的目的，并不應(yīng)理解為對本發(fā)明范圍的限制。本文中稱作chA6mA6的抗體是嵌合抗體，其包含SEQIDNO:3的輕鏈和SEQIDNO:4的重鏈。利用學(xué)生配對t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的所有分析。將p值小于0.05的視為顯著。所有培養(yǎng)物均一式三份進(jìn)行操作，誤差線代表SD。實(shí)施例1:嵌合A6抗體(chA6)的產(chǎn)生。將通過RT-PCR克隆得到的mAbA6(58)的可變區(qū)與人y-l重鏈和人K-輕鏈恒定區(qū)連接而產(chǎn)生ChA6。在轉(zhuǎn)染進(jìn)SP2/0細(xì)胞后，利用G418和氨甲蝶呤篩選克隆，通過山羊抗人IgG的親和層析和隨后的大小排阻層析來純化抗體。利用ACTICLEANETOX(Sterogene，2705-01)除去內(nèi)毒素。最終的內(nèi)毒素水平低于30pg/mg蛋白質(zhì)。實(shí)施例2:DC的分化通過Ficoll-Hypaque梯度離心(NycomedAmersham)從健康供體分離PBMC。37。C下在補(bǔ)充了10。/。FCS(Biowhittaker)、100U/ml青霉素/鏈霉素(Bristol-MyersSquibb)和50pM2巰基乙醇(BioRad)(DCmedium)的RPMI1640(Biowhittaker)中孵育1小時后分離CD14+單核細(xì)胞作為黏著部分。在充分洗滌后，通過在DC培養(yǎng)基中的10ng/mlrhlL-4(R&DSystems)和100ng/mlrhGM-CSF(Immunotools)中培養(yǎng)將黏著的單核細(xì)胞分化成DC。五天后，將DC保持非刺激狀態(tài)或轉(zhuǎn)移至含有經(jīng)輻射的(10，000RADS)表達(dá)人CD40L的3T3成纖維細(xì)胞的孔中從而誘導(dǎo)其成熟。在DC成熟過程中，在存在或缺乏抗-CD45RO/RB(chA6)mAb(10ftg/ml)下培養(yǎng)細(xì)胞。兩天后，收集未成熟的、成熟的和成熟/chA6DC、輻射(6000RADS)并用于刺激T細(xì)胞，在每輪刺激之前進(jìn)行冷凍和融化。通過流式細(xì)胞分析對DC的純度和成熟狀態(tài)進(jìn)行常規(guī)檢查以測定CDla、CD14、CD83和HLA-DR的表達(dá)。通常培養(yǎng)物含有>卯％的CDlaCD14細(xì)胞。在一些實(shí)驗(yàn)中，還檢測了未成熟、成熟和chA6調(diào)節(jié)的(成熟/chA6)DC的共刺激物分子CD40、CD80和CD86、ICOS-配體、ILT-4(來自GregorioAversa的友情饋贈)、ILT-3(Immunotech)、PDL-1、PDL-2(eBioscience)、ICAM-1、LFA-1、CD45RO和CD45RB(BDbioscience)的表達(dá)水平以及SLAM(來自GregorioAversa的友情饋贈)的表達(dá)水平。實(shí)施例3:T細(xì)胞的純化。利用CD4+T細(xì)胞分離試劑盒(MiltenyiBiotech),根據(jù)制造商的說明書，通過陰性選擇從PBMC中純化CD4+T細(xì)胞。保存部分所獲得的CD4+T細(xì)胞以備后用，并利用抗-CD45RO-偶聯(lián)的磁珠和LD陰性選擇柱(MiltenyiBiotech)對剩余細(xì)胞進(jìn)行CD45RO+耗盡。所獲得的細(xì)胞通常高于90%的CD4CD45ROCD45RA+。實(shí)施例4:T細(xì)胞的分化在2ml補(bǔ)充有5%混合AB人血清(Biowhittaker)和100U/ml青霉素/鏈霉素(Bristol-MyersSquibb)的X曙vivo15培養(yǎng)基(Biowhittaker)中用1x106同種異體CD4+CD45RCTT細(xì)胞培養(yǎng)1x105DC。在6天或7天后，加入rhlL-2(20U/ml)(Chiron)，并4吏細(xì)胞另外增殖7-8天。14天后開始培養(yǎng)，收集T細(xì)胞、洗滌、并用來自與原代培養(yǎng)中所用的相同同種異體基因供體的未成熟、成熟或成熟/chA6DC來對其進(jìn)行再刺激。3天后，加入rhlL-2。第二輪刺激后，對T細(xì)胞進(jìn)行收集、洗滌、并測試其增殖和抑制能力。在一些實(shí)驗(yàn)中，在每輪刺激之前加入中和抗-PDL2(MIH18，10ng/ml，eBioscience)mAb,且每次都分離細(xì)胞。將用未成熟DC反復(fù)刺激的T細(xì)胞稱為T(imm)，用成熟DC反復(fù)刺激的那些T細(xì)胞稱為T(mat)，而用成熟/chA6DC反復(fù)刺激的那些T細(xì)胞稱為T(chA6mat)。實(shí)施例5:T細(xì)胞的增殖和抑制為測試T(imm)、T(mat)或T(chA6mat)細(xì)胞抑制增殖和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力，將自體CD4+T細(xì)胞融化并用同種異體成熟DC(IO:I，T:DC)或單核細(xì)胞(CD3耗盡的PBMC，經(jīng)6000RADS輻射)(1:1，T:單核細(xì)胞)進(jìn)行刺激。在96孔圓底平板中，單獨(dú)或在T(imm)、T(mat)或T(chA6mat)(1:1的比例)細(xì)胞存在下在終體積200^1的完全培養(yǎng)基中刺激幼稚CD4+T細(xì)胞。在一些培養(yǎng)物中加入抗-IL-10R(30jag/ml，3F9)和/或抗TGF-j5(50^ig/ml，1D11，R&Dsystems)mAb。在指定時間后，用lpCi/孔311-胸苷脈沖16小時或者收集上清用于分析IFN-Y產(chǎn)生。實(shí)施例6:ELISA。用成熟同種異體DC以一定比例1:10(T:DC)刺激T(imm)、T(mat)或T(chA6mat)。24小時后收集上清用于IL-2和IL-4,48小時后收集用于1L-10和IFN-Y，72小時后收集用于TGF-P。為評估由未成熟、成熟和成熟/chA6DC所產(chǎn)生的細(xì)胞因子的量，將DC單獨(dú)培養(yǎng)。48小時后收獲上清。才艮據(jù)制造商的i兌明書(BDBiosciences)通過捕獲ELISA測定IL-2、IL-4、IL-IO、IL-12、IL-6、TNF-a和IFN-Y的水平。才艮據(jù)制造商的說明書(R&Dsystems)通過捕獲ELISA測定酸化上清中TGF-卩的水平。檢測極限如下IL曙2:20pg/ml;IL-4:20pg/ml;IL-10:20pg/ml;IL-12:30pg/ml，IL-6:30pg/ml，TNF-a:20pg/ml畫-Y:60pg/ml;TGF國(5:60pg/ml。實(shí)施例7:chA6mAb調(diào)節(jié)的成熟DC的表型在chA6mAb存在下產(chǎn)生的成熟DC包含細(xì)胞的混和群體，該群體由典型成熟的DC和類似于為未成熟DC的細(xì)胞組成。為測定chA6處理是否調(diào)節(jié)成熟DC的分化和成熟狀態(tài)，對細(xì)胞進(jìn)行了表型分析。在IL-4和GM-CSF存在下從CD14+T單核細(xì)胞分化成DC,共計(jì)5天，然后將其保持未刺激，或者在存在或缺乏可溶性chA6mAb下，通過與表達(dá)CD40L的鼠成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)48小時對其進(jìn)行活化。如預(yù)料的，未成熟、成熟和成熟/chA6DC的培養(yǎng)物均常規(guī)地>卯％CDla+CD14-(圖1)。未成熟DC是CD83陰性和HLA-DRlow。DC活化過程中加入chA6mAb并未改善CD83和HLA-DR的表達(dá)，其在成熟DC上是上調(diào)的(圖1)。成熟/chA6和成熟DC表達(dá)了相當(dāng)水平的共刺激分子CD40、CD80和CD86。實(shí)施例8:chA6mAb改變成熟DC上PDL-2和C45RB的表達(dá)。我們接下來測定了成熟/chA6是否表達(dá)先前與耐受性DC相關(guān)的分子。如所預(yù)料的，ILT3和ILT4的表達(dá)在成熟/chA6DC和成熟DC上是類似的，它們相對于未成熟DC較低(圖2A)。chA6成熟DC上ITL3的MFI是12.8±6.4，與之相比，成熟DC為13.6±6.4(n=5，p=ns)，而在未成熟DC上為18.4±9.2(n=5，p=ns)。在成熟/chA6DC上ILT4的MFI是14.7±4.9，與^目比，成熟DC上為12.4±4.1(n=8，p=ns)，而相對未成熟DC上為22.1±7.4(n=5,p=0.05)。成熟/chA6DC上ICOS-L的表達(dá)相對于成熟和未成熟DC稍稍增加成熟/chA6DC上ICOS-L的MFI是40.1123.2，與^目比，成熟DC上為20±11.5(n=4，ns)，而相對未成熟DC上為(31.4土18.1)(n=4,p=ns)。成熟/chA6DC和成熟DC表達(dá)類似水平的SLAM，成熟/chA6DC上的MFI是21.5士3.9，與之相比，成熟DC為18.9±10.9(n=4，ns),其相對于未成熟DC(8.9±5.1，n=4，p-0.05)顯著增加。未觀察到成熟/chA6DC和成熟DC之間在翁著分子ICAM-1和LFA-1的表達(dá)上有任何差異成熟/chA6DC上ICAM-1的MFI是471.5±192.5，與之相比，成熟DC上是472.1±192.7(n=5，p=ns)，相對于未成熟DC顯著增加(136.8土55.9，n=5，p=0.02)。成熟/chA6DC上LFA-1的MFI是50.3士25.2，與W目比，成熟DC上是53.3±26.6(n=5，p=ns)，且相對于未成熟DC稍稍增加(43.7士21.9，n=5,p-n.s.)。如先前所報(bào)道的(59)，PDL-1的表達(dá)在成熟/chA6和成熟DC中是相當(dāng)?shù)?，且相對于未成熟DC顯著較高。成熟/chA6DC上PDL-1的MFI是43.8±16.6，相對成熟DC為47.9±18.1(n=8，pns)，而相對未成熟DC為25.9±9(n=8，p幼.OOl)。DC-SIGN的表達(dá)在成熟/chA6和成熟DC中是相當(dāng)?shù)?，但相對于為成熟DC稍高。成熟/chA6、成熟和未成熟DC上36DC-SIGN的MFI分別為34，4±9.6、34.3±7.8和25.2±5.8。相反，成熟/chA6DC上的PDL-2表達(dá)顯著較高(圖2)。成熟/chA6DC上PDL-2的MFI是25.8土8.6，與"M目比，在成熟DC上為16.8±5.6(n=10，p=0.009)，而在未成熟DC上為19.7±6.6(n=10,p=ns)。我們還證實(shí)了在chA6mAb存在下成熟的DC上CD45RB的表達(dá)是更高的。成熟/chA6DC上CD45RB的MFI是22.6士9.2，與^目比，成熟DC上是10.7士4.4(i^6，p-0.05)，而相對未成熟DC上是24.8±10.1(n=6，p=0.04)。相反，成熟/chA6DC相對于成熟和未成熟DC而言，其CD45RO/RB同種型的表達(dá)是顯著較低的。成熟/chA6DC上CD45RO/RB的MFI是34.1土7.8,與^目比，成熟DC上為41.9±9.6(n=20，p-O.Ol)，而未成熟DC上為60.6±13.9(n=20，p=0.02)。CD45RO/RB同種型的下調(diào)并不是因?yàn)閏hA6mAb的存在，因?yàn)橛玫诙贵w對成熟/chA6DC的染色類似于用同種型對照的染色(數(shù)據(jù)未顯示)。CD45RO同種型的表達(dá)在三種亞類的DC中是相當(dāng)?shù)?。CD45RO的MFI在未成熟、成熟和成熟/chA6DC中分別是27.3士10.3、20.5±7,8和20.4±7.7。實(shí)施例9:chA6mAb處理未改變成熟DC的細(xì)胞因子表達(dá)鐠。我們接下來測定了DC的細(xì)胞因子分泌語。培養(yǎng)7天后洗滌未成熟、成熟和成熟/chA6DC，并再平板培養(yǎng)另外兩天。成熟/chA6DC與成熟DC相比，分泌相似量的IL-6、IL-12、IL-10和TNF-a(圖3)。所有這些結(jié)果表明DC成熟過程中chA6的加入并未改變所獲得的成熟DC的細(xì)胞因子產(chǎn)生。這些結(jié)果并不排除下述可能，即我們未曾分析的其他細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌可受到chA6mAb的調(diào)節(jié)。實(shí)施例10:chA6mAb誘導(dǎo)耐受性DC。然后我們研究了成熟/chA6DC在體外產(chǎn)生Tr細(xì)胞中是否如未成熟DC—樣有效。利用我們的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案(38)，用同種異體成熟/chA6DC以10:1的比例反復(fù)刺激CD4+CD45RO-T細(xì)胞(3輪刺激)，然后測試其響應(yīng)于成熟DC的增殖能力。令人吃驚地，在第3輪刺激后，用同種異體成熟/chA6DC接觸過的T細(xì)胞對于完全成熟DC的再活化是低反應(yīng)性的(圖4A)。相對于用成熟DC刺激的T細(xì)胞，觀察到Ag誘導(dǎo)的增殖平均降低57±23%(n=17，p=0.009)。如所預(yù)期的，用同種異體未成熟DC接觸過的T細(xì)胞對用同種異體成熟DC的再活化是低反應(yīng)性的，相對于反復(fù)用成熟DC接觸過的T細(xì)胞而言，增殖平均降低75±17%(n=23，p=0.0009)。對多克隆活化的應(yīng)答中獲得了相似的結(jié)果(圖4B)，在用成熟/chA6DC活化三輪之后增殖平均降低62.6±16.5%(n=3)，而用未成熟DC(n=3)活化之后降低了78.7±20%。這種低反應(yīng)性可通過添加抗-CD28mAb和外源性IL-2來挽救(圖4B)。發(fā)現(xiàn)在體外用成熟/chA60<:反復(fù)刺激外周血€04+€045議0-T-細(xì)胞導(dǎo)致極度低反應(yīng)性T細(xì)胞，這表明這些細(xì)胞也可能已經(jīng)獲得抑制能力。因此我們檢測了當(dāng)用同種異體成熟DC攻擊時，用成熟/chA6DC產(chǎn)生的T細(xì)胞抑制幼稚自體CD4+T細(xì)胞反應(yīng)的能力。用成熟DC單獨(dú)、或在T(chA6mat)或T(mat)細(xì)胞存在下(1:l的比例)刺激幼稚CD4+T細(xì)胞，并在開始培養(yǎng)后的2、3或4天評估增殖。作為對照，將用成熟DC接觸過的CD4+T細(xì)胞與T(imm)細(xì)胞共培養(yǎng)。用成熟DC刺激的幼稚CD4+T細(xì)胞顯示出初級反應(yīng)的動力學(xué)，培養(yǎng)4天后出現(xiàn)增殖峰(圖5)。如所預(yù)期的，當(dāng)用來自同一供體的DC再次挑戰(zhàn)時，用成熟DC產(chǎn)生的T(mat)細(xì)胞顯示出次級反應(yīng)的動力學(xué)，在第2天出現(xiàn)增殖峰。T(chA6mat)細(xì)胞在整個時間過程中保持了低反應(yīng)性。T(mat)細(xì)胞向初級MLR的加入導(dǎo)致了第2天增殖的增加。重要地，添加T(chA6mat)或T(imm)細(xì)胞抑制了響應(yīng)于成熟DC的幼稚CD4十T細(xì)胞的增殖。當(dāng)用T(chA6mat)細(xì)胞和T(imm)細(xì)胞培養(yǎng)4天后評估時，觀察到幼稚CD4+T細(xì)胞的增殖分別平均下降了76±23%和87±10%(n=13)。總之，這些結(jié)果表明chA6mAb存在下的DC活化導(dǎo)致產(chǎn)生了耐受性DC,其在體外誘導(dǎo)Tr細(xì)胞。實(shí)施例11:通過chA6調(diào)節(jié)的DC所產(chǎn)生的T細(xì)胞在表型上和功能上等同于Trl細(xì)胞。我們接下來檢測了用成熟/chA6DC反復(fù)刺激所誘導(dǎo)的Tr細(xì)胞是否類似于產(chǎn)生IL-10的Trl細(xì)胞。我們首先測定了用成熟DC活化之后T(chA6mat)細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生譜，且我們對比了它們與T(imm)或T(mat)細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生i普。如表1中所示，T(mat)細(xì)胞產(chǎn)生了測試的所有細(xì)胞因子。相反，T(chA6mat)細(xì)胞產(chǎn)生了IL-IO、IFN-y和TGF-(5,且不能夠產(chǎn)生顯著水平的IL-2或IL-4。類似于T(imm)細(xì)胞，T(chA6mat)細(xì)胞產(chǎn)生了相對于T(mat)細(xì)胞稍微:較低量的IL-IO，而TGF-卩的水平無顯著不同。T(chA6mat)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-y,但與T(mat)細(xì)胞所分泌的相比少至少10倍。因此T(chA6mat)細(xì)胞顯示出類似于Trl細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生譜。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表1.Timm、Tmat和TchA6maT細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生譜。在用未成熟、成熟和chA6/成熟DC刺激3輪結(jié)束時，用mDC活化T細(xì)胞系并在培養(yǎng)24h(對于IL-2)、48小時(對于IL-IO、腿畫y和TGF畫p)之后收集上清。通過ELISA測定指定細(xì)胞因子的水平。顯示了8次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中所檢測的平均士SEM量。我們接下來研究了T(chA6mat)細(xì)胞的增殖抑制是否通過IL-10和/或TGF-p的產(chǎn)生來介導(dǎo)。我們利用同種異體單核細(xì)胞進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)來誘導(dǎo)幼稚T細(xì)胞增殖。在這些條件下，添加中和的抗-IL-10R和抗-TGF-pmAb完全逆反了由T(chA6mat)細(xì)胞介導(dǎo)的增殖抑制(圖6)?？傊?，這些數(shù)據(jù)顯示利用成熟/chA6DC反復(fù)刺激所產(chǎn)生的Tr細(xì)胞在表型上和功能上等同于Trl細(xì)月包。實(shí)施例12:由chA6成熟DC介導(dǎo)的Trl細(xì)胞分化需要PDL-2/PD-l相互作用。我們發(fā)現(xiàn)，在所檢測的耐受性標(biāo)記中，PDL-2在用chA6mAb處理的成熟DC上是顯著上調(diào)的。已知PDL-2是一種由DC選擇性表達(dá)的抑制受體(59)。因此我們研究了PDL-2/PD-l相互作用是否是產(chǎn)生由成熟/chA6DC所誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞所需要的。在存在或缺乏中和性抗-PDL-2或?qū)φ誌gGmAb情況下，用成熟/chA6DC反復(fù)刺激CD4+CD45RO-T-細(xì)胞。如圖8A所示，中和性抗-PDL-2mAb存在下的T細(xì)胞分化完全逆轉(zhuǎn)了由成熟/chA6DC所誘導(dǎo)的低反應(yīng)性狀態(tài)。而且，PDL-2的阻斷還阻止了具有抑制活性的Tr細(xì)胞的誘導(dǎo)(圖8)。參考文獻(xiàn)1.Bluestone,J.A.，J.B.Matthews,andA.M.Krensky.2000.Theimmunetolerancenetwork:the"HolyGrail"comestotheclinic./AmSocA^p/iro/11:2141-2146.2.Lenschow,D.J.,Y.Zeng,J.R.Thistlethwaite,A.Montag,W.Brady,M.G.Gibson,P.S.Linsley,andJ.A.Bluestone.1992.Long-termsurvivalofxenogeneicpancreaticisletgraftsinducedbyCTLA41g.Wmce257:789-792.3.Bushell,A.,P丄Morris,andK.J.Wood.1995.Transplantationtoleranceinducedbyantigenpretreatmentanddepletinganti-CD4antibodydependsonCD4+T-cellregulationduringtheinductionphaseoftheresponse.￡wr//mw,Z25:2643-2649.4.Larsen,C.P.，E.T.Elwood,D.Z.Alexander,S.C.Ritchie,R.Hendrix,C.Tucker-Burden,H.R.Cho,A.Aruffo,D.Hollenbaugh,P.S.Linsley,K丄Winn,andT.C.Pearson.1996.Long-termacceptanceofskinandcardiacallograftsafterblockingCD40andCD28pathways.胸匿381:434-438.5.Larsen,C.P.,S.J.Knechtle，A.Adams,T.Pearson,andA.D.Kirk.2006.AnewlookatblockadeofT-cellcostimulation:atherapeuticstrategyforlong-termmaintenanceimmunosuppression.A^n/77Yms//awf6:876-883.6.Li,Y.,X.C.Li,X.X.Zheng,A,D.Wells,L.A.Turka,andT.B.Strom.1999.Blockingbothsignal1andsignal2ofT-cellactivationpreventsapoptosisofalloreactive丁-cellsandinductionofperipheralallografttolerance.Ato她d5:1298-1302.7.Woodle,E.S.，D.Xu，R.A.Zivin，丄Auger,丄Charette，R.O'Laughlin,D,Peace,L.K.Jollife,T.Haverty,J.A.Bluestone,andJ.R.Thistlethwaite,Jr.1999.PhaseItrialofahumanized,FcreceptornonbindingOKT3antibody,huOKT3gamma1(Ala-Ala)inthetreatmentofacuterenalallograftrejection,rraw印/咖fl"on68:608-616.8.Friend,P丄，G.Hale,L.Chatenoud,P.Rebello,J.Bradley,S.Thiru,J.M.Phillips,andH.Waldmann.1999.PhaseIstudyofanengineeredaglycosylatedhumanizedCD3antibodyinrenaltransplantrejection.rra"邵/朋f油'ow68:1632-1637.9.Herold，K.C.,S.E.Gitelman，U.Masharani,W.Hagopian,B.Bisikirska,D.Donaldson,K.Rother,B.Diamond,D.M.Harlan,and丄A.Bluestone.2005.Asinglecourseofanti-CD3monoclonalantibodyhOKT3gamma1(Ala-Ala)resultsinimprovementinC-peptideresponsesandclinicalparametersforatleast2yearsafteronsetoftype1diabetes.D/a^eto54:1763-1769.10.Keymeulen,B.,E.Vandemeulebroucke,A.G.Ziegler，C.Mathieu,L.Kaufman,G.Hale,F.Gorus,M.Goldman,M.Walter,S.Candon,L.Schandene,L.Crenier,C.DeBlock,J.M.Seigneurhi，P.DePauw，D.Pierard,I.Weets,P.Rebello,P.Bird,E.Berrie，M.Frewin，H.Waldmann,IF.Bach,D.Pipeleers,andL.Chatenoud.2005.InsulinneedsafterCD3-41antibodytherapyinnew-onsettype1diabetes.iV/她d352:2598-2608.11.Utset,T.O.,J.A.Auger,D.Peace,R,A.Zivin,D.Xu,L.雄ffe,M.L.Alegre,丄A.Bluestone，andM.R.Clark.2002.Modifiedanti-CD3therapyinpsoriaticarthritis:aphaseI/IIclinicaltrial,/i/^wmato/29:1907-1913.12.Cortesini,R.,andN.Suciu畫Foca.2004.Theconceptof"partial"clinicaltolerance,rram77//mAmrnoZ13:101-104.13.Watanabe,T.,J.I.Masuyama,Y.Sohma,H.Inazawa,K.Horie,K.Kojima，Y.Uemura,Y.Aoki,S.Kaga，S.Minota,T.Tanaka，Y.Yamaguchi,T.Kobayashi,andI.Serizawa.2006.CD52isanovelcostimulatorymoleculeforinductionofCD4(+)regulatoryT-cells.C/z'w/www朋/.14.Kirk,A.D.,L.C.Burkly,D.S.Batty,R,E.Baumgartner,J.D.Berning,K.Buchanan,J.H.Fechner,Jr.,R丄.Germond,R.L.Kampen,N.B.Patterson,SJ.Swanson,D.K.Tadaki,C.N.TenHoor,L.White,S丄Knechtle,andD.M.Harlan.1999.Tr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ln-Gln-Ser-Asn-Thr畫Trp-Pro-Phe-Thr(QQSNTWPFT);或其直接等價物。4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中結(jié)合分子是嵌合分子或人源化分子。5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中結(jié)合分子是嵌合單克隆抗體或人源化單克隆抗體，例如IgGl同種型。6.權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的方法，其中結(jié)合分子包含SEQIDNO:l的多肽和/或SEQIDNO:2的多肽。7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中結(jié)合分子包含SEQIDNO:3的多肽和/或SEQIDNO:4的多肽。8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，其中結(jié)合分子是包含SEQIDNO:9或SEQIDNO:IO的多肽和/或SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的多肽的人源化抗體。9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其中結(jié)合分子是包含SEQIDNO:31或SEQIDNO:32的多肽和/或SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的多肽的人源化抗體。10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的方法，其中結(jié)合分子是包含下列分子的人源化抗體(a)SEQIDNO:9的多肽和SEQIDNO:7的多肽；(b)SEQIDNO:9的多肽和SEQIDNO:8的多肽；(c)SEQIDNO:10的多肽和SEQIDNO:7的多肽；(d)SEQIDNO:10的多肽和SEQIDNO:8的多肽；(e)SEQIDNO:31的多肽和SEQIDNO:7的多肽；(f)SEQIDNO:31的多肽和SEQIDNO:8的多肽；(g)SEQIDNO:32的多肽和SEQIDNO:7的多肽；或(h)SEQIDNO:32的多肽和SEQIDNO:8的多肽。11.權(quán)利要求1至10的方法，其中方法在體外進(jìn)行。12.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法，用于誘導(dǎo)樹突細(xì)胞顯示耐受性表型。13.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其包括(a)獲得未成熟樹突細(xì)胞的來源；且(b)在結(jié)合分子存在下誘導(dǎo)未成熟樹突細(xì)胞的成熟。14.權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的方法，其中樹突細(xì)胞來源于生物學(xué)樣口P口o15.權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的方法，其中通過在體外誘導(dǎo)單核細(xì)胞來源，例如來自生物樣品的單核細(xì)胞來源分化來獲得樹突細(xì)胞。16.權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括在體外將樹突細(xì)胞暴露于T細(xì)胞群體的步驟，從而誘導(dǎo)所述T細(xì)胞中的耐受性表型。17.權(quán)利要求16的方法，其中T細(xì)胞對于樹突細(xì)胞是同種異體的。18.治療和/或預(yù)防與自身免疫病、移植排斥、4艮屑病、炎性腸病和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病的方法，其包括對需要此類治療和/或預(yù)防的受試者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的方法獲得的樹突細(xì)胞，和/或根據(jù)權(quán)利要求16或17的方法獲得的T細(xì)胞。19.治療和/或預(yù)防與自身免疫病、移植排斥、4艮屑病、炎性腸病和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病的方法，其包括(a)從供體獲得單核細(xì)胞群體；(b)體外誘導(dǎo)所述單核細(xì)胞的分化從而產(chǎn)生樹突細(xì)胞的來源；(c)將樹突細(xì)胞暴露于權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子以便樹突細(xì)胞變?yōu)槟褪苄缘模?d)對需要該治療和/或預(yù)防的受體施用有效量的耐受性樹突細(xì)胞。20.治療和/或預(yù)防與自身免疫病、移纟直排斥、4艮屑病、炎性腸病和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病的方法，其包括(a)從供體獲得樹突細(xì)胞群體；(b)將樹突細(xì)胞暴露于權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子以便樹突細(xì)胞變?yōu)槟褪苄缘?；?c)對需要該治療和/或預(yù)防的受體施用有效量的耐受性樹突細(xì)胞。21.治療和/或預(yù)防與與自身免疫病、移植排斥、銀屑病、炎性腸病和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病的方法，其包括(a)從第一供體獲得單核細(xì)胞群體；(b)體外誘導(dǎo)所述單核細(xì)胞的分化從而產(chǎn)生樹突細(xì)胞的來源；(c)將樹突細(xì)胞暴露于權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所迷的結(jié)合分子以便樹突細(xì)胞變?yōu)槟褪苄缘模?d)將耐受性樹突細(xì)胞暴露于從第二供體獲得的T細(xì)胞群體，以便T細(xì)胞變?yōu)槟褪苄缘模磺?e)對需要該治療和/或預(yù)防的受體施用有效量的耐受性樹突細(xì)胞和/或耐受性T細(xì)胞。22.治療和/或預(yù)防與自身免疫病、移植排斥、4艮屑病、炎性腸病和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病的方法，其包括(a)從第一供體獲得樹突細(xì)胞群體；(b)將樹突細(xì)胞暴露于權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子以便樹突細(xì)胞變?yōu)槟褪苄缘模?c)將耐受性樹突細(xì)胞暴露于從第二供體獲得的T細(xì)胞群體，以便T細(xì)胞變?yōu)槟褪苄缘?；?d)對需要該治療和/或預(yù)防的受體施用有效量的耐受性樹突細(xì)胞和/或耐受性T細(xì)胞。23.權(quán)利要求19或權(quán)利要求20的方法，其中供體和受體是同一個體。24.權(quán)利要求19或權(quán)利要求20的方法，其中供體和受體是不同個體，任選其中該方法用于治療和/或預(yù)防移植排斥，且樹突細(xì)胞從移植供體獲得。25.權(quán)利要求21或權(quán)利要求22的方法，其中第一供體和/或第二供體是與受體相同的個體。26.權(quán)利要求21或22的方法，其中第二供體對于第一供體和/或受體是同種異體的。27.權(quán)利要求19至26中任一項(xiàng)的方法，其中樹突細(xì)胞在暴露于結(jié)合分子之前是未成熟樹突細(xì)胞，且其中該樹突細(xì)胞隨后在結(jié)合分子的存在下被誘導(dǎo)成熟。28.從權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的方法獲得的樹突細(xì)胞群體和/或從權(quán)利要求16或17的方法所獲得耐受性T細(xì)胞群體的用途，其用于治療和/或預(yù)防與自身免疫病、移植排斥、4艮屑病、炎性腸病和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病。29.從權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的方法獲得的樹突細(xì)胞群體和/或^M^又利要求16或17的方法所獲得耐受性T細(xì)胞群體的用途，其用于制備用于治療和/或預(yù)防與自身免疫病、移植排斥、銀屑病、炎性腸病和變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病的藥物。30.權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的方法，其用于制備包含耐受性樹突細(xì)胞和/或耐受性T細(xì)胞的藥物。31.從權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的方法獲得的耐受性樹突細(xì)胞群體和從權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的方法獲得的耐受性T細(xì)胞群體，其用作藥物。32.藥物組合物，其包含從權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的方法獲得的耐受性樹突細(xì)胞群體和/或從權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的方法獲得的耐受性T細(xì)胞群體。33.根據(jù)權(quán)利要求32的藥物組合物，其另外包含如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的結(jié)合分子。全文摘要本發(fā)明涉及CD45結(jié)合分子調(diào)節(jié)樹突細(xì)胞功能的用途。特別是本發(fā)明涉及CD45結(jié)合分子誘導(dǎo)耐受性樹突細(xì)胞的用途，其用于治療例如自身免疫病、移植排斥的疾病或病癥。文檔編號C07K16/28GK101687928SQ200880023453公開日2010年3月31日申請日期2008年6月3日優(yōu)先權(quán)日2007年6月5日發(fā)明者J·E·德弗里斯,J·M·卡瓦利多埃雷拉,M·G·龍卡羅洛,S·A·格雷格里,U·科爾塔尤爾申請人:諾瓦提斯公司;基金會中心圣拉斐爾蒙特塔博爾