專利名稱：具抗腫瘤活性的羊毛甾烷型三萜化合物及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及三萜類化合物，尤其涉及具有抗腫瘤活性的羊毛甾烷型三萜化合物及
其制備方法，本發(fā)明還涉及該羊毛甾烷型三萜化合物作為抗腫瘤劑的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤是威脅人類健康的第一殺手，尋找有效的抗腫瘤化合物是新藥篩選的熱點之 一。靈芝自古以來都是扶正固本的重要中藥，在祖國醫(yī)學(xué)對抗癌癥的領(lǐng)域內(nèi)發(fā)揮了獨到作 用。研究表明，羊毛甾烷類三萜和多糖類成分是靈芝中重要的抗腫瘤活性物質(zhì)基礎(chǔ)。目前 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一百多種的靈芝三萜，其中，ganoderic acid U， V， W， X， Y和Z等大多數(shù)具有羊 毛甾烷母核的化合物具有抗腫瘤活性。該類物質(zhì)抗腫瘤的機理主要與細(xì)胞毒作用直接殺死 或者加快癌細(xì)胞的凋亡有關(guān)。因此，盡可能多的制備羊毛甾烷類的衍生物并廣泛開展活性 篩選及構(gòu)效關(guān)系的研究是進(jìn)一步加快抗腫瘤活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)步伐的有力途徑，并且有可能進(jìn) 一步發(fā)展成為抗腫瘤的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一類具有具有抗腫瘤活性的羊毛甾烷型三萜化合物或其 可藥用的鹽。 本發(fā)明目的之二是提供一種制備上述具有抗腫瘤活性的羊毛甾烷型三萜化合物 的方法。 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的 具有抗腫瘤活性的羊毛甾烷型三萜化合物，其結(jié)構(gòu)式為式I、 II、 III、 IV或V所
示
式I
4<formula>formula see original document page 5</formula> 式II
<formula>formula see original document page 5</formula>
<formula>formula see original document page 5</formula>
式IV
當(dāng)然，可以制備本發(fā)明化合物酸加成的鹽，這些鹽包括在本發(fā)明之中。
本發(fā)明化合物的酸加成鹽優(yōu)選為藥學(xué)上可接受的，與適當(dāng)?shù)乃?例如鹽酸、醋酸、 硫酸)形成無毒的鹽，除了藥物上可接受的鹽以外，其它的鹽也包括在本發(fā)明之中。
—種制備上述化合物(I-V)的方法，包括
(1)制備靈芝子菌絲體或子實體的乙醇提取物；
(2)將靈芝子菌絲體或子實體的乙醇提取物清膏用水分散后，用石油醚反復(fù)萃取， 再用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯提取物； (3)乙酸乙酯提取物上硅膠柱，以氯仿-丙酮(50 : 1)梯度洗脫，根據(jù)TLC示蹤， 合并三萜類成分，分成A、 B、 C、 D、 E、 F六個組；將B、 C、 D三組分別上凝膠S印hadex LH-20 柱，以甲醇洗脫，根據(jù)TLC示蹤合并得B-l、 B-2、 B-3， C_l、 C_2、 C_3、 C_4、 C_5， D_l、 D_2、 D-3十一部分；B-3， C-2， D-3部分以半制備高效液相色譜儀進(jìn)一步分離；用pH值為3，由乙 腈-水-甲醇按照56 : 36 : 8的體積比組成的溶液分離B-3得到式I化合物；用pH值為 3，由乙腈-水-甲醇按照54 : 32 : 8的體積比組成的溶液分離c-2得到式II化合物；用 pH值為3，由乙腈-水-甲醇按照54 : 35 : 6的體積比組成的溶液分離B-3得到式ni 化合物；用pH值為3，由乙腈-水-甲醇按照55 : 35 : 12的體積比組成的溶液分離D-3 得到式IV化合物；用pH值為3，由乙腈-水-甲醇按照56 : 36 : 8的體積比組成的溶液 分離D-3得到式V化合物； 本發(fā)明從靈芝子實體或發(fā)酵菌絲體中分離得到5種新的羊毛甾烷衍生物，經(jīng)生物 活性評價，本發(fā)明新分離的5種羊毛甾烷衍生物能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，具有優(yōu)秀 的抗腫瘤活性，在臨床上可作為腫瘤劑應(yīng)用。 本發(fā)明還提供了一種抗腫瘤的藥物組合物，該藥物組合物由有效量的本發(fā)明化合 物或其可藥用的鹽與藥學(xué)上可接受的載體配合而成，也即是說，將藥學(xué)上可接受用量的本 發(fā)明化合物與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑配合后，按本領(lǐng)域常規(guī)的制劑方法將其制備成 任意一種適宜的藥物組合物。將有效量的本發(fā)明化合物與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑配 合后，按本領(lǐng)域常規(guī)的制劑方法將其制備成任意一種適宜的藥物組合物。通常該組合物適 合于口服給藥和注射給藥，也適合其他的給藥方法。該組合物可以是片劑、膠囊劑、粉劑、顆 粒劑、錠劑、栓劑，或口服液等液體制劑形式。根據(jù)不同的給藥方法，本發(fā)明藥物組合物可以 含有O. 1% _99%重量，優(yōu)選10-60%重量的本發(fā)明化合物。


圖1本發(fā)明羊毛甾烷型三萜化合物的分離路線圖。
具體實施例方式
為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它 們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。 實施例1 3 |3 -乙?；?7 |3 -羥基-11， 15， 23-三氧化-5 a -羊毛甾 烷-8-烯-26-酸(3-acetoxylganoderic acid B)(式I化合物)的制備
干燥靈芝菌絲體(3kg)粉碎成粗粉，用15倍體積乙醇重復(fù)提取3次，真空濃縮 提取液，浸膏以適量蒸餾水分散，以石油醚(60-90°C)反復(fù)萃取，棄去石油醚層，水層以乙 酸乙酯反復(fù)萃取，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮得浸膏105g。乙酸乙酯浸膏上硅膠柱，以氯 仿-丙酮(50 : 1)洗脫，根據(jù)TLC示蹤(在硫酸-甲醇顯色后顯紅色或棕黃色斑點即為三 萜類成分)，合并相同部分，分成6組(A-F)。 B、C、D三組分別上凝膠S印hadex LH-20柱，以 甲醇洗脫，根據(jù)TLC示蹤合并得i^一部分(B-l B-3， C-l C-5， D-1 D-3) 。 B_3， C_2， D-3部分以半制備高效液相色譜儀進(jìn)一步分離；其中，乙腈-水-甲醇(56 : 36 : 8，以甲
6酸調(diào)pH至3)分離B-3得到3-acetoxyl ganoderic acidB(白色無定型粉末)。
ESI/MS :557 [M-H]— 丄H-NMR :0. 92， 1. 23， 0. 92， 0. 89， 1. 33， 2. 03， 4. 78， 4. 46 13C-NMR :217. 6， 207. 8， 197. 9， 179. 9， 171. 1，80. 2， 66. 8， 24. 2， 21. 5. 實施例2乙基3P-乙酰基-7!3-羥基-ll，15，23-三氧化-5a-羊毛甾
烷-8-烯-26-酸酯(3-acetoxyl ganoderate B)(式II化合物)的制備 干燥靈芝菌絲體(3kg)粉碎成粗粉，用10倍體積乙醇重復(fù)提取3次，真空濃縮提
取液，浸膏以適量蒸餾水分散，以石油醚(60-90°C)反復(fù)萃取，棄去石油醚層，水層以乙酸
乙酯反復(fù)萃取，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮得浸膏85g。乙酸乙酯浸膏上硅膠柱，以氯仿_丙
酮(40 : 1)洗脫，根據(jù)TLC示蹤(在硫酸-甲醇顯色后顯紅色或棕黃色斑點即為三萜類成
分)，合并相同部分，分成6組(A-F) 。 B、 C、 D三組分別上凝膠S印hadex LH-20柱，以甲醇
洗脫，根據(jù)TLC示蹤合并得i^一部分(B-l B-3， C-l C-5， D_l D_3) 。 B_3， C_2， D_3
部分以半制備高效液相色譜儀進(jìn)一步分離；其中，乙腈-水-甲醇(54 : 32 : 8，以甲酸調(diào)
pH至3)分離C-2得至lj ethyl 3-acetoxyl ganoderateB (黃色槳狀物)。 ESI/MS :557 [M-H]— 丄H-NMR :0. 92， 1. 23， 0. 93， 0. 89， 1. 23， 1. 33， 2. 03， 4. 12， 4. 78， 4. 46 13C-NMR :217. 6， 207. 8， 197. 9， 175. 8， 171. 1，80. 2， 66. 9， 60. 9， 21. 5 實施例3 3，7，11，15，23-五氧化-5a-羊毛甾烷-8P ，9a 二氫-26-酸(8P ，
9 a -dihydroganoderic acid C)(式III化合物)的制備 干燥靈芝菌絲體(3kg)粉碎成粗粉，用20倍體積乙醇重復(fù)提取3次，真空濃縮提 取液，浸膏以適量蒸餾水分散，以石油醚(60-90°C)反復(fù)萃取，棄去石油醚層，水層以乙酸 乙酯反復(fù)萃取，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮得浸膏75g。乙酸乙酯浸膏上硅膠柱，以氯仿_丙 酮(50 : l)梯度洗脫，根據(jù)TLC示蹤(在硫酸-甲醇顯色后顯紅色或棕黃色斑點即為三萜 類成分)，合并相同部分，分成6組(A-F) 。 B、C、D三組分別上凝膠S印hadexLH-20柱，以甲 醇洗脫，根據(jù)TLC示蹤合并得i^一部分(B-l B-3， C-l C-5，D-1 D_3) 。 B_3，C-2，D_3 部分以半制備高效液相色譜儀進(jìn)一步分離；其中，乙腈-水-甲醇(54 : 35 : 6，以甲酸調(diào) pH至3)分離B-3得到8 P ，9 a -dihydroganodericacid C(白色無定型粉末)。
ESI-MS 513 [M-H]—NMR :0. 75， 0. 92， 1. 02， 1. 06， 1. 15， 1. 48， 1. 62， 13C-NMR :215. 3， 210. 4， 207. 7， 204. 8， 197. 9， 176. 2， 59. 1，20. 7， 12. 7 實施例4 3 |3 -乙?；?15 a -羥基-7， 11， 23-三氧化-5 a -羊毛甾
烷-8-烯-26-酸(3-acetoxylganoderic acid K)(式IV化合物)的制備 干燥靈芝菌絲體(3kg)粉碎成粗粉，用20倍體積乙醇重復(fù)提取3次，真空濃縮提
取液，浸膏以適量蒸餾水分散，以石油醚(60-90°C)反復(fù)萃取，棄去石油醚層，水層以乙酸
乙酯反復(fù)萃取，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮得浸膏50g。乙酸乙酯浸膏上硅膠柱，以氯仿_丙
酮(50 : 1)梯度洗脫，根據(jù)TLC示蹤(在硫酸-甲醇顯色后顯紅色或棕黃色斑點即為三萜
類成分)，合并相同部分，分成6組(A-F)。 B、C、D三組分別上凝膠S印hadex LH-20柱，以
甲醇洗脫，根據(jù)TLC示蹤合并得i^一部分(B-l B-3， C-l C-5， D_l D_3) 。 B_3， C_2，
D-3部分以半制備高效液相色譜儀進(jìn)一步分離；其中，乙腈-水-甲醇(55 : 35 : 12，以甲
7酸調(diào)pH至3)分離D-3得到3-acetoxyl ganodericacid K(黃色槳狀物)。
ESI-MS 559[M+H] +H-NMR :0. 75， 0. 92， 1. 02， 1. 06， 1. 15， 1. 48， 1. 62， 13C-NMR :215. 3， 210. 4， 207. 7， 204. 8， 197. 9， 176. 2， 59. 1，20. 7， 12. 7 實施例5 乙基15a-羥基-3， 7， 11 ， 23-四氧化_5 a -羊毛甾
烷-8-烯-26-oate (ethylganoderate J)(式V化合物)的制備 干燥靈芝菌絲體(3kg)粉碎成粗粉，用15倍體積乙醇重復(fù)提取3次，真空濃縮提取液，浸膏以適量蒸餾水分散，以石油醚(60-90°C)反復(fù)萃取，棄去石油醚層，水層以乙酸乙酯反復(fù)萃取，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮得浸膏45g。乙酸乙酯浸膏上硅膠柱，以氯仿_丙酮(50 : 1)梯度洗脫，根據(jù)TLC示蹤(在硫酸-甲醇顯色后顯紅色或棕黃色斑點即為三萜類成分)，合并相同部分，分成6組(A-F)。 B、C、D三組分別上凝膠S印hadex LH-20柱，以甲醇洗脫，根據(jù)TLC示蹤合并得i^一部分(B-l B-3， C-l C-5， D_l D_3) 。 B_3， C_2，D-3部分以半制備高效液相色譜儀進(jìn)一步分離；其中，乙腈-水-甲醇(56 : 36 : 8，以甲酸調(diào)pH至3分離D-3得到ethyl ganoderate J(黃色漿狀物)。
ESI-MS 541 [M-H]—H-NMR :0. 89， 0. 91， 0. 93， 1. 14， 1. 17， 1. 20， 1. 28， 4. 15， 4. 31 13C-NMR :215. 3， 208. 6， 204. 8， 201. 3， 176. 0， 152. 7， 151. 1，60. 8， 14. 3 試驗例1本發(fā)明式I-V化合物對人腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用試驗 1、供試化合物實施例1-5所制備的化合物式I-V ; 2、試驗方法 取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，以5000個/孔接種于96孔板中，于37°C 5% C02條件下培養(yǎng)10-12小時后，給藥組加入供試化合物，使其終濃度分別為20-240 g/mL，空白對照組為0. 08%二甲基亞砜，陽性對照組為20nmol/L的順鉑，采用MTT比色法，于波長570nm/650nm處測定吸光度A值。根據(jù)A值計算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率。
腫瘤細(xì)胞的生長抑制率=(1-實驗組的A值/陰性對照組的A值)X 100%
3、試驗結(jié)果 試驗結(jié)果表明，本發(fā)明化合物(I-V)對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖作用(表l)，特別對肺癌、鼻咽癌和肝癌細(xì)胞具有很強的抑制作用，對婦科腫瘤細(xì)胞的增殖亦有較好的抑制作用。 表1本發(fā)明化合物對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用
細(xì)胞才朱抑制率(IC50, (xg/ml)
式I式n式m式IV式V
Hela子宮頸癌59. 385. 365. 390. 389. 8
SK0V-3卵巢癌80. 278, 672. 172. 380. 6
HEC-IB子宮內(nèi)膜癌225. 1220. 4336. 1325. 5223. 8
BGC-823胃癌88. 375. 252. 682. 1112. 6
NCI-H460肺癌98. 3112. 587. 385. 2143. 8
L78肺癌10. 825. 612. 431. 522. 5
CNE鼻咽癌22. 628. 434. 636. 529. 3
Bel-7402肝癌52. 143. 666. 844. 863. 2
Hep G2肝癌62. 872. 679. 480. 663. 1
9
權(quán)利要求
結(jié)構(gòu)式為式I、II、III、IV或V所示的羊毛甾烷型三萜化合物或其可藥用的鹽式I式II式III式IV式V。F2008101845885C0000011.tif,F2008101845885C0000012.tif,F2008101845885C0000013.tif,F2008101845885C0000021.tif,F2008101845885C0000022.tif
2. —種制備權(quán)利要求1所述的羊毛甾烷型三萜化合物方法，包括(1) 制備靈芝子菌絲體或子實體的乙醇提取物；(2) 將靈芝子菌絲體或子實體的乙醇提取物清膏用水分散后，用石油醚反復(fù)萃取，再用 乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯提取物；(3) 乙酸乙酯提取物上硅膠柱，以氯仿-丙酮(50 : 1)梯度洗脫，根據(jù)TLC示蹤，合并 三萜類成分，分成A、 B、 C、 D、 E、 F六個組；將B、 C、 D三組分別上凝膠S印hadex LH-20柱，以 甲醇洗脫，根據(jù)TLC示蹤合并得B-l 、 B-2、B-3， C-l 、 C_2、 C_3、 C_4、 C_5， D_l 、 D_2、D_3 ^^—部 分；B-3，C-2，D-3部分以半制備高效液相色譜儀進(jìn)一步分離；用pH值為3，由乙腈-水-甲 醇按照56 : 36 : 8的體積比組成的溶液分離B-3得到式I化合物；用pH值為3，由乙 腈-水-甲醇按照54 : 32 : 8的體積比組成的溶液分離C-2得到式II化合物；用pH值 為3，由乙腈-水-甲醇按照54 : 35 : 6的體積比組成 的溶液分離B-3得到式III化合 物；用pH值為3，由乙腈-水-甲醇按照55 : 35 : 12的體積比組成的溶液分離D_3得到 式IV化合物；用pH值為3，由乙腈-水-甲醇按照56 : 36 : 8的體積比組成的溶液分離 D-3得到式V化合物。
3. —種抗腫瘤藥物組合物，由有效量的權(quán)利要求1所述的羊毛甾烷型三萜化合物或其 可藥用的鹽和藥學(xué)上可接受的載體或輔料組成。
4. 權(quán)利要求1所述的羊毛甾烷型三萜化合物或其可藥用的鹽在制備抗腫瘤藥物中的 用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了具抗腫瘤活性的羊毛甾烷型三萜化合物及其制備方法和應(yīng)用。其制備方法包括制備靈芝子菌絲體或子實體的乙醇提取物；將靈芝子菌絲體或子實體的乙醇提取物清膏以水分散后，用石油醚反復(fù)萃取，再用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯提取物；將乙酸乙酯提取物通過正相、反相以及凝膠柱層析反復(fù)分離得到三部分；用制備高效液相色譜，分別以乙腈-甲醇-水體系洗脫，收集相應(yīng)組分后，減壓蒸干后即得。本發(fā)明從靈芝子實體或發(fā)酵菌絲體中分離得到5種新的羊毛甾烷衍生物，經(jīng)生物活性評價，本發(fā)明新分離的5種羊毛甾烷衍生物能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，具有優(yōu)秀的抗腫瘤活性，在臨床上可作為腫瘤劑應(yīng)用。
文檔編號C07J9/00GK101747400SQ200810184588
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
發(fā)明者李園園, 湯亞杰 申請人:湖北工業(yè)大學(xué)